Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды 9
1.2. Классификация и функции БТШ 11
1.3. Структура и эволюция генов ТШ 20
1.4. Экспрессия генов ТШ и ее регуляция 27
1.5. Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям 38
1.6. БТШ в медицине 42
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Геномная фаговая библиотека 46
2.1.2. Насекомые, условия обитания и теплового шока 46
2.1.3. Штаммы E. coli 46
2.1.4. Ферменты рестрикции 46
2.1.5. Зонды 47
2.1.6. Линии эукариотических клеток, условия культивирования и ТШ 47
2.2. Методы: 47
2.2.1. Скрининг геномной фаговой библиотеки 47
2.2.2. Выделение ДНК бактериофага 48
2.2.3. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 48
2.2.4. Электрофорез ДНК 48
2.2.5. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 49
2.2.6. Включение радиоактивной метки в ДНК 49
2.2.7. Перенос и гибридизация по Саузерну 49
2.2.8. ПЦР-анализ 50
2.2.9. Выделение фрагментов ДНК из геля 50
2.2.10. Клонирование фрагментов ДНК 51
2.2.11. Трансформация компетентных клеток 51
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК 51
2.2.13. Секвенирование ДНК 52
2.2.14. Анализ последовательностей 52
2.2.15. Выделение фракции лимфоцитов из крови верблюда 52
2.2.16. Выделение тотальной РНК 52
2.2.17. 5 - и 3 -RACE анализ и ПЦР с обратной транскрипцией 53
2.2.18. Электрофорез РНК 53
2.2.19. Нозерн-гибридизация 53
2.2.20. Двумерный электрофорез белков по О Фарреллу 54
2.2.21. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей по Кумасси G-250 54
2.2.22. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга 55
2.2.23. Экспрессия и очистка белка GAF 55
2.2.24. Получение белковых экстрактов 56
2.2.25. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA) 56
2.2.26. Получение репортерных конструкций 56
2.2.27. Трансфекция плазмид и измерение интенсивности люминесценции 57
Глава 3. Результаты исследования 58
3.1. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp70A1 у верблюда Camelus dromedarius 58
3.2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hsp1A, hspA1B и hspA1L 62
3.3. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina 64
3.4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japonica 79
3.5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina 70
3.6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов группы hspA1 верблюда и других видов млекопитающих 72
3.7. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культуре клеток HEK293 74
3.8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina 77
3.9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider2 81
3.10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3 82
3.11. Сравнение активности промоторов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2 84
Глава 4. Обсуждение результатов 86
Выводы 90
Список литературы 91
- Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям
- Линии эукариотических клеток, условия культивирования и ТШ
- Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга
- Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina
Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям
Общепринятой является классификация БТШ по их молекулярной массе. Это обосновано тем, что электрофоретические фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Каждое семейство БТШ является продуктом группы родственных генов, поэтому степень гомологии между отдельными представителями семейства часто весьма высока. Многие члены БТШ консервативны, однако их спектр значительно варьирует в зависимости от вида организма и от действующего фактора (Маргулис, 2000). На данный момент выделяют следующие семейства БТШ: низкомолекулярные БТШ (нмБТШ), семейство БТШ40, БТШ60, БТШ70 – самое многочисленное семейство, БТШ90, БТШ100 (Lindquist, 1986).
К нмБТШ относят БТШ с молекулярной массой от 12 до 43 кДа, -А- и -В-кристаллины. Гомология между белками этой группы составляет около 40%. Они имеют консервативный -кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 а.о. в С-концевой области, образующих 9 -складчатых структур (Hu, 2007). На N-конце многих нмБТШ найден консервативный SRLFDQFFG-регион, играющий большую роль в стабильности структуры - и -кристаллинов (Pasta, 2003). Взаимодействуя своими -складчатыми структурами, нмБТШ способны образовывать с соседними мономерами гомо- и гетероолигомерные комплексы с молекулярными массами 200-400 кДа, обладающие шаперонной активностью (Ganea, 2001). При повышении температуры эти комплексы диссоциируют и в виде димеров нмБТШ взаимодействуют с денатурированными белками, образуя массивные гранулы. При этом они экранируют гидрофобные участки денатурированных белков, препятствуя их от агрегации, и передают их БТШ70 (Гусев, 2002). Основной функцией нмБТШ считается стабилизация поврежденного стрессом актинового цитоскелета фосфорилированной формой белка БТШ27 (Гусев, 2002). Благодаря своей способности образовывать массивные мультимерные структуры -кристаллины формируют основу хрусталика глаза (Horwitz, 1976). Для нмБТШ характерен высокий уровень экспрессии на определенных стадиях развития и в определенных тканях (Гусев, 2002).
Конститутивно повышенный уровень синтеза нмБТШ защищает клетки от TNF-индуцированного апоптоза и окислительного стресса. Кроме того, нмБТШ способны блокировать апоптоз, индуцированный другими путями, как, например, активацией рецепторов клеточной поверхности FAS/APO-1, являющихся медиаторами апоптоза, так и ингибитором протеинкиназы С – стауроспорином (Mehlen, 1996). Считается, что основная защитная роль принадлежит БТШ22, БТШ23, БТШ26 и БТШ27. Эти белки локализованы внутри клетки следующим образом: БТШ22 – в митохондриях, БТШ23 и БТШ26 – в цитозоле, БТШ27 – в ядрах (Маргулис, 2000).
БТШ40 относят к семейству так называемых J – белков, благодаря гомологии с белком E. coli DnaJ (Kelley, 1998). Характерной особенностью этой группы является наличие N-концевого J–домена, построенного из четырех -спиралей и содержащего консервативный трипептид HPD (Frydman, 2001). С-концевым шаперонным доменом БТШ40 могут связываться с денатурированными белками, предотвращая их агрегацию (Kampinga, 2010; Mayer, 2010). Кроме того, эти белки являются кошаперонами БТШ70, связываясь с ними посредством N-концевого J–домена. БТШ40 стимулирует АТФазную активность БТШ70 и стабилизирует его комплекс с субстратом (Chun-Yang, 2003). Различные представители семейства J-белков функционируют в цитозоле, эндоплазматической сети и митохондриях, выступая кофакторами для цитозольных БТШ70 и HSC70, эндоплазматического HSPA5/BiP и митохондриального HSPA9/GRP75 (Christis, 2008). У человека семейство БТШ40 представлено 44 белками (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/). У D. melanogaster на сегодня обнаруживаются 5 белков, имеющих в своем составе J-домен, по мере дальнейшего анализа информации, имеющейся в геномных базах данных, это число может увеличиться.
Семейство БТШ60 Это семейство стрессовых белков выделяют в отдельную группу шаперонинов. Шаперонины в отличие от шаперонов формируют сложные структуры в виде стопки из двух колец, каждое из которых состоит из семи мономеров массой 60кДа (Horwich, 2006). В центре кольца между мономерами имеется внутренняя пора, в которой происходит фолдинг белков. В аминокислотной последовательности каждого из мономеров присутствует несколько остатков гидрофобных аминокислот, обращённых внутрь поры. С этими гидрофобными остатками взаимодействуют белки-субстраты, фолдинг которых требует гидролиза АТФ.
Шаперонины делятся на две группы. К первой относятся белки-гомологи бактериальных БТШ60 и БТШ10, обозначающихся как GroEL и GroES соответственно. GroES выступает в роли кофактора для GroEL. У человека охарактеризованы два белка (гомолог GroEL и HSPE - гомолог GroES), кодируемых единичными генми HSPD, которые функционируют в митохондриях. Белки, относящиеся ко второй группе, обозначаются как CCT или TRiC, функционируют в цитозоле эукариот (а также у архей) и формируют олигомеры из 8-и субъединиц, каждая из которых кодируется собственным геном. Они имеют 30% гомологию друг с другом и 15 – 20% гомологию с GroEL, что говорит об их общем эволюционном происхождении (Brackley, 2009). Тогда как система GroEL-GroES работает у бактерий и в митохондриях, CCT обнаружен у архей и в цитозоле эукариот. У последних он участвует в фолдинге основных компонентов цитоскелета, актина и тубулина, а также некоторых белков, участвующих в регуляции клеточного цикла (Brackley, 2009). Для взаимодействия белков-субстратов с ССТ необходимо их предварительное взаимодействие с белком-переносчиком, получившим название префолдин, который маркирует субстраты ССТ (Vainberg, 1998). В отличие от GroEL, CCT не имеет кофакторов, подобных GroES. Закрытие центральной полости, формируемой октамером CCT, происходит за счет изменения конформации апикальных частей субъединиц самого CCT (Mayer, 2010).
Это семейство является главным элементом защитного аппарата клетки. Молекула БТШ70 состоит из N-концевого консервативного домена молекулярной массой 44кДа, обладающего АТФ-связывающей и (в присутствии БТШ40) АТФ-азной активностью (Flaherty, 1990). C-концевой вариабельный домен является субстрат-связывающим участком и имеет молекулярную массу 18 кДа (Frydman, 2001). Этот домен состоит из двух -спиралей, узнающих гидрофобные области денатурированных белков. Субстрат-связывающий участок БТШ70 по структуре очень напоминает пептид-связывающий домен молекул MHC, в особенности MHC II, но характеризуется более «открытой» структурой, что позволяет ему взаимодействовать с более длинными полипептидами (Flajnik, 1991). Было высказано предположение, что гены MHC дивергировали из генов БТШ70 на ранних этапах эволюции позвоночных. N- и C-домены разделены короткой последовательностью, в которой расположен сайт узнавания белка протеолитическими ферментами (Маргулис, 2000).
Семейство БТШ70 включает в себя множество членов, выполняющих различную роль в отдельных клеточных компартментах. В клетке млекопитающих в цитозоле обнаружены белки БТШ68, БТШ72, БТШ73, а также конститутивный БТШ70 (HSC70) (Morimoto, 1990); в митохондриях постоянно присутствует гомолог БТШ70 – Grp75 (glucose-regulated protein 75); в ЭР – Grp78, или BiP (белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов, Immunoglobulin heavy chain binding protein); а в лизосомах – конститутивный Hsc73 (Terlecky, 1992). В бактериях имеется всего один ген семейства БТШ70, кодирующий белок массой 69,1 кДа – DnaK (Ульмасов, 1993). Впервые подробно изучено было взаимодействие шаперонов семейства БТШ70 с субстратом на DnaK. Пептид-связывающий сайт содержит впадину, в которой и происходит связывание полипептида в неправильной конформации. БТШ70 узнает линейные полипептидные последовательности, богатые гидрофобными аминокислотами, которые в норме должны находиться внутри белковой глобулы (Frydman, 2001).
Весь процесс носит циклический характер. DnaK, находясь в АТФ-связанной форме, взаимодействует с белком-субстратом. Потом с DnaK связывается белок DnaJ, стимулирующий гидролиз АТФ и стабилизирующий комплекс DnaK-субстрат. Сродство DnaK к продукту реакции – АДФ – выше, чем к АТФ, поэтому для диссоциации АДФ требуется фактор обмена нуклеотидов. У E. coli им является белок, называемый GrpE. После диссоциации комплекса DnaK-АДФ происходит высвобождение субстрата и присоединение новой молекулы АТФ. Как правило, фолдинг белков с участием DnaK и БТШ70 требует нескольких циклов присоединения – диссоциации с гидролизом АТФ. Некоторые белки приобретают с участием DnaK или БТШ70 только промежуточную конформацию и для формирования конечной структуры они должны провзаимодействовать с другими БТШ (Houry, 2001).
Линии эукариотических клеток, условия культивирования и ТШ
Пути адаптации организмов очень индивидуальны и зависят от условий и образа жизни. Некоторые виды (особенно на стадии имаго) могут практически не подвергаться тепловому шоку за счёт реакций избегания, находя прохладные укрытия в жаркое время суток. Другие виды не подвергаются ТШ благодаря обитанию в биотопах со стабильными условиями. Температурный порог индукции БТШ и критическая температура индукции БТШ зависят от температуры среды обитания (Ulmasov, 1992, 1993; Tomanek, 2008). Это подтверждает идею о роли БТШ в эволюции адаптации естественных популяции и доказывает необходимость исследований ответа на ТШ в природных условиях. Особенно интересно изучение адаптивной роли БТШ70 в зависимости от мест обитания родственных организмов.
Адаптация к температурным воздействиям в значительной степени зависит от обитания в наземной или водной среде. Наиболее часто температурному стрессу подвергаются виды или организмы на определённой стадии развития, не способные к поведенческой терморегуляции: организмы, обитающие в стоячей воде (прудах, заливах, болотах), сидячие организмы на приливно-отливной зоне и т.п. Виды, обитающие в стабильных условиях при низких температурах и в течение миллионов лет не сталкивающиеся с температурными колебаниями, могут утрачивать способность к индукции БТШ при повышении температуры. Конститутивный синтез БТШ у ряда обитателей холодных вод предположительно связан с постоянно повышенной концентрацией денатурированных холодом белков (Place, 2004).
Наибольший интерес в этом направлении исследований представляет изучение возможной адаптивной роли индуцибельного БТШ70 и эволюции этого семейства белков в зависимости от мест обитания близкородственных организмов. Такой подход позволяет изучать не только физиологические функции, но дает возможность выявить экологическую и эволюционную роль БТШ в адаптации. Впервые такого типа исследования были начаты группой М.Б. Евгеньева: изучалась экспрессии БТШ в культурах клеток двух видов шелкопряда (тутового (Bombyx mori) и непарного (Lymantria dispar)), отличающихся по происхождению (Евгеньев, 1987).
Дальнейшие сравнительные исследования в этой области проводились на лейшманиях (Ульмасов, 1988), ящерицах (Ulmasov, 1992), муравьях (Gehring, 1995), а также обитателях приливно-отливной зоны: на улитках (Tomanek, 2008), мидиях (Buckley, 2001), ракообразных (Stillman, 1996; Stillman, 2000), моллюсках (Dong, 2008) и рыбах (Buckley, 2006; Podrabsky, 2007).
Все эти исследования позволяют предположить, что характер ответа на ТШ на уровне генов hsp определяется адаптивной историей вида или даже более крупной таксономической единицы. Например, холодолюбивые виды синтезируют Hsp70 при более низких температурах, чем эволюционно близкие им термоадаптированные (Buckley, 2001). Кроме того, уровень индукции БТШ для видов, взятых непосредственно из природных условий, зависит от сезона года (Buckley, 2002; Dong, 2008; Tomanek, 2008). Примечательно, что виды, с более высоким конститутивным синтезом Hsp70, развиваются медленнее, чем близкие виды, с индуцибельным характером экспрессии hsp70. Это согласуется с известными для Drosophila нарушениями развития при высоком уровне синтеза Hsp70 в нормальных условиях (Krebs, 1998).
Виды, в течение суток подвергающиеся резким температурным перепадам (максимальный нагрев близок к критической температуре обитания), конститутивно синтезируют Hsp70 (Dong, 2008). Этот же вывод был сделан еще в 1992 г. Ульмасовым и Евгеньевым при изучении ящериц, обитающих в пустыне Туркменистана с резко континентальным климатом. При исследовании 9 видов ящериц была найдена положительная корреляция между конститутивным уровнем синтеза Hsp70 и термоустойчивостью (Ulmasov, 1992). Сравнение уровня синтеза Hsp70 показало, что пустынные ящерицы, активные в дневное время, характеризуются заметным уровнем Hsp70 при нормальной температуре. У пустынных ночных ящериц уровень Hsp70 при нормальной температуре значительно ниже, а у видов ящериц средней полосы Hsp70 в клетках в норме почти полностью отсутствует. Более высокая термоустойчивость южных видов ящериц по сравнению с северными видами, вероятно, во многом обусловлена высоким уровнем конститутивного синтеза семейства белков Hsp70 у южных видов в нормальных условиях.
Большое количество исследовании по термальной адаптации было проведено на разных видах и географических линиях Drosophila. Виды Drosophila характеризуются широким географическим распространением, заселяя климатические зоны от приполярных (D. lummei) до тропических (D. melanogaster, D. virilis) (Heino, 1989) и пустынных (D. mojavensis) (Stratman, 1998). Кроме того, один и тот же вид может быть распространен в областях значительно различающихся по географической широте и соответствующим климатическим режимам. В зависимости от места обитания, линии одного и того же вида могут различаться по термоустойчивости, устойчивости к засухе и др. (Arthur, 2008; Hoffmann, 2007).
В природных условиях популяция D. melanogaster может существовать при температуре не выше 29С, хотя индивидуально личинки и имаго способны переносить кратковременную гипертермию до 39С. Исследования М. Федера (Feder, 1997) показали, что в природных условиях имаго практически не подвергаются тепловому шоку, благодаря реакциям избегания и способности находить прохладные укрытия. Наоборот, личинки, развивающиеся в субстрате (гниющие плоды), не способны менять местоположение и могут подвергаться интенсивному температурному стрессу (Feder, 1997). У Drosophila Hsp70 полностью отсутствует в клетках при нормальных условиях и при тепловом шоке происходит накопление Hsp70 практически до 1% от общего количества белка, и максимум накопления наблюдается через 6 часов после ТШ, после чего уровень синтеза резко падает, и начинается быстрая деградация Hsp70.
В последнее время были проведены серии работ по изучению регуляции и динамики индукции Hsp70 у ряда видов, относящимся к семейству Stratiomyidae. Это семейство отличается необычайно широким диапазоном условий, в которых происходит развитие личинок, среди которых обнаружено большое количество экстремофилов. Личинки большинства видов Stratiomyidae ведут полуводный образ жизни (Stratiomys, Odontomyia, Oxycera), некоторые обитают во влажном грунте, под корой деревьев или в муравейниках, как сапрофаги (Pachygastrinae, Clitellaria), некоторые являются условными саркофагами (Hermetia). Личиночные стадии многих видов адаптированы к действию различных неблагоприятных факторов, в частности высокой температуры и минерализации вплоть до насыщающих концентраций солей (Brammer, 2007). При этом в ходе развития они подвергаются действию как постоянных, так и переменных факторов (например, конститутивно высокие температуры в геотермальных источниках или переменная соленость и значительные суточные колебания температур в частично пересыхающих соленых озерах). Например, вид S. japonica, обитающий на Дальнем Востоке в Японии и на Курильских островах, развивается в вулканических термальных источниках в диапазоне температур 30 – 40С при концентрациях кремниевой и борной кислот, достигающих соответственно 143 и 25 мг/л. S. singularior является широко распространенным транс-Палеарктическим видом. N. bipunctatus встречается только по побережью Черного моря в Крыму и в Турции. Кроме того, к семейству Stratiomyidae относится ряд видов, личиночное развитие которых происходит в стабильных условиях при отсутствии значительных стрессовых факторов (родники, пресноводные водоемы в зоне умеренного климата при годовых колебаниях температуры, не выходящих за пределы 4 – 10С). К таким видам относится Oxycera pardalina, развитие которого происходит в холодных слабоминерализованных источниках, собранный в Ленинградской области (Garbuz, 2008).
Оказалось, что несмотря на столь значительную разницу между средними температурами среды обитания, критические температуры для всех изучаемых видов отличаются не более чем на 5С и в случае S. japonica не зависят от температуры, при которой личинки находились перед тем, как подвергнуться ТШ. Это подтверждает закономерность, согласно которой холодолюбивые виды переносят гораздо более значительный подъем температуры относительно среднего значения температуры обитания, чем виды, постоянно живущие при более высоких температурах. У всех четырех видов семейства Stratiomyidae высокая концентрация Hsp70 была обнаружена как после теплового шока, так и при нормальной температуре (Garbuz, 2008). Конститутивно высокий уровень Hsp70 у Stratiomyidae характерен как для личинок, так и для имаго. После ТШ содержание БТШ70 у Stratiomyidae увеличивается незначительно: в четыре – пять раз у S. japonica, в три – четыре раза у S. singularior и N. bipunctatus и в два раза у O. pardalina, и у всех четырех видов достигает максимума через 48 ч.
Интересно, что у Stratiomyidae, а также мокрецов и слепней Hsp70, постоянно присутствующий в клетках, не оказывает негативного эффекта на развитие, как у Drosophila. Скорее всего, это объясняется существенной разницей во времени развития и общей физиологии Drosophila и других двукрылых. Продолжительность времени развития у видов семейства Stratiomyidae составляет 1 – 2 года (в зависимости от условий) с обязательной диапаузой, тогда как личиночное развитие D. melanogaster занимает несколько дней.
Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга
Промоторы генов hspA1A и hspA1B у C. dromedarius содержат канонический TATA-бокс, в то время как в промоторе hspA1L он отсутствует. В этом плане промоторы у верблюда не отличаются от других видов млекопитающих. С помощью программ MatInspector и MEME был проведен сравнительный анализ последовательностей промоторов генов группы hspA1 верблюда с промоторами ортологичных генов других видов млекопитающих (Bos taurus, Equus caballus, Sus scrofa, Homo sapiens, Canis familiaris, Pteropus vampyrus, и Tursiops truncatus), последовательности которых доступны в GenBank. На рис 10 показано расположение наиболее значимых регуляторных элементов (ТАТА-бокс, HSE, сайты связывания факторов NF-Y и Sp1), которые присутствуют в промоторах генов hspA1A и hspA1L у всех 8 рассмотренных видов. Кроме того, в составе промоторной области гена hspA1L человека и других приматов (Gorilla gorilla и Pan troglodytes) обнаруживается вставка длиной 100 п.о., содержащая два сайта узнавания гомеодомена, отсутствующая в промоторах генов hspA1L других видов млекопитающих. Высокая консервативность промоторных областей генов hsp70 характерна исключительно для позвоночных и не наблюдается у других описанных групп организмов, в частности у двукрылых (см. ниже). Тем не менее, на фоне общей высокой консервативности при сравнении регуляторных последовательностей генов hsp70 млекопитающих обнаруживаются ряд нуклеотидных замен, вставок и делеций, которые могут обусловливать разницу в активности промоторов у разных видов.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов hspA1A, и hspA1L C. dromedarius и других видов млекопитающих. Стрелочками показаны точки инициации транскрипции.
Активность промоторов генов группы hspA1 C. dromedarius и H. sapiens сравнивали с использованием ряда репортерных конструкций, в которых рамка считывания гена люциферазы находилась под контролем различных участков регуляторных областей генов hspA1A, hspA1B и hspA1L. Для исследования активности промоторов индуцируемого гена hspA1A были получены пять вариантов конструкций. Две конструкции под контролем промоторов hspA1A верблюда различаются между собой по длине 5 -нетранслируемой области (-413…+31 п.о. и -413…+192 п.о. относительно точки старта транскрипции), аналогичные две конструкции были получены для определения активности промотора гена hspA1A человека (-505…+25 п.о. и -505/+221, соответственно). В пятой конструкции в 5 -нетранслируемой области гена hspA1A верблюда преждевременный старт-кодон ATG был заменен на TTG для определения влияния преждевременного старт-кодона на экспрессию гена (рис. 11А). Результаты измерения уровня люминесценции в культуре клеток человека HEK293, трансформированных полученными конструкциями, свидетельствует о том, что активность промотора гена hspA1A C. dromedarius при нормальной температуре в 2.5 раза выше по сравнению с активностью промотора гена hspA1A человека. После теплового шока разница в активности промоторов обоих видов нивелировалась (рис. 11D). Замена преждевременного ATG-кодона практически не сказывалась на активности промотора гена hspA1A верблюда ни в нормальных условиях, ни после ТШ.
Для исследования активности промоторов индуцибельного гена hspA1B было получено по две пары конструкций под контролем промоторв человека и верблюда, отличающихся по длине 5 -нетранслируемой области (-738…+8 п.о. и -738…+195 п.о. относительно старта транскрипции для C. dromedarius и -733/+35 п.о. и -733...+206 п.о. для H. sapiens) (рис. 11B). По результатам измерения уровня экспрессии данных репортерных конструкций активность промоторов hspA1B человека и верблюда практически не отличалась ни в норме, ни при ТШ (рис. 11E). Уровень экспрессии генов hspA1A и hspA1B после ТШ как у человека, так и у верблюда повышался одинаково, в 5 - 6 раз.
Рис. 11. Анализ активности репортерных конструкций под контролем промоторов генов (A) hspA1A, (B) hspA1B, (C) hspA1L в норме (37оС – сontrol) и после ТШ (43,5С – Heat Shock). Значения даны в отношении уровня люминесценции люциферазы Photinus pyralis (pFF) к уровню люминесценции люциферазы Renilla reniformis (pRL), которая продуцируется вектором pGL-SV40, использованным для нормирования.
Для исследования активности промоторов конститутивного гена hspA1L была получена серия из семи конструкций (рис. 11С). Четыре из них, по аналогии с индуцибельными генами, включали в себя всю промоторную область между генами hspA1A и hspA1L, отличающуюся по длине 5 -UTR. Две конструкции имели делеции области, содержащей последовательности HSE, ответственные за индукцию транскрипции при тепловом шоке. Также была получена конструкция с делецией участка, содержащего сайты узнавания гомеодомена в промоторной области гена hspA1L H. sapiens. Результаты измерения уровня люминесценции в культуре клеток, трансформированных полученными конструкциями, свидетельствуют о том, что промотор гена hspA1L C. dromedarius проявляет в 5 раза более высокую активность как в нормальных условиях, так и при тепловом шоке, по сравнению с промотором гена hspA1L человека (рис. 11F). Индукции экспрессии конструкций под контролем промоторов гена hspA1L верблюда или человека при ТШ не происходит. Делеция фрагмента длиной 100 п.о., несущего сайты узнавания гомеодомена в промоторе гена hspA1L человека приводит к увеличению уровня транскрипции в 2 – 3 раза по сравнению с интактным промотором (рис. 11F).
Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina
Эволюционные изменения структуры и характера экспрессии генов, относящихся к семействам hsp70 и hsp90, представляют большой интерес в свете изучения механизмов адаптации организмов к тем или иным условиям окружающей среды. У большинства описанных на сегодня видов имеется тенденция к расположению генов hsp70 в виде кластера (Evgen ev, 2004). Строение кластера генов hsp70, выделяемых в группу hspA1, ранее было описано у нескольких видов млекопитающих, включая человека (Milner, 1992; Hunt, 1993). У всех исследованных в этом плане видов группа генов hspA1 расположена в локусе, несущем гены главного комплекса гистосовместимости. Кроме того, было показано, что в геноме лягушки Xenopus два или три гена hsp70 также колокализуются с генами MHC (Salter-Cid, 1994). В настоящей работе были клонированы и секвенированы гены группы hspA1 верблюда Camelus dromedarius, являещегося одним из наиболее устойчивых к различным неблагоприятным условиям среды видов млекопитающих. При сравнении уровня включения радиоактивной метки в БТШ70 на культурах клеток человека и верблюда было показано, что в клетках последнего БТШ70 экспрессируется на гораздо более высоком уровне. При этом клетки верблюда отличались более высокой термоустойчивостью и выживали при тепловом шоке, летальном для клеток человека (Ulmasov, 1993). В настоящей работе было показано, что у верблюда кластер генов, относящихся к группе hspA1, имеет в целом такое же строение, как и у других млекопитающих: два гена, hspA1A и hspA1B, не имеющие в своем составе интронов и характеризующиеся индуцируемым характером экспрессии, расположены в тандемной ориентации, тогда как третий ген, hspA1L, экспрессирующийся конститутивно, находится по отношению к ним в противоположном направлении (рис. 1). У всех описанных видов млекопитающих данный ген имеет один интрон и промотор, лишенный ТАТА-бокса, что характерно для многих конститутивно экспрессирующихся генов. Межвидовые различия, обнаруженные при сравнении структуры кластера генов группы hspA1 разных видов млекопитающих, ограничиваются небольшими изменениями в расстояниях между генами и длине интрона гена hspA1L (рис. 1). Промоторные области трех генов, входящих в состав кластера, у млекопитающих также высоко консервативны за исключением ряда замен, небольших вставок и делеций, и обладают характерным набором регуляторных элементов (рис. 7). При этом в других таксонах, в частности у различных видов насекомых из отряда Diptera, высокая степень консервативности присуща только кодирующим районам генов hsp70, тогда как регуляторные области и общая структура кластера (число генов и длина межгенных участков ДНК) высоковариабельны иногда даже в пределах одного вида. Так, высокая вариабельность по числу копий генов hsp70 была показана у разных географических линий видов Drosophila virilis и D. lummei, а также для разных популяций вида S. singularior (Evgen ev, 2004; Garbuz, 2011). Таким образом, эволюционные изменения структуры кластера генов hsp70 характеризуются различными тенденциями у разных таксонов. Несмотря на высокую в целом консервативность 5 -фланкирующих регуляторных областей генов группы hspA1 и сходный набор сайтов связывания транскрипционных факторов, промоторы генов hspA1A и в особенности hspA1L верблюда проявляют более высокую транскрипционную активность при нормальной физиологической температуре по сравнению с генами hspA1A и hspA1L человека. Очевидно, эти различия обусловлены рядом нуклеотидных замен, а также коротких инсерций и делеций в непосредственной близости от точки старта транскрипции обоих генов (рис. 7). Кроме того, более низкий уровень активности промотора гена hspA1L человека частично определяется наличием 100-нуклеотидной вставки, отсутствующей у других видов (рис. 7). Высокий уровень экспрессии генов hspA1A и hspA1L у C. dromedarius может иметь важное адаптивное значение в условиях обитания этого вида.
Ранее на основе данных многочисленных экспериментов считалось, что промоторы генов ТШ высококонсервативны и универсальны. У всех эукариот транскрипция генов ТШ контролируется фактором HSF, узнающим одни и те же консервативные последовательности (HSE) GAANNTTCNNGAA. У большинства организмов HSE присутствует в составе промоторов ТШ в виде нескольких повторов, находящихся на сходных расстояниях от точки начала транскрипции. Промотор гена hsp70 D. melanogaster достаточно универсален и может эффективно работать в клетках разных организмов, в том числе весьма отдаленных филогенетически. В этом плане использовались культуры клеток как насекомых (шелкопряда, комара Aedes aegypti), так и клетки весьма филогенетически удаленных организмов, в т.ч. млекопитающих (Berger, 1985; McMahon, 1984; Uhlirova, 2002). Во всех случаях в клетках неродственных организмов промотор гена hsp70 D. melanogaster обеспечивал выраженную индукцию транскрипции в ответ на тепловой шок, что лишний раз свидетельствует о высокой консервативности механизмов стрессового ответа у разных организмов.
Было обнаружено, что у ряда видов двукрылых промоторы hsp70 могут быть очень вариабельны даже при сравнении соседних копий генов hsp70 одного и того же вида. В частности, такая картина была обнаружена у S. singularior (Garbuz, 2011). Сравнение нуклеотидных последовательностей промоторных районов генов hsp70 S. singularior и D. melanogaster показывают, что принципиальным отличием между этими двумя видами является отсутствие у S. singularior GAGA-элементов. Это приводит к тому, что активность промоторов hsp70 S. singularior в клетках D. melanogaster оказывается в 10 раз ниже активности эндогенного промотора как при нормальной температуре, так и после ТШ. Введение в промотор S. singularior трех GAGA-сайтов в тех же положениях относительно старта транскрипции, в которых они находятся в составе промотора hsp70 D. melanogaster, увеличивает эффективность транскрипции в 5 и более раз (рис. 12). Ранее было показано, что GAGA-фактор абсолютно необходим для деконденсации хроматина и инициации транскрипции генов hsp70 Drosophila (Georgel 2005). Несмотря на то, что экспрессия генов hsp70 S. singularior носит выраженный индуцируемый характер и не отличается в этом плане от экспрессии генов hsp70 Drosophila, GAGA-фактор не требуется для инициации транскрипции в случае S. singularior.
Таким образом, результаты, полученные нами в различных клеточных системах (клетки млекопитающих и D. melanogaster) на репортерных конструкциях под контролем промоторов генов hsp70 человека и верблюда, а также S. singularior и D. melanogaster, показывают, что промоторы теплового шока, ранее считавшиеся практически универсальными, могут значительно отличаться по структуре и набору регуляторных элементов между разными видами. Строго консервативными у всех описанных организмов являются только HSE-последовательности, узнаваемые фактором HSF, и ТАТА-бокс, тогда как уровень транскрипции как при нормальной температуре, так и при ТШ в не меньшей степени может зависеть от наличия дополнительных регуляторных элементов, специфичных для определенных видов или групп видов (например, батарея из трех GAGA-элементов обнаруживается только у видов, относящихся к роду Drosophila). В других работах видоспецифичные элементы в составе промоторов hsp70 были обнаружены также у минирующих мух Liriomyza (Chen, 2011). У млекопитающих ключевое различие, определяющее уровень транскрипции генов hsp70 у разных видов, может определяться расстоянием между регуляторными элементами в составе промоторов. В отличие от генов hsp70, промоторы генов hsp83 гораздо более консервативны и универсальны по крайней мере в пределах отряда двукрылых (рис. 11). Так, промотор гена hsp83S2 S. singularior работает в клетках D. melanogaster с эффективностью не меньшей, чем собственный хозяйский промотор (рис. 13). Напротив, скорость эволюционных изменений кодирующих областей генов оказывается выше по сравнению с генами hsp70 тех же видов двукрылых. Наши результаты по анализу степени полиморфизма разных аллелей генов hsp83 у S. singularior и сравнению последовательностей генов hsp83 S. singularior и S. japonica показывают, что между двумя копиями hsp83 этого вида отсутствует генетическая конверсия, которая поддерживала бы их структуру, как это происходит в случае генов hsp70 (Garbuz, 2011). По-видимому, консервативность промоторной и кодирующей областей генов hsp83 обеспечивается в основном давлением отбора, т.к. кодируемый ими белок (как и все белки семейства БТШ90) отвечает за активность множества ключевых регуляторных протеинкиназ, транскрипционных факторов и белков - компонентов системы РНК-интерференции (Abravaya, 1992; Xu, 1993; Whitesell, 1998; Kosano, 1998; Sato, 2000), так что нарушения транскрипции генов hsp90 или снижение активности их белкового продукта приводят к многочисленным фенотипическим нарушениям и в большинстве случаев отбраковываются (Rutherford, 1998).