Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди вирусных инфекций человека вирусные гепатиты по своей распространенности, уровню заболеваемости и причиняемому экономическому ущербу занимает одно из ведущих мест.
В суммарной заболеваемости вирусными гепатитами наибольший удельный вес приходится на гепатит А (ГА). Истинное число случаев заболеваний ГА трудно поддается оценке, что связано с полиморфизмом клинических проявлений инфекции и преобладанием атипичных и субклинических форм, затрудняющих его диагностику. ГА остается практически неконтролируемой инфекцией, и заболеваемость им, испытывая колебания в сторону увеличения или уменьшения в разные годы, в общем имеет тенденцию к возрастанию (В.М.Жданов, 1984; В.М.Жданов с соавт., 1986). Все вышеизложенное, а также отсутствие надежных средств специфической профилактики, делает проблему ГА особенно актуальной для здравоохранения.
Прогресс, достигнутый за последние 15 лет в изучении ГА, неразрывно связан с новым этапом развития вирусологии, вобравшим в себя достижения биохимии, генетики, электронной оптики, общей и прикладной иммунологии и многих других отраслей науки.
Поворотными моментами в изучении ГА были в первую очередь открытие в 1973 Г. Feinstone et el. вируса гепатита А (ВГА) с помощью иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ), установление возможности моделирования указанной инфекции на шимпанзе и мар-мозетах (P.J.Provost et al., 1973; J.L.Dienstag et а1.,1975),за-тем разработка и использование радио- и энзимоиммунологических методов (РИМ и ЭИМ), для обнаружения ВГА и антител против него
- 4 -(анти-ВГА) (F.B.Hollinger et al., 1975; W.Duermeyer, 1978).
На всех этапах исследования основной трудностью в изучении ВГА оставалась проблема получения материала, содержащего ВГА в количествах, необходимых для исследования его свойств и использования в качестве антигена для серологических реакций. Очень важное значение имеют поиски и получение вируссодержащих материалов от больных ГА, так как ВГА в основном выделяется из организма больного в инкубационном периоде до наступления клинической картины (J.w.Mosley, 1983). Кроме подбора вируссодержащих материалов,немаловажное значение имеет отбор отрицательных и положительных сывороток анти-ВГА, которые также необходимы для постановки всех серологических реакций.
Описанные в литературе варианты ИЭМ, РИМ и ЭИМ для обнаружения ВГА и анти-ВГА весьма сложны, требуют специального лабораторного оснащения и достаточного времени для приготовления препаратов ( W.T.Hall et al., 1977; L.R.Mathiesen et al., 1978; M.Eoggendorf et al., 1980). Кроме того, постановка всех этих методов доступна лишь для специализированных хорошо оснащенных лабораторий, занятых изучением ГА. В связи с этим, одной из важных задач, в рамках всей проблемы борьбы с ГА, является упрощение известных и создание новых более доступных и быстрых методов специфической диагностики указанной инфекции.
Несмотря на то, что во многих специализированных лабораториях мира были освоены методы обнаружения ВГА, обследование больных ГА ограничивалось анализом лишь отдельных случаев (Н.В.Дорошенко с соавт., 1982; P.Skinhoj et al., 1981; B.Fleh-mig et al., 1977 ) . Мало что известно о характере экскреции ВГА у больных с фекалиями, не говоря уже о частоте выделения ВГА и других вирусов у больных в зависимости от диагноза, эпид-
ситуации, срока и тяжести заболевания. Также отсутствуют данные об обследовании носоглоточных смывов и слюны у больных с диагнозом ГА на наличие ВГА. Не проводились специальные исследования, направленные на выяснение возможности циркуляции ВГА в коллективах, благополучных и не благополучных по ГА. Не были известны количественные особенности формирования иммунного ответа при ГА в сравнении с другими энтеровирусными инфекциями.
Имеющиеся в литературе данные по электронномикроскопическо-му изучению ВГА ограничиваются обследованием малых чисел изоля-тов ВГА (E.H.Cook et al., 1976; G.Siegl, 1982). При этом проводился неполный ультраструктурный анализ ВГА и вирусспецифиче-ских структур. При исследовании биофизических свойств ВГА мало внимания уделялось морфологическому анализу фракции градиентов и в большинстве работ для оценки флотационных свойств изолятов указанного вируса использовались РШ и ЭШ ( F.B.Hollinger et al., 1975; J.L.Dienstag et al., 1976; P.Coursaget et al., 1980), которые могут дать только антигенную характеристику, тогда как только с помощью методов электронной микроскопии возможно получение более детальной информации.
Не проводилось сравнительное изучение антигенных свойств изолятов ВГА из различных географических зон СССР и других стран. Эти исследования необходимы для выяснения, имеются ли антигенные различия между изолятами указанного вируса, выделенными в различных регионах мира.
В результате прогресса в исследованиях распространения ГА с применением методов его специфической диагностики происходило накопление фактических сведений, которые с нарастающей убедительностью свидетельствовали о существовании по крайней мере еще одного вида гепатита, сходного по клинической картине и
эпидемиологическим закономерностям с ГА, но отличающегося от него этиологически. Критериями для выделения этой инфекции из общей массы вирусных гепатитов служили отсутствие этиологической причастности вирусов гепатитов А и В и других известных агентов вирусной природы в сочетании с вероятностью фекально-оральной передачи заразного начала (М.С.Балаян, 1983; J.Rosen-Ъашп et al., 1984; С.Шгеро, 1984). Спорадические случаи такого гепатита регистрировались во многих странах, однако, крупные водные вспышки имели место на азиатском континенте (M.A.Sreeni-vasan. et al., 1984-; D.G.Wong et al., 1980; M.A.Kane et al., 1984-)
Многочисленные попытки идентифицировать этиологический агент, вызывающий указанное заболевание, успеха не имели. Проблема эта новая и не изученная. Единственным путем для начала изучения этой проблемы представлялось осуществление работ по поиску, выявлению и установлению нового возбудителя гепатита у человека, создание тест-системы для обнаружения данного вируса и антител против него и определения возможности моделирования указанной инфекции на обезьянах. При удачном завершении этих работ появится реальная перспектива развития нового направления в изучении гепатопатии человека инфекционного происхождения.
Известно, что в экспериментальных условиях надежно моделировать ГА удалось только на шимпанзе и мармозетах ( F.Deinhardt, 1976, 1985; Е.Tabor et al., 1983). В то же время поиски восприимчивых к вирусным гепатитам лабораторных животных показали, что среди многих видов обезьян достаточно часто встречаются особи, имеющие анти-ВГА. В связи с этим большой научный и практический интерес представляет выявление возможности моделирования ГА на более доступных видах обезьян, чем шимпанзе и мармозеты.
Моделирование ГА на обезьянах необходимо для изучения патогенеза, иммуногенеза указанной инфекции и для испытания эффективности различных терапевтических и профилактических препаратов.
Вааное значение для решения проблемы ГА имеет культивирование ВГА в клеточных культурах. В результате интенсивных исследований за последние годы в некоторых лабораториях мира достигнуты определенные успехи в культивировании указанного вируса в клеточных культурах, что дает реальную возможность для создания диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Цель и задачи исследований. Основным направлением и целью настоящей работы явилось получение с помощью лабораторных методов исследований новых вирусологических и эпидемиологических знаний о гепатите А и о сходном с ним по клинике и эпидемиологии гепатите человека, но отличающегося от него этиологически. Исследование посвящено выявлению и характеристике возбудителей, совершенствованию специфической диагностики и выяснению возможности моделирования этих инфекций на обезьянах, культивирования их этиологических агентов в клеточных культурах.
В задачи работы входило:
-
Совершенствование и разработка новых более доступных и быстрых методов обнаружения ВГА и антител против него и их применение для диагностики и эпидемиологического анализа ГА.
-
Изучение частоты выделения ВГА и других вирусов у больных в зависимости от диагчгаза, эпидситуации, срока и тяжести заболевания; определение распространения вируса гепатита А в коллективах, благополучных и не благополучных по гепатиту А.
-
Морфологическое, биофизическое и антигенное изучение изолятов вируса гепатита А, выделенных от больных гепатитом А.
-
Изучение особенностей формирования иммунного ответа при гепатите А.
-
Поиски, выявление и идентификация нового возбудителя гепатита, передающегося фекально-оральным механизмом и вызывающего сходную клиническую картину с ГА, но отличающегося от него этиологически; создание тест-системы для выявления нового этиологического агента и антител против него, определение его циркуляции в различных районах СССР и других странах.
-
Изучение возможности моделирования на обезьянах ГА и сходного с ним заболевания, отличающегося от него этиологически.
-
Разработка методов культивирования в клеточных культурах вируса гепатита А.
Научная новизна работы и положения, которые выносятся на зашиту. Выявлено, что в фекальных пробах., содержащих и не содержащих ВГА, может присутствовать материал, дающий псевдоположительную реакцию в ЭИМ, который блокируется отрицательными на .анти-ВГА сыворотками человека и некоторых видов животных и угнетается в присутствии слабых неионных детергентов.
Впервые показано, что в результате инфекции ГА у человека развивается в 25-800 раз больше специфических антител, чем после инфекции другими энтеровирусами.
В работе на основе обширных экспериментальных данных научно обоснована возможность и доказана эффективность применения разработанных упрощенных методов выявления ВГА и антител против него в целях ускоренного обнаружения указанного вируса в различных материалах и для осуществления быстрой специфической диагностики ГА.
Определены закономерности частоты выделения ВГА и других вирусных агентов с фекалиями в зависимости от эпидситуации, ди-
- 9 -агноза, возраста, срока и тяжести заболевания.
Получена полная морфологическая характеристика материалов, содержащих частицы НГА; с помощью метода ИЭМ показана антигенная идентичность изолятов этого вируса, собранных в различных географических районах мира.
Показана циркуляция ВГА в детских коллективах, в которых имели место случаи клинически выраженного заболевания ГА.
Впервые экспериментально доказано существование фекально-орального гепатита ни-А, ни-В и установлено, что его этиологическим агентом является вирус, который имеет сферическую форму размером 27 нм, коэффициент седиментации 183S и антигенно отличается от ВГА и ВГВ.
Впервые создана тест-система для выявления вируса фекаль-но-орального гепатита ни-А, ни-В и антител против него с помощью метода ИЭМ.
Впервые определен характер распространения вируса фекаль-но-орального гепатита ни-А, ни-В в различных географических районах мира и установлено его этиологическое значение при водных вспышках гепатита.
Впервые показана возможность моделирования фекально-ораль-ного гепатита ни-А, ни-В на яванских макаках.
Впервые установлена естественная ГА-подобная инфекция у яванских макак, бурых макак и африканских зеленых мартышек. Доказано, что среди указанных видов обезьян имеет место циркуляция ВГА.
Впервые проведено экспериментальное моделирование ГА на яванских макаках, бурых макаках и африканских зеленых мартышках при их заражении штаммом ВГА Ш-55, выделенным от яванской макаки при спонтанном ГА,
Впервые описана репродукция изолятов ВГА людей в культуре клеток, обработанных субтоксическими дозами трипсина или желчи. Впервые проведена адаптация штамма ВГА ЯМ-55 в культуре клеток линии FBhk-4.
Теоретическое значение результатов работы определяется созданием новых перспективных направлений в изучении гепато-тропных вирусных инфекций. Более конкретно эти направления касаются неизвестных ранее проблем гепатита человека, вызванного вирусом фекальда-оральяого гепатита яи-А, ни-В, и заболевания низших обезьян Старого Света, этиологически связанного с вирусом, сходным с ВГА человека.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработаны и внедрены в практику лабораторных исследований упрощенные модифицированные методы выявления ВГА и антител против него для быстрой специфической диагностики ГА.
На основе использования методов выявления ВГА и антител против него получены новые объективные знания по эпидемиологии ГА, что в свою очередь может послукитъ основой для дальнейшей разработки более эффективных, рациональных и комплексных противоэпидемических мероприятий.
Разработана тест-система, позволяющая проводить специфическую диагностику фекально-орального гепатита ни-А, ни-В с помощью метода ИЭМ (Intervirology, 1985).
Создана возможность проводить моделирование фекально-орального гепатита ни А, ни В на яванских макаках (Вопросы вирусологии, 1986).
Выделен и охарактеризован штамм ВГА ЯМ-55, который успешно используется для накопления вирусной массы, пригодной для специфической диагностики ГА человека, и для моделирования этой ин-
- II - ,
фекции на яванских макаках, бурых макаках и африканских зеленых мартышках (Авторское свидетельство JS 1328376).
Из печени обезьян, зараженных штаммом ВГА ЯМ-55, получен значительный запас антигена ВГА, который используется для специфической диагностики ГА человека (акты о внедрении 1987).
Моделирование ГА на более доступных обезьянах, чем шимпанзе и маршзеты, создает реальную возможность интенсифицировать и расширить изучение патогенеза и иммуногенеза этой инфекции.
Штамм ВГА ЯМ-55, адаптированный к культуре клеток, внесен в Инструкцию по производству инактивированной вакцины против ГА в качестве прототипного штати.
Апробация работы состоялась на конференции межлабораторного Ученого совета по проблемам частной вирусологии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР 10 ноября 1987 года.
Материалы диссертации доложены на XIX и XX итоговых научных сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1981, 1985); Европейском конгрессе вирусологов (Мюнхен, 1979); рабочих совещаниях специалистов стран-членов СЭВ по проолеме "Вирусные гепатиты" (Рига, 1980; Ташкент, 1983); на совещаниях экспертов ВОЗ по вирусным гепатитам (Женева,1982, 1983, 1987); совещании в Региональном Бюро ВОЗ Юго-Восточной Азии (Дели, 1984); советско-французском симпозиуме по медицинской вирусологии (Москва, 1980); симпозиуме СССР-ФРГ по гепатиту А (Москва, 1984); всесоюзных конференциях по проблеме "Вирусные гепатиты" (Москва, 1984, 1987), заседании Бюро ОГМиЭ АМН СССР (Москва, 1987).
Публикация результатов исследований. Материалы проведенных исследований отражены в 57 пуоликациях.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 404 стра-
-и -
ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (трех глав), раздела собственных исследований (семи глав), обсуждения, выводов и списка литературы, диссертация содержит 33 таблицы и 63 рисунка. Библиографически! указатель включает 445 оте чественных и зарубежных источников.