Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Эпидемиология и клиническая характеристика РС 12
1.2. Этиология РС 15
1.3. Основные аспекты патогенеза РС 17
1.4. Патогенетические отличия первично-прогрессирующей и ремиттирующей форм РС 21
1.5. Исследование генетической предрасположенности к РС 25
1.6. Особенности генетической архитектуры ППРС 28
1.7. Основные механизмы эпигенетической регуляции генной экспрессии 34
1.8. Исследования метилирования ДНК при РС 39
Заключение 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Использованные в работе реактивы 47
2.2. Объект исследования 47
2.3. Выделение геномной ДНК из цельной крови и клеток 48
2.4. Генотипирование полиморфных вариантов, выбранных для анализа 49
2.5. Выделение мононуклеарных клеток и субпопуляции клеток CD4+ из периферической крови 57
2.6. Полногеномный анализ метилирования ДНК из клеток периферической крови 58
2.7. Статистический анализ 59
Глава 3. Результаты 61
3.1. Анализ ассоциации полиморфизма генов иммунного ответа с ППРС и РРС 61
3.1.1. Анализ ассоциации основных аллелей высокополиморфного гена HLA-DRB1 с ППРС и РРС 63
3.1.2. Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов биаллельных полиморфных участков генов иммунного ответа с ППРС и РРС 66
3.1.3. Логистический регрессионный анализ и ROC-анализ выявленных генетических маркеров риска развития ППРС и РРС 75
3.2. Полногеномный анализ профилей метилирования ДНК больных ППРС и РРС 80
3.2.1. Анализ метилирования ДНК из мононуклеарных клеток крови 80
3.2.2. Анализ метилирования ДНК из CD4+ Т-лимфоцитов 85
Глава 4. Обсуждение результатов 92
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 113
- Основные аспекты патогенеза РС
- Исследования метилирования ДНК при РС
- Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов биаллельных полиморфных участков генов иммунного ответа с ППРС и РРС
- Анализ метилирования ДНК из CD4+ Т-лимфоцитов
Основные аспекты патогенеза РС
В патогенезе РС выделяются два взаимодополняющих процесса: аутоиммунное нейровоспаление, направленное против компонентов миелиновой оболочки, и нейродегенерацию, играющую ведущую роль при прогрессировании РС [72]. Основные патологические процессы, характеризующие в той или иной степени все формы РС, включают в себя повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), многоочаговое воспаление в ЦНС, разрушение миелиновой оболочки нейронов (демиелинизация), гибель олигодендроцитов, глиоз и дегенерацию аксонов [268]. Эти процессы приводят к нарушению функционирования нейронов и, как следствие, к ухудшению неврологической симптоматики.
Многочисленные исследования позволяют считать, что в развитии РС большую роль играет аутоиммунный процесс, опосредованный, в первую очередь, Т-лимфоцитами. Их первичная активация за пределами ЦНС происходит в результате контакта с антигенпрезентирующими клетками (АПК), несущими или экзогенные АГ, способные к молекулярной мимикрии, или собственные АГ с повышенной вследствие различных причин иммуногенностью [286]. Активированные аутореактивне лимфоциты при участии различных хемокинов, молекул адгезии и протеаз проникают в ЦНС, где вторично активируются при взаимодействии с резидентными АПК, экспрессирующими молекулы МНС в комплексе с аутоАГ, к которым в первую очередь относятся белки миелиновой оболочки (основный белок миелина (ОБМ), протеолипидный протеин, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин), а также некоторые другие компоненты олигодендроцитов и нейронов [2].
Показано, что CD4+ Т-лимфоциты, играют ключевую роль в патогенезе РС. Так у мышей в отсутствие CD4+ Т-клеток не удается путем иммунизации добиться развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) - основной животной модели РС, в то время как у мышей с дефицитом CD8+ T-клеток ЭАЭ развивается [156]. Миелин-реактивные CD4+ Т-клетки обнаруживаются в периферической крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) больных РС и участвуют в продукции интерферона гамма в ответ на стимуляцию пептидами основного белка миелина [46, 207]. Данные об основных субпопуляциях иммунных клеток, участвующих в патогенезе РС, суммированы на рис. 1.2.
Главная роль в поддержании аутоиммунного процесса при РС долгое время отводилась только T-хелперам (Th) 1 типа, т.к. IFNg, легко выявляемый в очагах демиелинизации в ЦНС (так называемых бляшках), продуцируется в основном именно этой субпопуляцией Т-клеток, а периваскулярные инфильтраты, обнаруживаемые в ЦНС животных с ЭАЭ и больных РС, часто обогащены макрофагами, что напоминает картину Th1-опосредованного воспалительного ответа [183]. Однако открытие Th17-лимфоцитов изменило представление о вовлеченности субпопуляций CD4+ Т-клеток в иммунопатогенез РС. IL-17 – основной цитокин, продуцируемый Th17, обнаруживается как в лимфатических сосудах мышей с ЭАЭ, так и в периферической крови, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и в очагах демиелинизации больных РС [190, 296]. Более того, дефицит IL-23, стимулирующего образование Th17 и поддерживающего их жизнедеятельность, вызывает абсолютную резистентность лабораторных животных к ЭАЭ [58]. IL-17, производимый Th17, способен активировать астроциты [71] стимулировать продукцию различными клетками провоспалительных цитокинов (IL-6, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор некроза опухоли альфа (TNF)), хемокинов (CXCL8, CXCL2, CCL20) и белков системы комплимента [230]. IL-17 способен сам по себе поддерживать жизнедеятельность Th17, а кроме того активировать микроглию и способствовать привлечению в очаг воспаления нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов [280].
Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты также проникают в ЦНС больных, где вторично активируются, взаимодействуя с аутоантигенами, презентируемыми молекулами MHC класса I. Взаимодействие активированных CD8+ Т-лимфоцитов с нейронами и олигодендроцитами активирует секрецию ими в область «иммунологического синапса» молекул TNF, гранзимов А и В и перфорина, которые индуцируют апоптоз или напрямую повреждают клеточную стенку [116, 199, 204], что приводит к демиелинизации и дегенерации аксонов и нейронов [10, 22, 197, 199, 220]. В последнее время появились многочисленные данные, свидетельствующие об участии в патогенезе РС В-лимфоцитов. Они продуцируют ауто-АТ, а также могут выступать в качестве антиген-презентирующих клеток [208, 279]. У животных, страдающих ЭАЭ, в очагах демиелинизации обнаруживаются B-клетки и синтезируемые ими АТ [175]. Анализ специфичности АТ позволяет выявить различные ауто-АТ, в том числе АТ к миелину и нейрофасцину – мембранному белку аксонов, локализующемуся в области перехватов Ранвье [175, 187, 208]. В то же время, показано, что вклад В-клеточного иммунитета в патогенез ЭАЭ может различаться в зависимости от использованного для его индукции пептида [307]. В целом, вклад В-лимфоцитов в патогенез РС может быть гораздо более существенным, чем было принято считать ранее. Об этом свидетельствуют как новые данные, обнаруживающие связь этой популяции лимфоцитов с развитием заболевания не только на животных моделях, но и у пациентов, страдающих РС, так и высокая эффективность используемой во всем мире анти-В-клеточной терапии при РРС и даже при ППРС (ритуксимаб, окрелизумаб) [63, 210, 215].
Некоторые субпопуляции лимфоцитов способны играть защитную роль и сдерживать аутоиммунный воспалительный процесс при развитии РС. К таким клеткам относят Th2-клетки, Treg, CD8+ Т-клетки и естественные киллеры (Natural killer, NK-клетки). Th2-лимфоциты продуцируют противовоспалительные цитокины II-4, IL-10, IL-13 [275], которые подавляют синтез провоспалительных цитокинов, а также цитотоксическую активность лимфоцитов и макрофагов [250]. Кроме того, они способны подавлять активацию клеток микроглии в ЦНС и продуцировать ряд нейротрофических факторов [257]. Считается, что действие одного из ПИТРС первой линии - глатирамера ацетата (ГА) во многом основано на смещении цитокинового профиля Т-лимфоцитов в сторону Th2 [200, 219] за счет активации ГА-специфичных Th2-лимфоцитов, что способствует улучшению состояния больных РС [324]. Основной функцией Treg-лимфоцитов является контроль иммунного ответа после перенесенных инфекционных заболеваний и предотвращение развития аутоиммунных реакций [182]. Показано, что обострение симптоматики РС коррелирует со снижением пролиферации и активности Treg-клеток [39]. Некоторые CD8+ Т-лимфоциты также могут выполнять регуляторную функцию при аутоиммунных заболеваниях. Так, на мышиной модели ЭАЭ было показано, что субпопуляция регуляторных CD8+ Т-клеток может сдерживать развитие патогенных аутореактивных CD4+ Т-клеток [111]. NK-клетки являются частью системы врожденного иммунитета и также способны подавлять аутоиммунные реакции [162]. У больных РС по сравнению со здоровыми индивидами активность NK-клеток снижена [93]. Более того, было показано, что их количество обратно коррелирует с риском развития обострений заболевания [139].
Продукция провоспалительных цитокинов Т-клетками приводит к активации в ЦНС макрофагов микроглиального происхождения и привлечению и активации периферических моноцитов. Активированные макрофаги поддерживают воспалительный процесс и наряду с CD4+ Т-клетками играют важную роль в повреждении миелиновых оболочек и аксонов нейронов при РС [40]. Они продуцируют провоспалительные цитокины IL-1, IL-6, интерферон гамма и TNF и повышают чувствительность аксонов к глутамат-опосредованной эксайтотоксичности [125, 240]. После элиминации антигена макрофаги оказываются вовлечены в репарацию нейрональной ткани [246, 251]. Во время ремиссии активированные макрофаги глии способствуют ремиелинизации аксонов путем стимуляции пролиферации клеток-предшественников олигодендроцитов [7, 145].
Гистологические и иммуноцитохимические исследования очагов демиелинизации (бляшек) у больных РС позволили выделить четыре различных типа (паттерна) патологического процесса: тип I характеризуется преимущественно реакциями, опосредованными макрофагами и Т-лимфоцитами; тип II – вовлечением АТ/комплемент-опосредованных реакций; тип III – дистальной олигодендроглиопатией; тип IV – выраженной дегенерацией олигодендроцитов с минимальными признаками воспаления [166, 198]. В то же время у конкретного больного обнаруживают активные бляшки только одного типа из перечисленных [166]. Таким образом, описанные в данном разделе аутоиммунные механизмы характеризует все формы РС, однако у разных больных различные элементы патологического процесса оказываются выражены в большей или меньшей степени, и таким образом могут формировать основу клинической гетерогенности заболевания.
Исследования метилирования ДНК при РС
Исследования участия метилирования ДНК в формировании риска развития РС начались более 10 лет назад. Анализ дифференциального метилирования в основном проводили в различных фракциях и клетках крови (цельная кровь, сыворотка, МНК, CD4+, CD8+ Т-лимфоциты и т.д.), только в нескольких работах исследовали ткани мозга [158]. В большинстве работ проводили сравнение больных РРС со здоровыми индивидами контрольной группы; при этом особенности метилирования ДНК при различных клинических формах РС практически не изучались. В нескольких работах анализировали изменение метилирования ДНК у больных РРС при сравнении стадий обострения и ремиссии или под влиянием терапии разными ПИТРС. Общий обзор работ, посвященных изучению различий в метилировании ДНК у больных РС, представлен в табл. 1.2. Как видно из таблицы, эти исследования проводились с помощью трех основных методологических подходов: анализ дифференциального метилирования отдельных локусов, анализ маркеров глобального метилирования и полногеномный анализ метилирования с применением чипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования. Следует отметить, что в исследованиях метилирования ДНК при РС, проведенных к настоящему времени, помимо разных клинических характеристик исследуемых групп и разных источников ДНК, используются также различные критерии выбора дифференциально метилированных CpG-сайтов генома (ДМС). Для двух основных критериев, уровня значимости (p) и разницы среднего уровня метилирования CpG-сайта между группами (), пределы могут существенно варьировать в разных исследованиях. Особенно подобная ситуация характерна для работ, проведенных с использованием полногеномного анализа метилирования [172, 173]. Таким образом, отсутствие универсального дизайна работ, проведенных к настоящему времени, является основной проблемой, не позволяющей уверенно сопоставлять полученные в них результаты.
Наиболее распространенным подходом, применяемым для анализа метилирования ДНК, как и в случае генетической предрасположенности, стал поиск ДМС в области перспективных «генов-кандидатов». Подобный анализ в большинстве работ проводился в МНК, Т-лимфоцитах, сыворотке или цельной крови больных РРС в сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы, а в некоторых случаях и в сравнении с больными РРС на различных стадиях патологического процесса (обострение и ремиссия) (см табл. 1.2.). Были выявлены ДМС в области генов, вовлеченных в иммунный ответ (SOCS1) [273], функционирование нервной системы (MOG, NEUROG1) [33, 229], рост и развитие (PTPN6, CDKN2A) [150, 273], метаболизм витамина D (VDR) [9] и регуляцию генной экспрессии (DNMT1, TET2, RUNX3) [34, 273]. В двух работах, изучавших метилирование ДНК в тканях головного мозга, ДМС были выявлены в генах цитокинового рецептора IL2RA и пептидил-деиминазы PADI2, участвующей в посттрансляционной модификации основного белка миелина [77, 186]. Отдельно стоит отметить единственное проведенное к настоящему моменту исследование, включившее группу больных ППРС [97]. Проведенный в этой работе анализ метилирования генов HLA-DRB1 и HLA-DRB5 в цельной крови больных РРС, ППРС и здоровых индивидов не выявил значимых различий между группами.
В нормальных условиях повторяющиеся последовательности генома, ретротранспозоны суперсемейства LINE, содержат много метилированных CpG-сайтов, что предотвращает транскрипцию их генов [270], поэтому анализ их дифференциального метилирования получил широкое распространение, как простой способ оценки глобального уровня метилирования генома при различных опухолях и некоторых аутоиммунных заболеваниях [66]. Уровень метилирования ретротранспозонов семейства LINE-1 изучался у больных РРС в МНК, в цельной крови и в сыворотке крови [66, 221, 238]. Во всех случаях наблюдали гиперметилирование LINE-1 при РРС. Кроме того, была обнаружена связь более высокого уровня метилирования LINE-1 с выраженной инвалидизацией по шкале EDSS и низкой эффективностью терапии интерфероном бета [221, 238]. Для больных ППРС подобных исследований не проводилось.
Поиск ДМС по всему геному с применением чипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования в последние годы получил широкое распространение при анализе эпигенетических механизмов, вовлеченных в патогенез РС (см табл. 1.2). В отличие от GWAS полногеномный анализ метилирования не требует включения в исследование больших групп больных РС: обычно их размер варьирует в интервалах от пяти-шести до двадцати-тридцати пациентов. Несмотря на это, все подобные работы были выполнены с привлечением только больных РРС, а больные ППРС не были включены ни в одно из них. Большинство опубликованных работ концентрируется на анализе метилирования ДНК в CD4+ T-лимфоцитах, однако полученные в них данные достаточно противоречивы. В двух работах одной и той же исследовательской группы были получены значимые различия профилей метилирования у больных РРС и здоровых индивидов контрольной группы [90, 172]. Единственным дифференциально метилированным регионом, идентифицированным в этих работах, был гиперметилированный локус HLA, преимущественно в области гена HLA-DRB1. Другие ДМС, выявленные в одной из работ, не находят подтверждения в другой, что может объясняться отличиями в дизайне этих исследований. В работе [258] обнаружено гиперметилирование кластера ДМС в двух последних экзонах гена VMP1/MIR21 у больных РРС при сравнении с контрольной группой и больными ВПРС, а в работе [26] выявлено более 40 ДМС, характеризующихся номинальным уровнем значимости. Еще в одном исследовании вовсе не удалось обнаружить значимых различий метилирования ДНК у больных РРС и здоровых индивидов [13]. Авторы анализировали профили метилирования ДНК в трех парах монозиготных близнецов, дискордантных по диагнозу РС, и обнаружили между близнецами меньшие различия в уровнях метилирования, чем между неродственными здоровыми индивидами. В то же время, изучение ДНК CD4+ T-лимфоцитов одних и тех же больных РРС до и после курса терапии диметилфумаратом позволило выявить множество ДМС по всему геному, 97% которых были гиперметилированы после лечения [173]. Полученные в этом исследоваии результаты указывают на необходимость принимать во внимание терапию ПИТРС при подборе гомогенных групп больных РС для анализа метилирования. Результаты, полученные для двух исследований метилирования ДНК CD8+ T лимфоцитов, также трудносопоставимы. Так, в работе [26] обнаружено глобальное гиперметилирование ДНК при РРС, но не выявлено значимых различий метилирования отдельных CpG-сайтов; а результаты исследования [171] не подтверждают тенденции к гиперметилированию ДНК при РРС, однако обнаруживается 79 значимых ДМС. При изучении CD19+ B-лимфоцитов обнаружен кластер ДМС в области гена LTA, а также ряд ДМС в области генов SLC44A2, LTBR, CARD11 и CXCR5, которые ассоциированы с РС по результатам GWAS [174]. Стоит отметить, что группа больных РРС в этом исследовании была очень гетерогенной: в нее вошли как пациенты, не подвергающиеся медикаментозной терапии, так и больные, принимающие 5 различных иммуномодулирующих препаратов. В CD14+ моноцитах больных РРС метилирование гена HLA-DRB1 оказалось сниженным, причем преимущественно у носителей аллеля DRB1 1501 [149]. В единичных работах обнаружены значимые различия профилей метилирования ДНК, полученной из сыворотки или цельной крови [77, 160]. В одном исследовании показана связь курения с уровнем метилирования ДНК у больных РРС, причем наиболее значимые различия были обнаружены у женщин и носителей гаплотипов риска РС локуса HLA [176]. В тканях головного мозга наблюдали дифференциальное метилирование ДНК, полученной из демиелинизированной и нормальной ткани гиппокампа [45], а также из ткани фронтальной коры больных РС и контрольной группы без патологических изменений [117].
Анализ ассоциации носительства аллелей/генотипов биаллельных полиморфных участков генов иммунного ответа с ППРС и РРС
Определены частоты носительства аллелей и генотипов 17 не-HLA генов, вовлеченных в развитие иммунного ответа и воспалительных реакций, в группах больных ППРС, РРС и здоровых индивидов. Для аллелей и генотипов всех исследованных полиморфных вариантов в контрольной группе равновесие Харди-Вайнберга соблюдалось. Анализ частот носительства аллелей и генотипов проводился в попарных сравнениях «ППРС vs Контроль», «РРС vs Контроль» и «ППРС vs РРС».
Частоты носительства аллелей и генотипов полиморфных вариантов белок кодирующих генов CD86 (rs2255214), CXCR5 (rs523604), IFNAR2 (rs2248202) и генов микроРНК MIR146A (rs2910164), MIR196A2 (rs11614913) и MIR499A (rs3746444) в русской популяции определены впервые. Проведено сравнение частот генотипов этих вариантов в группе здоровых индивидов с данными, представленными в базе NCBI dbSNP. Для всех полиморфных участков всех исследуемых генов частоты генотипов соответствуют таковым для европейских популяций. Проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов не-HLA генов с развитием ППРС в сравнении «ППРС vs Контроль». Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных SNP в области генов иммунного ответа, для которых выявлены значимые ассоциации с развитием ППРС при сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы представлены в табл. 3.5. После введения поправки на множественные сравнения носительство генотипа IL4 C/C (pf = 0.0012; pcorr = 0.038; ОШ (95% ДИ) = 2.17 (1.35-3.57)) было позитивно ассоциировано с ППРС . Носительство генотипов IL7RA C/C (pf = 0.039; ОШ (95% ДИ) = 1.61 (1.04-2.50)), IRF5 A/A (pf = 0.020; ОШ (95% ДИ) = 1.78 (1.12-2.85)), CXCR5 A/A (pf = 0.0024; ОШ (95% ДИ) = 1.96 (1.25-3.03)), CLEC16A G/G (pf = 0.0039; ОШ (95% ДИ) = 2.12 (1.27-3.57)) и аллелей IRF5 A (pf = 0.026; ОШ (95% ДИ) = 1.80 (1.08-3.03)) и IFNAR2 C (pf = 0.042; ОШ (95% ДИ) = 1.57 (1.01-2.42)) было номинально ассоциировано с ППРС.
Проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов не-HLA генов с развитием РРС в сравнении «РРС vs Контроль». Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных SNP, для которых выявлены значимые ассоциации с РРС при сравнении со здоровыми индивидами контрольной группы представлены в табл. 3.7. Генотип IL7RA C/C был позитивно ассоциирован с РРС после поправки на множественные сравнения (pf = 0.0027; pcorr = 0.049; ОШ (95% ДИ) = 1.49 (1.15-1.92)). Ассоциации аллелей/генотипов CD86 G/G (pf = 0.044; ОШ (95% ДИ) = 1.33 (1.01-1.75)), IL6 C (pf = 0.0073; ОШ (95% ДИ) = 1.46 (1.11-1.92)), CXCR5 A/A (pf = 0.0035; ОШ (95% ДИ) = 1.54 (1.16-2.04)), CLEC16A G/G (pf = 0.045; ОШ (95% ДИ) = 1.43 (1.02-2.04)) и IFNAR2 A (pf = 0.039; ОШ (95% ДИ) = 1.59 (1.04-2.44)) с РРС оказались номинально значимы. Стоит отметить, что генотипы IL7RA C/C, CXCR5 A/A и CLEC16A G/G были ассоциированы не только с РРС, но и с ППРС при сравнении с контрольной группой, поэтому их можно отнести к категории вариантов ассоциированных с РС независимо от его формы
Проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов не-HLA генов с развитием основных форм РС в сравнении «ППРС vs РРС». Частоты носительства аллелей и генотипов биаллельных SNP, для которых выявлены значимые ассоциации с развитием ППРС или РРС при прямом сравнении этих форм РС, представлены в табл. 3.9. Генотипы IL4 C/C (pf = 0.0016; pcorr = 0.038; ОШ (95% ДИ) = 2.13 (1.35-3.45)) и IRF5 A/A (pf = 0.00047; pcorr = 0.019; ОШ (95% ДИ) = 2.33 (1.47-3.70)) были позитивно ассоциированы с развитием ППРС после поправки на множественные сравнения. Позитивная ассоциация аллея IL6 C с РРС (pf = 0.036; ОШ (95% ДИ) = 0.62 (0.40-0.95)), а аллелей MIR196A2 C (pf = 0.028; ОШ (95% ДИ) = 2.43 (1.09-5.42)) и IFNAR2 C (pf = 0.016; ОШ (95% ДИ) = 1.70 (1.11-2.57)) – с ППРС обладали номинальным уровнем значимости. Варианты IL4 C/C, IRF5 A/A и IFNAR2 C были классифицированы нами как ППРС-специфические, т.к. выявлялись и при сравнении больных ППРС с контрольной группой, а аллель IL6 C – как РРС-специфический.
Анализ метилирования ДНК из CD4+ Т-лимфоцитов
Как и в случае МНК сравнительный анализ метилирования ДНК из CD4+ Т-лимфоцитов выявил существенные различия в профилях метилирования между сравниваемыми группами. В CD4+ Т-лимфоцитах больных ППРС, больных РРС и здоровых контролей при трех сравнениях обнаружено 186 ДМС. При сравнении «ППРС vs Контроль» выявлено 108 ДМС, при сравнении «РРС vs Контроль» – 34 ДМС, а при сравнении «ППРС vs РРС» – 54 ДМС. Сразу при двух сравнениях были обнаружены 10 ДМС: при сравнениях больных ППРС и РРС с контролем выявлен один общий ДМС, при сравнениях ППРС с контролем и РРС – 7, а при сравнениях РРС с контролем и ППРС – 2.
При иерархической кластеризации образцов ДНК на картах интенсивности сигналов ДМС (рис. 3.5) больные ППРС и РРС хорошо разделяются со здоровыми индивидами контрольной группы на отдельные кластеры. При сравнении «ППРС vs РРС» наблюдали попадание двух больных РРС в кластер ППРС; ознакомление с их историями болезни показало, что они находились на момент забора крови в стадии обострения.
Градиент цвета отражает уровень метилирования ДНК в исследуемых образцах. Дендрограмма сверху показывает иерархическую кластеризацию образцов, где синий цвет обозначает больных ППРС, зеленый – больных РРС, черный – здоровых индивидов. Слева представлена иерархическая кластеризация ДМС, где цветом обозначена их локализация: черным – ДМС, расположенные в CpG-островках, темно-серым – в соседних с ними областях (shore), светло-серым – в отдаленных областях (shelf), белым – в прочих областях (sea). Справа указаны названия проб в соответствии со стандартной аннотацией HumanMethylation450BeadChip. При сравнении «ППРС vs Контроль» у больных 81% ДМС оказался гиперметилированным, а при сравнении «РРС vs Контроль» – 59% ДМС. При сравнении больных ППРС и РРС 81% ДМС оказался гиперметилирован у больных ППРС. Как и в случае МНК, для CD4+ Т-лимфоцитов более половины всех выявленных ДМС обнаружено в области генов. Всего при сравнении «ППРС vs Контроль» выявлено 53 ДМГ, при сравнении «РРС vs Контроль» – 20, а при сравнении «ППРС vs РРС» – 32 ДМГ. В табл. 3.15 представлены все выявленные белоккодирующие и белокнекодирующие ДМГ.
Некоторые из представленных в табл. 3.15 ДМГ были выявлены в двух различных сравнениях. Так при сравнении больных обеими формами РС со здоровыми индивидами обнаруживалось дифференциальное метилирование гена OR2L13. Гены CBFA2T3, FYTTD1, KIAA0226, PLEKHA2, XKR5, ERICH1 и IGDCC4 оказались дифференциально метилированными при сравнении группы больных ППРС как с РРС, так и с контрольной группой. Гены GNAS и RPH3AL были РРС-специфическими.
В сравнении «ППРС vs Контроль» выявлено 16 ДМС с уровнем метилирования, различающимся между группами более чем на 20%, в генах расположены 13. Из них у больных ППРС уровень метилирования ДМС cg08260406, cg20507276 и cg08944170 (OR2L13), cg07157030 (RHOJ), cg19980771 (SLC22A16), cg17749961 и cg12454169 (LCLAT1), cg15070894 и cg18786623 (HCG4B), cg01053087 и cg05875700 (ERICH1) был выше на 20-37%, чем у здоровых индивидов. Сg04824555 (FAM157B) и cg02938066 (TONSL) были гипометилированными у больных на 21 и 22%, соответственно. В сравнении «РРС vs Контроль» уровни метилирования различались между группами более чем на 20% для пяти ДМС, из них в генах расположены три. Уровень метилирования cg08260406 (OR2L13) у больных РРС был на 21% выше; а cg09885502 (GNAS) и cg06888746 (SH3PXD2A), на 42 и 21% ниже, чем у здоровых индивидов. При прямом сравнении ППРС и РРС выявлено четыре ДМС, для которых уровни метилирования различались в сравниваемых группах более чем на 20%. Два расположенных в генах ДМС, cg09885502 (GNAS) и cg05875700 (ERICH1), были метилированы в группе ППРС на 43 и 32% больше, чем у больных РРС.
Для оценки возможного влияния выявленных в CD4+ Т-лимфоцитах ДМС на экспрессию генов, в которых они расположены, проведен анализ их локализации по отношению к функционально значимым скоплениям CpG-сайтов. Результаты анализа представлены на рис. 3.7. Как и в случае МНК, более половины ДМС находятся в областях с наибольшим функциональным значением: в CpG-островках (43%, 53% и 46%, соответственно при трех сравнениях) и соседних с ними областях (24%, 12% и 28%, соответственно).
Для ДМГ, выявленных в субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов, был проведен функциональный анализ с использованием базы данных Gene Ontology (geneontology.org/). При сравнении «ППРС vs Контроль» из 53 генов, содержащих ДМС, было обнаружено 23 гена с подтвержденной для человека биологической функцией: AGA, ASRGL1, CBFA2T3, CDK11B, CORO1C, DCLRE1C, ENOSF1, FLI1, FYTTD1, H2AFY, DRB5, IGF2BP1, LIME1, SERPINA11, NKAIN1, NPAS3, PRTFDC1, RASA3, RHOJ, SIM2, SLC46A2, TULP2 и XKR5. При сравнении «РРС vs Контроль» из 20 ДМГ таких генов было 7: ATF7, EBF3, GNAS, LTBP3, NCOR2, SH3PXD2A и TDG, а при сравнении «ППРС vs РРС» из 32 ДМГ генов с подтвержденной для человека биологической функцией – 18: ABCF2, ASIC1, ATP9A, CBFA2T3, CKB, EXOSC7, FYTTD, GNAS, ICAM5, ITM2C, KLF4, LAMTOR2, LEFTY2, RAB22A, TPO, UBQLN4, XKR5 и ZDHHC3. Анализ перепредставленности биологических функций в перечисленных наборах генов с использованием инструмента PANTHER (pantherdb.org/) не дал статистически значимого обогащения ни в одном из сравнений. Все биологические функции, в выполнение которых вовлечены гены, аннотированные по базе Gene Ontology, представлены на рис. 3.6.
Слева представлены биологические функции, их ID и описание из базы Gene Ontology, на гистограмме справа – доля генов вовлеченных в их выполнение в процентах от общего числа аннотированных генов.
Как видно из рис. 3.6. для сравнений «ППРС vs Контроль» и «ППРС vs РРС» в отличие от «РРС vs Контроль» больше характерно вовлечение ДМГ в метаболические процессы (GO:0008152) и процессы, связанные с локализацией клеток и их структур (GO:0051179). Кроме того в этих сравнениях выявляются гены, участвующие в процессах развития (GO:0032502), ответа на стимулы (GO:0050896) и надклеточных процессах (0032501), которые вовсе не выявляются в сравнении «РРС vs Контроль». ДМГ, участвующие в процессах биологической адгезии (GO:0022610) обнаружены только в сравнении «ППРС vs РРС». В сравнении «РРС vs Контроль» аннотированные ДМГ чаще участвуют в различных процессах биологической регуляции (GO:0065007) и клеточных процессах (GO:0009987).
Таким образом, мы впервые выявили различия профилей метилирования ДНК между группами больных ППРС и РРС и здоровыми индивидами контрольной группы, которые наблюдаются и в МНК, и в CD4+ Т-лимфоцитах. При этом для ППРС характерен повышенный уровень метилирования по сравнению со здоровыми индивидами и больными РРС. Описан спектр генов, дифференциально метилированных в группах больных ППРС и РРС. Более половины выявленных во всех сравнениях ДМС находится в CpG-островках и соседних с ними областях, что говорит об их функциональной значимости.