Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Функционирование систем Polycomb/Trithorax 13
1.1. Белки Polycomb группы 13
1.2. Белки Trithorax группы 18
1.3. PRE/TRE-элементы 19
1.4. Роль белок-некодирующей транскрипции 24
1.5. Конкуренция между факторами PcG и TrxG 26
1.6. ДНК-связывающие факторы PRE/TRE 27
Глава 2. GAF – многофункциональный фактор транскрипции D.melanogaster 30
2.1. Структура GAF 30
2.2. Взаимодествие GAF и TrxG 32
2.3 Взаимодействие GAF и PcG 33
Материалы и методы 36
Глава 1. Методы работы с линиями мух 36
1.1. Линии и мутации D. melanogaster, использованные в работе 36
1.2. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях 36
1.3. Генетические скрещивания 37
1.4. Сбор эмбрионов 37
Глава 2. Методы работы с клетками E.coli 38
2.1. Штаммы E.coli, использованные в работе 38
Глава 3. Методы работы с ДНК 39
3.1. Выделение плазмидной ДНК 39
3.2. Рестрикция и лигирование ДНК 39
3.3. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле 39
3.4. Выделение фрагментов ДНК из геля 40 3.5. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 40
3.5.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы 40
3.5.2. ПЦР в реальном времени с использованием Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы 40
Глава 4. Методы работы с белками 42
4.1. Очистка белковых комплексов 42
4.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 42
4.3. Выделение ядерного белкового экстракта из эмбрионов для коиммунопреципитации 43
4.4. Коиммунопреципитация 43
4.5. Вестерн-блот анализ 43
4.6. Получение антител 4.6.1. Экспрессия и очистка антигенов 44
4.6.2. Аффинная очистка антител 44
4.6.3. Посадка белка на сефарозу 44
4.6.4. Аффинная очистка антител из сыворотки 46
4.6.5. Список антител, использованных в работе 46
Глава 5. Иммунопреципитация хроматина 48
Глава 6. Методы работы с дрожжевыми клетками 52
6.1 Дрожжевой штамм, использованный в работе 52
6.2 Плазмиды, использованные в работе 52
6.3 Трансформация дрожжевых клеток 54
Результаты 55
Глава 1. Идентификация белков, являющихся потенциальными факторами группы Polycomb D. melanogaster 55
1.1. Анализ факторов Polycomb/Trithorax выявленных при иммуноаффинной очистке комплекса GAF 55
1.1.1. Ассоциация GAF с белками группы Polycomb 56
1.1.2. Ассоциация GAF с белками группы Trithorax 59
1.2. Выявление прямых партнеров GAF 61
1.2.1. Партнёры GAF, содержащие BTB/POZ домен 61
1.2.2. Партнёры GAF, содержащие цинковые пальцы C2H2-типа 64
1.3. Выявление факторов с ДНК-связывающим доменом цинковые пальцы C2H2 типа, взаимодействующих с dSfmbt, Pho и E(z) белками группы Polycomb 68
Глава 2. Белок CG32767 - новый ДНК-связывающий фактор системы Polycomb
2.1. Получение поликлональных антител к белку CG32767 73
2.2. Белок CG32767 взаимодействует с белком dSfmbt in vivo 74
2.3. Выявление партнёров белка CG32767 в дрожжевой двугибридной системе 75
2.4. Выявление доменов взаимодействия между белками dSfmbt и CG32767 76
2.5. Выявление домена гомодимеризации белка CG32767 79
2.6. Белок CG32767 связывается с PRE-элементами генома D. melanogaster 80
2.7. Белок CG32767 связывается с последовательностью bxdPRE в составе трансгенной конструкции и колокализуется с другими факторами группы PcG 82
2.8. Белок CG32767 взаимодействует с последовательностью bxdPRE вне зависимости от статуса PRE-элемента и проходящей транскрипции 84
Обсуждение 86
Заключение 88
Выводы 90
Благодарности 91
Список литературы 92
- PRE/TRE-элементы
- Взаимодествие GAF и TrxG
- Генетические скрещивания
- Аффинная очистка антител из сыворотки
Введение к работе
Актуальность работы
Развитие многоклеточного организма требует установления и сохранения в дифференцированных клетках соответствующего паттерна экспрессии генов. В каждой ткани должны быть активны только определённые гены, другие, наоборот, должны быть зарепрессированы. Важную роль в эпигенетически наследуемом статусе экспрессии генов играют белки групп Polycomb (PcG) и Trithorax (TrxG). Было показано, что PcG и TrxG факторы являются консервативными белками высших эукариот, и нарушения их активностей связаны c разными социально значимыми болезнями человека.
На основании генетических скриннингов белки группы PcG были выявлены как репрессоры, белки группы TrxG как активаторы транскрипции генов. На молекулярном уровне группа TrxG представляет собой функционально-разрозненные факторы, входящие в различные комплексы. Среди них АТФ-зависимые комплексы ремоделинга хроматина, комплексы, модифицирующие гистоны, когезиновый комплекс, комплекс Медиатор и др.
Белки группы PcG D. melanogaster образуют многокомпонентные комплексы, основными из которых являются PRC1, PRC2 и PhoRC. Репрессия целевых генов осуществляется путём привлечения комплексов PcG на специфичные регуляторные области, получившие название Polycomb Response Element (PRE). Элементы PRE могут быть изолированы и использованы в качестве сайленсеров в трансгенных системах. Привлечение белков PcG на PRE-элемент приводит к установлению репрессионного домена, на протяжении которого происходит внесение гистоновой метки H3K27me3. За это отвечает комплекс PRC2, содержащий в своём составе метилтрансферазу E(z). В свою очередь, в состав комплекса PRC1 входит белок Pc, содержащий хромодомен, способный связываться с H3K27me3. Комплексы PRC1 и PRC2 не обладают ДНК-связывающей активностью. Способностью взаимодействовать с ДНК обладает фактор Pho, который совместно с белком dSfmbt составляет комплекс PhoRC. Исходя из этого, была предложена модель рекрутирования PcG на хроматин, согласно которой комплекс PhoRC взаимодействует с PRC2, вносящим метку H3K27me3, что ведёт к привлечению PRC1. Однако данная модель не способна объяснить все случаи образования репрессионных доменов. В некоторых случаях PRC1 и PRC2 могут привлекаться на хроматин независимо друг от друга и от PhoRC.
В ходе изучения структуры PRE-элементов удалось выяснить, что помимо сайтов связывания белка Pho в структуре PRE обнаруживаются сайты посадки других ДНК-связывающих факторов, таких как GAF, Psq, Grh, Dsp1, Adf1, Spps и пр. Однако ни один из факторов не связывается со всеми предсказанными PRE. Более того, для некоторых последовательностей PRE, необходимых для репрессии, факторы связывания не установлены. Предполагается, что в рекрутировании белков PcG на PRE-элемент участвует намного больше ДНК-связывающих белков, чем известно на сегодняшний день. Таким образом, в настоящее время актуален поиск новых факторов, участвующих в привлечении белков PcG на хроматин.
Другой актуальной в настоящее время задачей является определение роли проходящей транскрипции в функционировании элементов PRE. Ранее предполагалось, что транскрипция через PRE-элементы приводит к неспособности
факторов группы PсG взаимодействовать с ДНК. Однако недавно было обнаружено, что даже сильная непрерывная транскрипция не приводит к диссоциации протестированных белков PcG c ДНК. Влияние транскрипции на ассоциацию с PRE других факторов в настоящее время не изучено.
В данной работе были выявлены прямые партнеры факторов GAF, dSfmbt, E(z) и Pho системы PcG у D. melanogaster. Было продемонстрировано, что фактор CG32767, являющийся партнером белка dSfmbt, привлекается на ряд известных PRE-элементов и остаётся связанным с последовательностью bxdPRE в условиях проходящей транскрипции.
Цели и задачи исследования
Основной целью работы была идентификация новых факторов,
взаимодействующих с белками группы Polycomb D. melanogaster. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ иммуноаффинной очистки белкового комплекса GAF. Выявить факторы, относящиеся к группам Polycomb и Trithorax. Подтвердить взаимодействие белка GAF с рядом факторов группы Polycomb.
-
Провести поиск прямых партнеров белков GAF, dSfmbt, E(z) и Pho.
-
Для одного из выявленных факторов изучить взаимодействие с белком-партнером группы Polycomb.
-
Подтвердить ассоциацию выявленного белка с известными PRE-элементами.
-
Протестировать взаимодействие выявленного фактора и ряда других факторов групп PcG/TrxG с PRE-элементом в условиях проходящей через PRE транскрипции.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В работе впервые проведен детальный анализ интерактома белка GAF. Методом коиммунопреципитации подтверждена ассоциация GAF с факторами E(z), Su(z)12 (комплекс PRC2) и Adf1 группы Polycomb. Выявлены ранее не известные прямые партнёры фактора GAF, в том числе с ДНК-связывающими мотивами. Для фактора CG32767 с помощью дрожжевой двугибридной системы показана способность взаимодействовать c белками Pho, dSfmbt (комплекс PhoRC), E(z) (комплекс PRC2) и Sce (комплекс PRC1) группы Polycomb. Выявлены домены взаимодействия CG32767 с dSfmbt. Получены антитела к N- и C-части CG32767. Продемонстрировано, что CG32767 коиммунопреципитируется с dSfmbt. Установлено, что белок CG32767 привлекается на ряд известных PRE-элементов: en, bx, bxd и Fab7. Таким образом, обнаружен новый PRE-ассоциированный фактор. Кроме того, с использованием трансгенной системы показано, что CG32767, как и ряд других белков PcG и TrxG, остаётся связанным с последовательностью bxdPRE в условиях проходящей через PRE транскрипции.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики. В ходе выполнения диссертационной работы был использован широкий спектр методов, включающих методики экспрессии белков, получения и очистки антител, дрожжевой двугибридной системы, коиммунопреципитации белков, иммунопреципитации хроматина и другие.
Личный вклад соискателя
Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований. В ходе работы
автором проведены эксперименты по анализу взаимодействий факторов,
ассоциированных с GAF, dSfmbt, E(z) и Pho, методом дрожжевого двугибридного
скрининга. Выбранные взаимодействия подтверждены методом
коиммунопреципитации. Для выявленного фактора CG32767 были получены антитела. Установлены домены взаимодействия белков CG32767 и dSfmbt и CG32767 со своей второй копией. Протестировано взаимодействие белка CG32767 с некоторыми известными PRE-элементами. Установлено, что CG32767 остается ассоциированным с bxdPRE при проходящей транскрипции.
Положения, выносимые на защиту
-
Проведен анализ иммуноаффинной очистки белкового комплекса GAF. Выявлены факторы, относящиеся к группам Polycomb и Trithorax. Подтверждено взаимодействие GAF с факторами Adf1, E(z), Su(z)12 группы Polycomb.
-
Установлен ряд прямых партнеров белков GAF, dSfmbt, E(z) и Pho.
-
Изучено взаимодействие белка CG32767 c фактором dSfmbt группы Polycomb in vivo. Определены домены белков CG32767 и dSfmbt, необходимые для взаимодействия друг с другом.
-
Продемонстрировано, что CG32767 привлекается на известные PRE-элементы en, bx, bxd и Fab7.
-
Показано, что белок CG32767, как и ряд других факторов групп Polycomb и Trithorax, остаётся связанным с последовательностью bxdPRE в условиях проходящей через данный элемент транскрипции.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Результаты работы были представлены на трёх научных конференциях и опубликованы в трёх рецензируемых научных журналах (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»).
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, включая 16 рисунков и 8 таблиц. Список цитируемых литературных источников включает 225 наименований.
PRE/TRE-элементы
Комплекс PR-DUB (Polycomb repressive deubiquitinase) содержит белки Calypso и Asx [60]. Оба фактора подтверждены как PcG генетически. Белок Calypso проявляет деубиквитинилазную активность к гистону H2AK118. При взаимодействии с белком Asx каталитическая активность этого фермента значительно увеличивается [60]. Таким образом, данный комплекс способен убирать H2AK118ub, модификацию, катализируемую белком Sce. Значение одновременного присутствия убиквитиназы и деубиквитиназы в функционировании PcG системы не известно. Предполагается, что циклическое внесение и снятие модификации H2AK118ub необходимо для эффективной регуляции PcG-репрессии.
В составе комплекса PhoRC (Pho recognition complex) присутствуют белки dSfmbt и Pho [61]. dSfmbt содержит 4MBT-домен, способный взаимодействовать с метилированными лизинами N-концов гистонов H3 и H4 [61,62]. Pho – это наиболее изученный ДНК-связывающий белок группы PcG [16,17]. Его сайты связывания обнаружены во многих PRE-элементах и необходимы для функционирования PRE в трансгенных конструкциях [16,19,63-67]. dSfmbt и Pho в геноме колокализуются с белками PRC1 и PRC2 [9,22,67]. При этом Pho детектируется в области многих пиков связывания факторов Pc и Ph (50-96%) [23,24]. Оба белка необходимы для правильной экспрессии HOX-генов.
У D. melanogaster был найден белок Phol, гомолог Pho. Pho и Phol связываются с одинаковым сайтом ДНК [19]. Гомозиготные мутанты по Phol жизнеспособны и не проявляют гомеозисных трансформаций, однако одновременная инактивация Pho/Phol усиливает фенотипы Pho и дерепрессию HOX-генов. Оба фактора, Pho и Phol, напрямую взаимодействуют с dSfmbt, но, данные взаимодействия взаимно исключают друг друга [61]. Кроме того, Pho/Phol не всегда работают вместе: их геномное распределение отличается. Phol в меньшей степени колокализуется с PcG: только 21% точек связывания Ph/Pc содержат Phol [24]. И Pho и Phol напрямую взаимодействуют с факторами, входящими в состав других комплексов PcG. Для Pho показано взаимодействие с E(z) [18,61], Esc [18], Ph и Pc [68]; для Phol - с Esc [18]. Pho и Phol принимают участие в рекрутировании E(z) и Pc на последовательность bxdPRE из комплекса Bithorax (BX-C) [18]. Необходимо отметить, что одновременная инактивация Pho/Phol приводит к элиминированию связывания Pc, Psc, Scm, E(z) и Ph только на некоторых сайтах, что предполагает наличие дополнительных рекрутеров PcG [19].
С комплексами PhoRC [48] и PRC1 [45,48] может быть соочищен белок Scm. В экспериментах in vitro Scm способен напрямую взаимодействовать с Ph [69] и с dSfmbt [62]. Scm содержит 2MBT-домен, который, как и в случае с dSfmbt, способен взаимодействовать с метилированными лизинами N-концов гистонов [70]. В тоже время Scm не является коровым компонентом PRC1, PRC2, PhoRC in vivo [45,61,71,72] и рекрутируется на хроматин независимо от них [73]. Факторы, осуществляющие рекрутирование Scm на хроматин, пока не обнаружены.
Кроме описанных выше, известно еще несколько белков группы PcG, участвующих в репрессии гомеозисных генов: Sxc/Ogt [74]; Mxc [75], Dom [76], Crm [77]. Известно, что Sxc/Ogt является O-GlcNAc-трансферазой, способной модифицировать Ph [74].
Ряд факторов, по-видимому, имеет отношение к функционированию как PcG, так и TrxG систем: RYBP [78,79], Corto [80,81], E(Pc) [82,83], Lolal [84], Kto/Med12 и Skd/Med13 [85,86]. Показано, что искусственное рекрутирование фактора RYBP на трансген приводит к репрессии репортерного гена, зависящей от Pc, Sce, Pho факторов. Более того, сверхэкспрессия RYBP приводит к репрессии гена Ubx в части клеток имагинальных дисков жужжальца, где он в норме активен [78]. В другой работе было показано, что RYBP соочищается с белками Sce и Kdm2, но в тоже время RYBP взаимодействует с активатором Bre1 и в генетических тестах проявляет себя и как TrxG фактор [79]. Для фактора Corto показано, что он взаимодействует с E(z), Esc, Ph, Scm, GAF и колокализуется с данными белками на некоторых сайтах на политенных хромосомах [81]. В тоже время в генетических тестах Corto проявляет себя как PcG, так и TrxG фактор [80]. Факторы Kto/Med12 и Skd/Med13 исходно были обнаружены как супрессоры мутации Pc [85]. Однако в тоже время их мутации вызывают дерепрессию Ubx [86]. Kto/Med12 и Skd/Med13 являются компонентами репрессорного субмодуля Med12-Med13-Cdk8-CycC мультисубъединичного комплекса Mediator (комплекс Mediator – это многокомпонентный белковый комплекс, который связывается с CTD-доменом РНК-полимеразы II и передаёт сигналы от транскрипционных факторов к транскрипционной машине). В связи с тем, что Cdk8 и CycC не проявляют себя как факторы PcG генетически, предполагается, что участие Kto/Med12 и Skd/Med13 в функционировании PcG системы не зависит от ассоциации Cdk8-CycС компонентами комплекса Mediator [86].
К группе Trithorax (TrxG) относятся гены, мутации которых приводят к супрессии фенотипов PcG. Белки этого семейства TrxG представляют собой достаточно гетерогенную группу (рис. 1), в которую входят компоненты комплексов ремоделинга хроматина (Brm, Osa, Mor, Snr1, Kis), метилтрансферазы гистонов (Trx, Ash1), субъединицы комплекса Медиатор (Kto, Skd), субъединица когезинового комплекса (Vdt) и т.д.[87].
Идентифицированные генетически факторы TrxG – Osa, Brm, Mor, Snr1, входят в состав комплексов ремоделинга хроматина BAP (Brahma-associated proteins) и/или PBAP (polybromo-associated BAP) [88,89]. В состав обоих комплексов входят белки Mor [85,90], Snr1 [88,91] и ATФаза Brm [85,92-94]. Белок Osa является специфичным компонентом BAP комплекса [85,95]. Факторы Polybromo, BAP170 и SAYP являются субъединицами комплекса PBAP [88].
Белок Trithorax (Trx) представляет собой метилтрансферазу и метилирует четвертый лизин третьего гистона, отвечая за модификацию H3K4me1. Помимо Trx модификацию H3K4me1 осуществляет фактор Trx-related (Trr) [96]. Trx под действием Taspase 1 расщепляется на N- и C-концевые фрагменты [97], в результате которого каталитический SET-домен, необходимый для внесения H3K4me1, остается в Trx-C [96]. Показано, что в геноме распределение Trx-N и Trx-C отличается: локализация Trx-N хорошо коррелирует с активным хроматином, в то время как Trx-C колокализуется как с активным хроматином, так и с PcG факторами в неактивных локусах [24,98]. Ассоциация Trx-C каталитического фрагмента и с неактивными локусами не понятна. Вполне вероятно, что Trx функционально активен только при ассоциации с другими факторами, активирующими транскрипцию.
Взаимодествие GAF и TrxG
Ген white отвечает за пигментацию глаз, в геноме он находится под контролем тканеспецифичного энхансера, обеспечивающего высокую экспрессию гена white в глазах мух [211]. Уровень экспрессии гена white легко оценивать фенотипически по пигментации глаз. Пигментация глаз, зависящая от уровня экспрессии гена white, оценивается по следующей шкале: Кр – красный; тКор – темно-коричневый; Кор – коричневый; тОр – темно-оранжевый; Ор – оранжевый; тЖ – темно-желтый; Ж – желтый; сЖ – светло-желтый, Б – белый. Красная окраска соответствует пигментации глаз мух дикого типа (энхансер-зависимая экспрессия гена white); желтая и темно-желтая окраски представляют собой среднестатистическое проявление базовой пигментации (экспрессия гена white в отсутствие энхансера), белая окраска глаз наблюдается в отсутствие пигментации (у мух с инактивированным геном white), остальные окраски глаз соответствуют промежуточным уровням экспрессии гена white.
При репрессии гена white чаще всего наблюдается мозаичная окраска глаз, при которой фасетки окрашены по-разному.
Для анализа фенотипов трансгенных мух использовали самцов в возрасте 3-5 дней после вылупления, результаты сравнивали с контрольными мухами с известным фенотипом.
Анализ трансгенных линий на фоне экспрессии активатора транскрипции GAL4 Для повсеместной интенсивной экспрессии белка GAL4 использовали конструкцию Р [w; tubGAL4]117, в которой ген белка GAL4 расположен под промотором гена -тубулина84B. Проводили анализ трансгенных линий, гомозиготных по анализируемой конструкции. Встроенная конструкция UDTPRlox (К) находилась на второй хромосоме: F0: у11118; К/К; + X /, w1118; +; ТМЗ/+ F1: у11118; К/+; ТМЗ/+ X /, w1118; +/SM5; Р [w, tubGAL4]117/ТМ6 F2: /w1118; K/SM5; Р [w, tubGAL4]117/ТМЗ X /w1118; K/SM5; Р [w, tubGAL4]117/TM3 F3: w1118; К/К; P [w, tubGAL4]117/TM3
На чашки со средой для сбора эмбрионов (0,6% сахар, 25% сок, 2% агар, 1,5% нипагин) наносили суспензию дрожжей. Чашки помещали в специальную камеру с мухами и выдерживали 12 часов. С чашек эмбрионов смывали с помощью кисти на сито и промывали водой от дрожжей. Помещали эмбрионов на сите в 3% раствор гипохлорита натрия до полной дехорионизации эмбрионов. Быстро промывали 1 78 литром промывочного раствора (120мМ NaCl, 0,04% Triton X-100). Промывали дистиллированной водой до удаления остатков раствора гипохлорита натрия и промывочного раствора. Эмбрионов высушивали бумагой и взвешивали.
Для клонирования и наращивания плазмид в работе использовали штамм DH5 E.coli. Особенностью данного штамма является мутация гена recA1, что снижает рекомбинацию при клонировании плазмиды, и гена Endonuclease I. Для экспрессии белков использовали штамм BL21. В данном штамме нарушены гены протеаз lon и ompT для уменьшения протеолиза экспрессируемых белков
Клетки E.coli штамма DH5 высевали на чашки с твердой средой LB (1% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1% агар). Инкубировали при 37C в течение ночи. Пересевали 10 колоний в 5 мл среды SOB (2% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4). Инкубировали сутки на качалке при 18C, 180 об/минуту. 200 мкл суспензии переносили в колбу объемом 2 литра с 250 мл SOB. Инкубировали при 18C, 120 об/мин до OD600 около 0,6. Помещали клетки на 10 минут в лед. Центрифугировали 10 минут при 1200 g, 4C. Клетки ресуспендировали в 80 мл охлажденного TB-буфера (10 мМ MOPS pH 6,7, 15 мМ CaCl2, 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2). Инкубировали 10 минут во льду, затем центрифугировали 10 минут при 770 g. Клетки ресуспендировали в 20 мл TB-буфера, добавляли ДМСО до 7%. Инкубировали 10 минут во льду. Разливали в охлажденные 1,5 мл пробирки и замораживали в жидком азоте. Хранили при -70C. 58 3.1.4 Трансформация E. coli Компетентные клетки E.coli штамма DH5 размораживали на льду, добавляли 0,5-3 мкг плазмиды или лигазной смеси, выдерживали на льду 30 минут. Инкубировали при 42C 2 минуты, помещали в лед. Клетки высевали на чашки со средой LB с добавлением ампициллина до 0,01%. Глава 3. Методы работы с ДНК
Трансформированные необходимой плазмидой клетки E. Coli DH5, наращивали в 50 ml среды LB с ампициллином на качалке в течение ночи при 37С. Центрифугировали 4000 об/минуту при 4С 15 минут. Растворяли осадок в 4 мл буфера S1 (0,025M Tris-HCl pH8,0, 0,01M EDTA). Затем добавляли 4 мл буфера S2 (0,2M NaOH, 1% SDS), аккуратно перемешивали, инкубировали 5 минут при RT. Добавляли 5 мл холодного ацетата калия (2.8M, pH 5,2), встряхивали, инкубировали 10 минут при -20С. Центрифугировали 4000 об/минуту при 4С 20 минут, переносили супернатант в чистую пробирку. Добавляли 0.6-1 объёмов изопропанола. Центрифугировали 4000 об/минуту при 4С 15 минут. Осадок высушивали, растворяли в 1 мл AcNH4 (2M, pH 7,4). Центрифугировали 12000 об/минуту 10 минут. Супернатант переносили в свежую пробирку. Добавляли 0,85 мл изопропанола. Центрифугировали 12000 об/минуту 15 минут, удаляли супернатант. Осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали, удаляли супернатант. Высушивали осадок, растворяли в нужном объеме mQ.
Реакцию рестрикции проводили в коммерческом буфере, соответствующем используемым ферментам или паре ферментов. Для реакции использовали 1 – 5 мкг ДНК. Инкубировалась при оптимальной для фермента температуре (37 или 30C) 1 – 6 часов. После реакции полученные ДНК-фрагменты очищали с помощью гель-электрофореза.
Для лигирования использовали 10 – 100 нг ДНК плазмиды и 30 – 300 нг ДНК. Реакцию проводили с помощью T4 ДНК-лигазы. Инкубировали при комнатной температуре 1 – 2 часа.
Проводили электрофорез в 0,8-2% агарозном геле (в зависимости от размера разделяемых фрагментов) в буфере TAE (40 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА (pH 8.0), 20 мМ CH3COOH). Для этого смесь реакции смешивали с 6х раствором для нанесения на электрофорез в отношении 5:1. Состав буфера для нанесения материала ДНК на гель– электрофорез (6х): 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол, 60 мМ ЭДТА (pH 8.0), 60% глицерол, 10 мМ Tris-HCl (рН 7.6). Дополнительно в качестве маркера длин фрагментов ДНК на агарозный гель наносили GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Mix #SMO331 (Fermentas) или ДНК, обработанную рестриктазой PstI бактериофага І. Для визуализации ДНК в агарозный гель добавляли бромистый этидий (с итоговой концентрацией в геле 0,2 нг/мл). После проведения электрофореза флуоресценцию бромистого этидия в ультрафиолете документировали при помощи переносной цифровой фотокамеры.
Генетические скрещивания
Для проведения трансформации штамма Pj69-4A ставили ночную культуру клеток в 10мл жидкой среды YPD (2% бактопептон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза) в термостатированной качалке при 250-300 об/мин и температуре 30С. На следующий день 5 мл культуры разбавляли в 10 раз средой YPD и выращивали 3 часа при тех же условиях. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 g, 1 минуту, удаляли супернатант, к осадку добавляли 20 мл 0,1 М ацетата лития, инкубировали 30 минут на качалке. Далее клетки снова центрифугировали, отбирали супернатант и добавляли 1,5 мл 0,1 М ацетата лития и ресуспендировали. К 30 мкл суспензии клеток добавляли 270 мкл 50% PEG 3380, 36 мкл 1 М ацетата лития и по 0,4-0,8 мкг каждой плазмиды для котрансформации. Смесь ресуспендировали и инкубировали в качалке при 30С, 30 минут. Затем инкубировали на 42С 2 минуты. Центрифугировали при 3000 g, 30 секунд, удаляли супернатант. К осадку добавляли 200 мкл деионизованной воды (mQ), ресуспендировали и высевали на чашку с селективной средой «-2» (0,67% дрожжевая среда без аминокислот, 1,5% агар, 2% глюкоза, 0,030% L-изолейцин, 0,015% L-валин, 0,002% L-аргинин, 0,002% L- хлорид моногидрат гистидина, 0,003% L- хлорид лизина, 0,002% L- метионин, 0,005% L-фенилаланин, 0,02% L-треонин, 0,003% L-тирозин, 0,002% урацил, 0,002% сульфат аденина). Чашки помещали в термостат 30С на двое-трое суток, до появления отдельных колоний. Выросшие колонии пересевали истощающим штрихом на чашки с селективной средой «-3» (0,67% дрожжевая среда без аминокислот, 1,5% агар, 2% глюкоза, 0,030% L-изолейцин, 0,015% L-валин, 0,002% L-аргинин, 0,003% L- хлорид лизина, 0,002% L-метионин, 0,005% L-фенилаланин, 0,02% L-треонин, 0,003% L-тирозин, 0,002% урацил, 0,002% сульфат аденина) с добавлением специфического ингибитора продукта гена HIS3 3-амино-1,2,4-триазола (3 АТ) и на среду «-4» (то же, что и «-3», но без добавления сульфата аденина). Выращивали дрожжи в термостате на 30С в течение 1 недели. Уровень роста колоний на чашках оценивали визуально. РЕЗУЛЬТАТЫ
Polycomb-зависимая регуляция транскрипции генов D. melanogaster, как правило, опосредуется через цис-действующие элементы генома, получившие название Polycomb Response Elements (PRE) [5-7]. PRE-элементы содержат сайты посадки разных ДНК-связывающих белков и рекрутируют комплексы группы Polycomb, которые осуществляют репрессию генов [1,4-6,26]. C PRE-элементами также взаимодействуют и комплексы группы Trithorax, ответственные за активацию [126-132].
PRE являются модулируемыми элементами и активность, по крайней мере, некоторых из них может быть переключена с репрессии на активацию. Факторы групп Polycomb и Trithorax являются антагонистами: обладают функционально противоположными активностями. Предполагается, что конкуренция между группами Polycomb и Trithorax определяет результирующую активность PRE. Однако механизмы контроля активности PRE и рекрутирования белков групп Polycomb/Trithorax не известны.
Предполагается, что ДНК-связывающие факторы действуют кооперативно, вместе привлекая комплексы Polycomb/Trithorax на хроматин. Одним из наиболее изученных ДНК-связывающих факторов PRE D. melanogaster является фактор GAF. Показано, что белок GAF связывается с PRE-элементами in vitro и in vivo, и важен для репрессирующей активности PRE [24,64,67,120,206]. Среди известных партнеров GAF есть представители как групп Polycomb [206,208,209], так и Trithorax [203,205]. В связи с этим он является хорошей мишенью для поиска других ДНК-связывающих факторов PRE, в кооперации с которыми белок GAF может в частности участвовать в рекрутировании комплексов систем Polycomb/Trithorax на ДНК PRE.
Иммуноаффинная очистка комплекса GAF была проведена нашими коллабораторами из Лаборатории Регуляции Экспрессии Генов в Развитии Института Биологии Гена ФГБУН РАН. Ядерный экстракт был получен из 0-12 часовых эмбрионов линии мух дикого типа и инкубировался с поликлональными антителами против GAF (изоформы, включающей 519 аминокислот), сшитыми с Cефарозой-A. После процедуры отмывки связавшиеся белки были элюированы с использованием 0,1 М глицина при рН 2,5 и проанализированы с помощью масс-спектроскопии. В ходе работы были сделаны три биологические повторности. В качестве контроля неспецифического связывания параллельно были поставлены эксперименты с инкубированием ядерного экстракта с Cефарозой-А без добавления антител к белку GAF.
В результате был идентифицирован 2421 белок, встречающийся, по крайней мере, в одной очистке. Из них – чуть менее половины: 1202 белка, присутствовали во всех трёх повторах. Из этой выборки уровень значимости р 0,05 имели 903 белка. Анализ показал, что в иммунопреципитате GAF присутствует большое количество известных партнеров GAF. Это представители комплексов Polycomb/Trithorax, ремоделлеров хроматина, факторов, участвующих в элонгации транскрипции и в экспорте мРНК. В дальнейшей работе был проведен подробный анализ присутствия белков Polycomb/Trithorax-групп среди идентифицированных партнёров GAF.
Основными комплексами группы Polycomb являются комплексы PRC2, PRC1 и PhoRC. Анализ белков иммунопреципитата показал, что все коровые компоненты комплекса PRC2 присутствуют всех во всех трёх повторах очисток (табл. 4). Ранее в эксперименте по коиммунопреципитации белков (co-IP) было продемонстрировано взаимодействие GAF c белком Esc PRC2 [209]. В нашей работе методом co-IP была дополнительно подтверждена ассоциация GAF с субъединицами E(z) и Su(z)12 комплекса PRC2. Для этого был проведён Вестерн-блот анализ иммунопреципитата GAF, используя антитела к E(z) и Su(z)12 (рис. 4).
Аффинная очистка антител из сыворотки
Для выявления дополнительных партнеров CG32767 среди белков группы Polycomb в дрожжевой двугибридный анализ были включены компоненты комплекса PhoRC: Pho, dSfmbt; PRC1: Sce, Pc, Scm; PRC2: E(z), Esc, Su(Z)12 (рис. 12). Данные факторы были соединены либо с ДНК-связывающим (BD), либо с активационным доменом (AD) GAL4. Соответственно в эксперименте они использовались, либо с BD-CG32767, либо с AD-CG32767. Было показано, что белок CG32767 в дрожжевом двугибридном анализе способен взаимодействовать с представителями всех трех комплексов. С факторами Pho, dSfmbt комплекса PhoRC; с Sce комплекса PRC1; с E(z) комплекса PRC2. Факт наличия взаимодействий с представителями разных комплексов PcG свидетельствует о возможности участия фактора CG32767 в независимом привлечении данных комплексов на хроматин. Сходная ситуация была ранее продемонстрирована и для фактора Pho PhoRC комплекса. Было показано, что Pho может напрямую взаимодействовать с dSfmbt [61], E(z) [18,61], Esc [18], Ph и Pc [68]. Рис. 12. Выявление прямых партнёров белка CG32767 среди белков PcG. Показаны результаты взаимодействия в дрожжевой двугибридной системе белка CG32767 и белков PcG. НА – рост колоний на данной среде не анализировался. Остальные обозначения как на рис. 8.
Для определения доменов белков, необходимых для взаимодействия между белками dSfmbt и CG32767, были получены производные dSfmbt – с 377 по 980 а.о., включающую 4МВТ-домен; и с 981 по 1219 а.о., включающую С-концевой SAM-домен (рис.7), слитые с активационным или со связывающим доменами GAL4 (рис. 13). Эти части были проанализированы на способность взаимодействовать с полноразмерным белком CG32767 (16-1239 а.о.) в дрожжевой двугибридной системе. В результате только часть, включающая 4МВТ-домен, показала взаимодействие. Кроме того, продемонстрировано, что полноразмерный dSfmbt (1-1219 а.о.), находящийся в рамке считывания с AD доменом GAL4 также способен взаимодействовать с белком CG32767. Исходя из этого результата, была получена производная фактора dSfmbt с 536 по 975 а.о, исключающая небольшой фрагмент перед 4МВТ-доменом. Было показано, что данная производная так же способна взаимодействовать с полноразмерным белком CG32767. Таким образом, за взаимодействие с белком CG32767 отвечает 4МВТ-домен белка dSfmbt, который, как известно, отвечает и за взаимодействие с фактором Pho [222].
Следующим шагом стало картирование минимального района белка CG32767, необходимого для взаимодействия с dSfmbt. Был получен фрагмент белка CG32767 с 16 по 888 а.о., имеющий делецию 352 а.о. на С-конце белка, слитый с AD и BD доменами GAL4 (рис. 13). С данными производными при котрансформации с 4МВТ-доменом dSfmbt рост дрожжей отсутствовал, что говорит о том, что в данном фрагменте была удалена важная для взаимодействия часть CG32767. В тоже время С-концевая область CG32767 с 699 по 1239 а.о. (слитая с AD и BD доменами GAL4), захватывающая часть белка от цинковых пальцев до последнего а.о., была способна взаимодействовать с 4МВТ-доменом dSfmbt. При сокращении 699-1239 аа области CG32767 с N-конца были получены производные – 800-1239 а.о., 900-1239 а.о., 1000-1239 а.о. Данные варианты проявляли взаимодействие с 4МВТ-доменом dSfmbt в случае объединения с BD доменом GAL4 на среде -4 (среда без добавления триптофана, лейцина, гистидина и аденина). Дополнительно были получены еще производные области 699-1239 а.о., 699-1004 а.о., содержащие делеции различной длины с С-конца. Только производная 699-1126 а.о. была способна взаимодействовать с 4МВТ-доменом dSfmbt в случае объединения с АD доменом GAL4. Исходя из этих результатов, была получена производная CG32767 с 1000 по 1126 а.о., показавшая взаимодействие с 4МВТ-доменом dSfmbt в случае объединения с BD доменом GAL4. Таким образом, минимально картированный район белка CG32767, отвечающий за взаимодействие с белком dSfmbt – это район с 1000 по 1126 а.о.
Выявление доменов взаимодействия белков CG32767 и dSfmbt. Показаны результаты взаимодействия в дрожжевой двугибридной системе фрагментов белков CG32767 и dSfmbt. Обозначения как на рис. 8. Результаты, отмеченные получены с использованием среды -3+20mM 3AT
Было показано, что важным свойством некоторых транскрипционных факторов является способность к гомодимеризации [223,224].
Для того чтобы выяснить способен ли CG32767 к гомодимеризации, полноразмерный клон (16-1239 а.о.) соединенный с активирующим доменом GAL4 (AD) был котрансформирован с таким же фрагментом соединенным с ДНК-связывающим доменом GAL4 (ВD). В результате эксперимента было показано, что полноразмерные последовательности CG32767 способны к гомодимеризации (рис. 14). Для дальнейшей работы был использован фрагмент CG32767 с 16 по 888 а.о. Данный фрагмент не участвовал во взаимодействии с 4МВТ-доменом dSfmbt, однако, был способен взаимодействовать с полноразмерным CG32767. Для более точного картирования гомодимеризующего домена была сделана серия делеционных производных CG32767, путём сокращения С-конца белка – 16-494 а.о. и 16-397 а.о. Интересно, что обе эти производные показали взаимодействие с полноразмерным белком CG32767.
Для подтверждения полученных результатов данные делеционные производные были проверены на предмет взаимодействия друг с другом. Обе производные были способны взаимодействовать друг с другом. Кроме того, при трансформации дрожжевых клеток плазмидами, одна из которых несла минимальный фрагмент 16-397 а.о., слитый с активирующим доменом GAL4 (AD), а другая – этот же фрагмент, но слитый с ДНК-связывающим доменом GAL4 (ВD), на селективных средах наблюдался рост колоний. Это говорит о том, что фрагмент 16-397 а.о. в дрожжевой двугибридной системе способен взаимодействовать с самим собой. Можно сделать вывод, что для гомодимеризации белка CG32767 важен район 16-397 а.о.
Для того чтобы выяснить связывается ли фактор CG32767 c PRE-элементами в геноме D. melanogaster , методом иммунопреципитации хроматина было проанализировано обогащение белка CG32767 на ряде известных PRE-элементов в ядерном экстракте на эмбриональной и личиночной стадиях развития (рис. 15).
В качестве исследуемых PRE-элементов выступали области en- [22], bx-, bxd- и Fab7PRE [8]. В качестве положительного контроля был использован белок dSfmbt, ассоциированный с данными PRE [9,61]. По результатам эксперимента было выявлено, что белок CG32767 присутствует на всех анализируемых PRE-элементах на обеих стадиях развития. Эти данные согласуются с возможной ролью фактора CG32767 в привлечении PcG-комплексов на хроматин.