Введение к работе
Актуальность темы. Хантавирусы, принадлежащие к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae, широко распространены во многих регионах мира и являются возбудителями двух клинически различных форм заболевания человека: геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в Евразии и хантавирусного легочного синдрома в Северной и Южной Америке (Schmaljohn & Hjelle, 1997). Вирусы Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Dobrava-Belgrade (DOBV) и Seoul (SEOV) вызывают ежегодно до 110 000 случаев ГЛПС различной тяжести в Евразии (Lee et al., 1990; Zhang et al., 2010). ГЛПС занимает одно из первых мест среди природно-очаговых заболеваний человека в России со средней ежегодной регистраций ~7600 случаев. Инактивированные вакцины для профилактики ГЛПС выпускают и успешно используют только в двух странах - Китае и Корее (Schmaljohn, 2009), в России разрешенные к применению вакцины против ГЛПС отсутствуют (Ткаченко и др., 2009).
Природным резервуаром хантавирусов являются грызуны отряда Rodentia, причем каждый хантавирус ассоциирован с одним или несколькими близкородственными видами (Lee, 1982; Plyusnin & Morzunov, 2001). В течение последних лет были получены убедительные доказательства того, что природными носителями хантавирусов являются не только грызуны, но и насекомоядные отряда Soricimorpha (Song et al., 2007; Kang et al., 2009). Распространение хантавирусов в популяциях насекомоядных носителей и возможность инфицирования этими вирусами человека остаются важными нерешенными задачами.
Хантавирусы имеют одноцепочечный сегментированный РНК геном отрицательной полярности, состоящий из большого, среднего и малого сегментов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, предшественник двух оболочечных гликопротеинов и нуклеокапсидный белок, соответственно. Одним из критериев дифференциации видов хантавирусов является уровень различия в последовательностях среднего и малого сегментов вирусного генома: свыше 21% нуклеотидных и 7% аминокислотных различий (Nichol et al., 2005).
В настоящее время в международном комитете по таксономии вирусов зарегистрированы 23 иммунологически и генетически отличающихся друг от друга вида хантавирусов и их число продолжает увеличиваться (Nichol et al., 2005; Vaheri, 2008). Трудности изоляции штаммов хантавирусов привели к тому, что ряд новых генетически значительно отличающихся хантавирусов был идентифицирован на основании анализа фрагментов их геномов (Klempa et al., 2007; Song et al., 2009). В литературе до выделения штаммов и их иммунологического анализа генетически отличающиеся хантавирусы называют генетическими типами, а отличающиеся группы внутри каждого генетического типа - генетическими вариантами (Gu et al., 2011; Kang et al., 2009; Mir, 2010).
Показано, что основным возбудителем ГЛПС на территории Европейской части России является вирус PUUV, циркулирующий в популяциях рыжих полевок, и 3% случаев ГЛПС ассоциированы с вирусом DOBV, носителями которого являются два вида мышей рода Apodemus: A. agrarius и A. ponticus (Ткаченко и др., 2005; Klempa et al., 2008). В популяциях полевок рода Microtus (M. arvalis и M. rossiaemeridionalis) обнаружена циркуляция вируса Tula (TULV), для которого накапливается все больше данных о его патогенности для человека (Mertens et al., 2011). К началу нашего исследования наименее изученным регионом была азиатская часть, на территории которой сведения о составе хантавирусов, их распространении и многообразии их естественных хозяев были ограничены. На основе иммунологического анализа вирусных штаммов в Приморском и Хабаровском краях у больных ГЛПС были выявлены вирусы HTNV и SEOV (Астахова и др., 1990; Иванов и др., 1990). Генетический анализ циркулирующих в регионе хантавирусов был ограничен одним видом носителей - дальневосточной полевкой (Microtus fortis), в популяциях которой были обнаружены два хантавируса с неустановленной патогенностью для человека - Khabarovsk (KHAV) и Vladivostok (VLAV) (Horling et al., 1996; Kariwa et al., 1999). В Сибири данные о циркулирующих типах хантавирусов были получены для ограниченной части территории: зоне тундры, Омской и Тюменской областей, где в популяциях грызунов выявлены вирусы PUUV, DOBV, TULV и Topografov (TOPV) (Якименко и др., 2008; Dekonenko et al., 2003; Vapalahti et al., 1999).
Состав генетических типов хантавирусов, циркулирующих в популяциях мелких млекопитающих на обширной территории Сибири и Дальнего Востока России, был изучен совершенно недостаточно. Вместе с тем, данные о типовом составе хантавирусов, циркулирующих на определенной территории, и их природных резервуарах имеют важное значение при разработке научно обоснованной стратегии борьбы с хантавирусной инфекцией.
Цели, задачи и методы исследования. Целью настоящей работы было комплексное молекулярно-генетическое исследование хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.
-
Установить типы хантавирусов - возбудителей ГЛПС в очагах Дальнего Востока России и выявить виды носителей - природных источников ГЛПС.
-
Определить географическое распространение и видовой состав зараженных хантавирусами мелких грызунов на территории 12 административных регионов азиатской части России.
-
На основании генетической идентификации вируссодержащих образцов от мышевидных грызунов определить состав циркулирующих хантавирусов.
-
Исследовать циркуляцию хантавирусов среди новых видов природных носителей - насекомоядных.
Для выявления и идентификации хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России использовали набор молекулярно- генетических методов анализа. Выбранный подход включал выделение и генотипирование новых РНК изолятов, изучение вариабельности генома выявленных генетических типов, определение видов мелких млекопитающих - носителей хантавирусов и поиск новых очагов хантавирусной инфекции. В очагах Дальнего Востока России исследованы типы патогенных хантавирусов, обусловивших заболеваемость людей ГЛПС. Данные о составе генетических типов хантавирусов, распространенных в Сибири и на Дальнем Востоке России, были получены на основании анализа первичных вируссодержащих образцов крови больных ГЛПС и тканей легких животных. Этот подход значительно расширил возможности выявления новых хантавирусов, циркулирующих среди грызунов и насекомоядных, без их адаптации к росту в культуре клеток Vero E6, требующей значительного времени и не увенчавшейся успехом для большинства вирусов насекомоядных.
Для решения поставленных задач нами был разработан новый вариант анализа вирусного генома методом многолокусного ОТ-ПЦР, позволяющий выявить и идентифицировать как ранее известные виды хантавирусов, так и новые генетические типы. Образцы крови больных ГЛПС и тканей легких мелких млекопитающих - природных носителей вируса были протестированы на присутствие антител к хантавирусам и/или вирусного антигена и использованы для последующего анализа методом обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием 12 серий праймеров для анализа вирусного генома и анализа митохондриальной ДНК носителей вируса. Обнаружение специфических антител в сыворотках крови больных ГЛПС и мелких млекопитающих осуществляли с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА), для выявления антигена в тканях легких грызунов применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА). Генетическая идентификация хантавирусов и их природных носителей была основана на определении и анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов трех сегментов вирусных геномов и фрагментов митохондриальной ДНК носителей, и их последующем сравнении с ранее опубликованными последовательностями из базы данных GenBank. Для построения филогенетических деревьев использованы методы ближайших соседей, минимума эволюции и максимального правдоподобия в программах MEGA (версии 4.1) и PAUP 4.0b10 (Stamatakis et al., 2008; Swoffold, 2003; Tamura et al., 2007). Соответствие топологий получаемых филогенетических деревьев проверяли двумя или тремя методами.
Размеры и позиции полученных фрагментов (за вычетом праймеров) составили: для M-сегмента фрагмент длиной 244 н.о. (позиции 2737 - 2980); для L-сегмента - 336 н.о. (175-511), либо 352 н.о. (2988-3339); для S-сегмента - 210 н.о. (395 - 604), либо 837 н.о. (407-1243), либо 1200 н.о. (1-1200).
При выполнении исследований были использованы образцы (n=10681) тканей легких и крови мелких млекопитающих, собранные в ходе 23 экспедиций на территории Дальнего Востока России и Сибири, образцы крови больных ГЛПС (n=194) из очагов Дальнего Востока и Республики Башкортостан, а также образцы (n=211) легких грызунов из коллекций Хабаровской противочумной станции, НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока и г. Иркутска.
Научная новизна и практическая ценность
Впервые, с помощью молекулярно-генетических методов исследования образцов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих - носителей хантавирусов получены новые данные о природных резервуарах и составе генетических типов хантавирусов, распространенных в различных ландшафтных зонах 12 административных регионов азиатской части России, включая Тюменскую, Томскую, Кемеровскую, Новосибирскую, Иркутскую области, Республику Алтай, Алтайский, Красноярский, Приморский и Хабаровский края, Амурскую и Еврейскую автономную области, о которых до наших исследований имелись фрагментарные сведения.
Впервые среди мелких млекопитающих на территории Азиатской части России установлено распространение 9 генетических типов хантавирусов, носителями которых в очагах Сибири являются не только мышевидные грызуны, но насекомоядные. Выявлены ранее неизвестные природные очаги хантавирусов на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев, Республики Алтай.
Генетическое разнообразие хантавирусов, циркулирующих на территории Сибири и Дальнего Востока, представлено новыми генетическими типами Амур (AMRV) и Алтай (ALTV), получившими свое название по месту их выделения, новыми вариантами известных широко распространенных хантавирусов HTNV, SEOV, PUUV, KHAV, VLAV и недавно выявленных хантавирусов Hokkaido (HOKV) и Seewis (SWSV). Впервые получены доказательства, что природным хозяином генетического типа Амур является восточноазиатская мышь (Apodemus peninsulae), для выявленного в Сибири генетического типа Алтай - обыкновенная бурозубка (Sorex araneus).
Впервые, на основании анализа геномов РНК изолятов хантавирусов от больных ГЛПС, показано, что популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV (FE) и SEOV (VDV).
Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России показана циркуляция вируса HOKV, ранее обнаруженного в Японии. Природным носителем вируса HOKV на Дальнем Востоке России является красно-серая полевка (Myodes rufocanus). Впервые установлено, что в Сибири резервуарами вируса являются два вида полевок рода Myodes: M. rutilus и M. rufocanus.
На территории Сибири впервые установлена циркуляция вируса SWSV, ранее обнаруженного в обыкновенной землеройке (S. araneus) в Швейцарии. Впервые показано, что резервуарами вируса являются три близкородственных вида землероек рода Sores: S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon.
Выявлено 11 новых очагов циркуляции хантавирусов среди полевок M. glareolus, M. rutilus, M. rufocanus, M. oeconomus, M. agrestis, M. gregalis, степных пеструшек Lagurus lagurus, мышей A. agrarius и A. peninsulae на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев и Республики Алтай.
Фундаментальные данные о разнообразии генетических типов хантавирусов, обнаруженных в очагах Сибири и Дальнего Востока, могут быть использованы при уточнении классификации и таксономии хантавирусов. Установленные нуклеотидные последовательности новых РНК изолятов хантавирусов депонированы в базу данных GenBank.
Полученные новые знания являются основой дальнейших исследований роли новых генетических типов в патологии человека, необходимости их использования при разработке вакцин против ГЛПС и создании новых диагностических препаратов.
На основе полученных данных в ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с ЗАО «Вектор-Бест» была разработана первая в России тест-система «Векто Ханта- РНК-ампли», использующая метод ОТ-ПЦР для выявления вирусной РНК в образцах крови больных ГЛПС и органах грызунов - носителей патогенных вирусов. Тест-система предназначена для научных исследований и использовалась для ранней диагностики и оценки эффективности противовирусной терапии, оценки эпизоотической активности природных очагов ГЛПС и исследования путей передачи вируса между природными носителями (Кушнарева и др., 2005а, 2005в, 2006; Кушнарева и Слонова, 2008; Образцов и др., 2008).
Положения, выносимые на защиту
Используя технологию выявления и идентификации хантавирусов у больных ГЛПС и мелких млекопитающих, получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.
На исследованной территории Азиатской части России циркулирует 9 генетических типов хантавирусов;
Популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV и SEOV. Носителем нового генетического типа Амур является восточно- азиатская лесная мышь (A. peninsulae)',
Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России в красно-серых полевках (M. rufocanus) показана циркуляция вируса HOKV, на территории Сибири
резервуаром вируса HOKV являются два вида полевок рода Myodes: M. rutilus и M rufocanus;
В очагах Дальнего Востока циркулируют вирусы KHAV и VLAV, причем каждый из вирусов ассоциирован со своим носителем, полевками Microtus maximowiczii и М. fortis, соответственно;
Носителями хантавирусов на территории Сибири являются не только грызуны, но и насекомоядные. В обыкновенной бурозубке (S. araneus) выявлен ранее неизвестный генетический тип Алтай (ALTV), а в средней бурозубке (S. caecutiens) циркулирует новый генетический вариант вируса Lena (LENV), открытого в том же виде бурозубок в Республике Саха. Кроме того, в географически удаленных точках Сибири в трех близкородственных видах бурозубок S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon циркулирует вирус SWSV.
Апробация результатов диссертации и публикации. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации были представлены в докладах и постерных сообщениях на 12 международных и 6 российских научных конференциях: "The Fourth International Conference on HFRS and Hantaviruses" (Атланта, США, 1998); "Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millenium" (Новосибирск, 1999); "2nd Croatian Congress on Infectious Diseases" (Дубровник, Хорватия, 2000); "The Fifth International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses" (Анси, Франция, 2001); 2-й и 3-й научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002, 2006); II объединенной сессии СОРАН и СОРАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002); "Ecology of Infectious Diseases" (Новосибирск, 2002); «Хантавирусы, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом» (Владивосток, 2003); "The 6th International Conference on Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS), Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) and Hantaviruses" (Сеул, Корея, 2004); «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004); "The VII International Conference on Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS), Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) and Hantaviruses" (Буэнос-Айрэс, Аргентина, 2007); III Всероссийской научной конференции "Биология насекомоядных млекопитающих" (Новосибирск, 2007); "XIV International Congress of Virology" (Стамбул, Турция, 2008); "19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases" (Хельсинки, Финляндия, 2009); «Борьба с глобальными инфекциями» (Иркутск, 2009); «Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (Москва, 2009); "The VIII International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses" (Афины, Греция, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 50 работ, включая 15 статей, из которых 10 опубликованы в журналах списка, рекомендованного ВАК, главу монографии, медико-географический атлас, патент Российской Федерации, 32 тезиса в сборниках конференций.
Вклад автора в диссертационную работу. Исследования, включенные в работу, выполнены лично автором, под руководством автора и в соавторстве с коллегами из 12 научных учреждений России и США. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, выполнении основных экспериментов и обобщении полученных результатов.
Автор искренне признательна и благодарна коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: Слоновой Р.А., Компанец Г.Г. и Кушнаревой Т.В. из НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока (разделы 1-5); Иванову Л.И., Здановской Н.И., Пуховской Н.М. и Высочиной Н.П. из ФГУЗ Хабаровская противочумная станция (разделы 1-5); Абрамову С.А., Дупал Т.А., Ковалевой В.Ю., Кривопалову А.В., Панову В.В., Позднякову А.А., Петровскому Д.В. из Института систематики и экологии животных СО РАН г. Новосибирска (разделы 3-4, 6); Данчиновой Г.А., Чапоргиной Е.А. и Тимошенко А.Ф. из Института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Иркутска (разделы 4, 6); Хасановой С.С. из ГУП «Иммунопрепарат» г. Уфы (раздел 1); В.В. Виноградову из Красноярского государственного университета и Лучниковой Е.М. из Кемеровского государственного университета (раздел 6); Морзунову С.П. из университета Невада (Рино, США) (раздел 4). За плодотворное сотрудничество автор благодарит коллег из ГНЦ ВБ «Вектор» Кузину И.И. (разделы 1-2), Гуторова В.В. (разделы 2-6), Горбунова Ю.А. (разделы 1-5), Сафронова П.Ф. (раздел 1), Чижикова В.Е. (раздел 1), Мишина В.П. (раздел 2), Малышеву Т.В. (разделы 1-2, 4-5), Олейник О.В. (раздел 4), Патрушева Н.А. (раздел 1), Протопопову Е.В. (раздел 3), Тучину Н.В. (раздел 6), Якименко Н.В. (раздел 2), Серегина С.В. (разделы 4-5), Перминову Н.Г. (раздел 3).
За сотрудничество в работе автор признательна своим американским коллегам Dr. C. Schmaljohn из USAMRIID, США; Dr. S. Nichol из CDC, США; Dr. R. Yanagihara из университета Гавайи (Маноа, США); Dr. J. Hay из
университета Нью-Йорк (Буффало, США).
Автор искренне благодарна академику РАН, профессору |Сандахчиеву
Л.С.|, члену-корреспонденту РАН, профессору Нетесову С.В., профессору Малыгину Э.Г. и Мартынюк Р.А. за активную поддержку данной работы.
Работа выполнена в 1995-2010 годах во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научных тем организации, по гранту государственной программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел «Защита от патогенов», в рамках научной школы НШ- 65387.2010.4, по грантам Международного научно-технического центра (МНТЦ) № 805-97 и № 0805.2 «Изучение генетического и антигенного многообразия хантавирусов, циркулирующих на территории Азиатской части России», выполненным в сотрудничестве с Хабаровской противочумной станцией, НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока и г. Иркутска, Институтом систематики и экологии животных СО РАН г. Новосибирска.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов, шести глав экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (508 ссылок). Работа изложена на 293 страницах, включая 43 рисунка и 50 таблиц.
