Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Парвовирусы (обзор литературы) 8
1.1. Вирусы семейства Parvoviridae 8
1.2. Вирус алеутской болезни (Aleutian disease virus, ADV) 9
1.2.1. Общая характеристика вируса 9
1.2.2. Физико-химические и антигенные свойства 16
1.2.3. Геном ADV: организация, репликация, изменчивость 17
1.3. Способы диагностики вируса 19
Глава 2. Материалы и методы 23
2.1. Вирусный материал 23
2.2. Получение препарата ADV-DV (дальневосточный изолят) 23
2.3. Электронная микроскопия 24
2.4. Очистка ДНК 24
2.5. Электрофорез вирусных белков в ПААГ 26
2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 26
2.7. Получение кроличьей антисыворотки к ADV 27
2.8. Выделение IgG из сыворотки крови норки 27
2.9. Мечение IgG и вирионов ADV ,251 28
2.10.-Реакция двойной иммунодиффузии 29
2.11. Встречный иммуноэлектрофорез 29
2.12. Ракетный иммуноэлектрофорез 30
2.13. Радиоиммунный анализ 30
2.14. Полимеразная цепная реакция 31
2.15. Дот-блот гибридизация ДНК 31
2.16. Секвенирование ПЦР-фрагментов 33
2.17. Анализ генетических данных 34
Глава 3. Результаты исследований 35
3.1. Морфологические свойства ADV-DV 35
3.2. Структурные полипептиды ADV-DV 38
3.3. Иммунохимический анализ капсидных белков 38
3.4. Молекулярно-генетическая характеристика ADV-DV 41
3.4.1. Вирусная нуклеиновая кислота 41
3.4.2. Амплификация гена капсидного белка Vp2 41
3.4.3. Секвенирование генома ADV-DV и филогенетический анализ штаммов вируса 42
Глава 4. Разработка методов диагностики ADV-DV 52
4.1 Выявление методом встречного иммуноэлектрофореза 52
4.2. Радиоиммунные методы детекции 53
4.3. Выявление методом ПЦР 57
4.4. Выявление методом дот-блот гибридизации ДНК 58
Глава 5. Обсуждение результатов 61
Выводы 72
Список литературы 74
- Вирус алеутской болезни (Aleutian disease virus, ADV)
- Получение препарата ADV-DV (дальневосточный изолят)
- Секвенирование генома ADV-DV и филогенетический анализ штаммов вируса
- Выявление методом дот-блот гибридизации ДНК
Введение к работе
Актуальность темы. Норки {Mustela vison Shreb., американская норка) являются хозяевами для большого числа вирусов из-за их постоянного контакта с источниками и природными резервуарами возбудителей. При клеточном содержании на фермах наиболее часто их инфицируют два парвовируса норок (алеутской болезни (ADV) и энтерита (MEV) (семейство Parvoviridae) и морбилливирус чумы плотоядных (CDV) (семейство Paramyxoviridae) (Литвинов, Яременко, 1998). В конце 90-х гг. в трех пушных зверохозяйствах Приморского края были зарегистрированы случаи массового падежа норок (особенно щенков). Результаты вскрытия павших животных и эпидемиологические данные указывали на вирус алеутской болезни. К тому же, в сыворотке крови животных были обнаружены антитела к ADV (Минская и др., 2000), однако они могли являться поствакцинальными антителами. Было сделано предварительное заключение, что наиболее вероятным возбудителем является ADV. Требовалось провести видовую идентификацию вируса, определить его патогенность.
Алеутская болезнь норок - контагиозное заболевание пушных зверей. Высокая восприимчивость животных и устойчивость вируса во внешней среде способствуют массовой смертности зверей, доходящей в некоторых случаях до 100% как за рубежом (Bloom et al., 1994), так и в России (Михеев, 2003), обуславливая значительный экономический ущерб пушному звероводству. Для вируса характерна высокая скорость изменчивости (Gottschalck et al., 1991; Olofsson et al., 1999). Показано, что единичные аминокислотные замены в его капсидных белках способны значительно влиять на патогенные свойства штаммов вируса (Oie et al., 1996; Stevenson et al., 2001). В связи с этим, отнесение впервые выявленного на юге Дальнего Востока изолята ADV к группе штаммов определенной патогенности - одна из важных задач при изучении вируса. Это позволит прогнозировать будущие вспышки, будет способствовать снижению экономического ущерба и разработке мероприятий по исправлению эпидемиологической ситуации на звероводческих фермах края.
Литературные данные свидетельствует о достижении значительных успехов в изучении ADV. Однако, до сих пор не разработаны специфические средства защиты животных от инфицирования вирусом, что во многом обусловлено особенностями его биологии. Предложенные вакцины малоэффективны, так как вирионы не нейтрализуются антителами, а циркулируют в виде инфекционного иммунного комплекса. До настоящего времени основным средством контроля заболевания, вызываемого ADV, остается выбраковка и изоляция пораженных животных, эффективность которой необходимо повышать, благодаря использованию современных молекулярно-генетических методов, таких как радиоиммунный анализ, полимеразная цепная реакция, гибридизация нуклеиновых кислот, которые основаны на выявлении следовых количеств вируса. Однако, учитывая, что ADV - не изученный вирус на Дальнем Востоке России, отсутствие данных об антигенных свойствах его капсидных белков и молекулярно-генетических характеристик не позволяет разработать эффективные диагностические тест-системы.
Необходимо отметить, что исследование парвовирусов отстает от аналогичных исследований других вирусов. Во многом это определяется их мелким размером, сложностью культивирования, сильной зависимостью репликации от клетки. Практически отсутствуют сведения об их антигеном родстве. Расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов менее половины всех известных парвовирусов. Поэтому, о происхождении и эволюции этих видов известно очень мало. Учитывая выше сказанное, а также то, что парвовирусы представляют угрозу для многих животных и, возможно, для человека, их изучение представляется актуальным и своевременным.
Цель работы состояла в изучении структурно-морфологических, иммунохимических и молекулярно-генетических особенностей возбудителя алеутской болезни норок - ADV, циркулирующего в зверосовхозах Приморского края и разработке методов нового поколения для его диагностики.
Для этого необходимо было решить следующие задачи: получить очищенный препарат вируса; дать характеристику морфологии вирионов дальневосточного изолята; изучить основные физико-химические свойства капсидных белков и нуклеиновой кислоты; получить поликлональные антивирусные сыворотки от кроликов и норок и выявить антигенные особенности капсидных белков изолята; определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего структурный белок Vp2; установить филогенетические связи между изолятом и штаммами вируса, выявленными в других географических регионах ранее; отработать методики радиоиммунных методов для диагностики ADV; разработать тест-системы диагностики ADV на основе ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот.
Вирус алеутской болезни (Aleutian disease virus, ADV)
В 1941 г. на одной из звероводческих ферм штата Орегон (США) была выведена разновидность норки с серо-голубой окраской меха. Породу назвали алеутской. В течение нескольких лет среди норок новой породы начали замечать признаки заболевания, заканчивающегося гибелью животных (Trautwein, Seidler, 1972; Trautwein, Schneider, Ernst, 1974). Первое описание подобному заболеванию дано Г. Хартсоу и Дж. Горхам, которые назвали его алеутской болезнью (Цит. по Gorham et al., 1976).
Интенсивный обмен племенными животными способствовал распространению заболевания среди норководческих хозяйств не только США (Yoon et al., 1975; An, Ingram, 1977; Trautwein et al, 1979), но и других стран мира—Англии, Дании, Канады, Голландии, Германии, Польшы, Скандинавских стран, Японии и др. (Itakura, 1970; Norton, 1970; Tabel, Ingram, 1970; Konrad, Nevole, 1971;Osetowska, 1971;Trautwein, 1972; Porter etal., 1972,1973;Fuccillo et al., 1974; Gordon, 1974; Henson, Gorham, 1974; Henson, Crawford, 1974; Munoz etal, 1974; Porter, Larsen, 1974; Sterzl, 1974; Larsen, Porter, 1975; Motohashi, 1975; Bazeley, 1976; Henson, et al., 1976; Notani et al., 1976; An et al, 1978; An, Ingram, 1978; Muller-Peddinghaus etal., 1980; Porter etal., 1980;Gudnadottir, 1981;Botner, Jorgensen, 1983; Onions, 1983; Ingram, Cho, 1984; Yamaguchi, Macdonald, 2001; Moorman-Roest, 2005).
В СССР АБН впервые была описана И.А. Будиновым с соавт. в 1967 г., хотя В.А. Панков чуть ранее (1965 г.) зарегистрировал ее у норок в зверохозяйствах Европейской части СССР после ввоза в страну цветных норок (Дукур и др., 1973; Сюрин и др., 1991; Слугин, 2002). На территории России это заболевание норок встречается повсеместно, поражая в отдельных хозяйствах до 100% поголовья (Михеев, 2003).
Длительное время причиной болезни считали наследственный фактор и отмечали повышенную восприимчивость к ней норок, носителей рецессивного «алеутского» гена (Hadlow et al., 1972). Норки с гомозиготным рецессивным геном окраски меха «аа» (алеутские, сапфировые, голубые) характеризуются частичным альбинизмом, фотофобией, повышенной восприимчивостью к бактериальным инфекциям (Ryan et al., 1979) и смертностью (Lodmell et al., 1973; Nordstoga, Naess, 1973; Bloom et al., 1975; Johnson et al., 1975; Cho, 1977; Henry, 1979; Hadlow etal., 1983,1984,1985; Larsen etal., 1984; Haas etal., 1990). Еще в 1964 г. при выяснении роли наследственности в этиологии и патогенезе алеутской болезни была установлена достоверная разница в частоте случаев заболевания между алеутскими и стандартными норками (Cho, Ingram, 1873). Так, у алеутских и сапфировых норок болезнь протекает более остро, чем у стандартных (Allison, 1970; Borecky, 1980). Тем не менее, в исследованиях К. Танг не установлено статистически достоверного различия в количестве заболевших зверей темного и голубого окраса, но подчеркивается более быстрая гибель голубых норок (Tung et al., 1981). В последующих исследованиях многократно показано влияние рецессивного гомозиготного гена окраски на тяжесть заболевания, но не на восприимчивость их к вирусу (Race et al., 1983; Berns,Labow, 1987; Alexandersen etal., 1994).
Впервые вирусная этиология заболевания была установлена после успешных попыток экспериментального заражения норок с различной окраской меха гомогенатами из органов павших зверей (Bloom et al, 1975). В настоящее время вирус алеутской болезни (Aleutian disaese virus (ADV), синоним вирус алеутской болезни норок {Aleutian mink disaese virus (AMDV)) классифицирован в род Parvovirus семейства Parvoviridae (Fauquet et al., 2005).
Круг восприимчивых хозяев. Помимо норок, вирус способен бессимптомно персистировать в организме диких (лисицы, песцы, соболя, кролики, ласки, хорьки, куницы, барсуки, росомахи) и домашних (собаки, кошки) животных, не теряя патогенности для норок (Eklund et al., 1968; Eklund, Hadlow, 1973; Russell, Percy, 1974; Daoust, Hunter, 1978; Ohshima et al., 1978; Porter etal., 1982;Alexandersenetal., 1985; Van Hilleetal., 1989; Porter etal., 1990; Oxenham, 1992; Palley etal., 1992; Stewart, Rozengurt, 1993; Welchman etal., 1993; Saifuddin, Fox, 1996; Динец, Ротшильд, 1998; Une et al., 2000; Скуматов, Бельтюкова, 2002; Fournier-Chambrillon et al., 2004). Специфические антитела к ADV выявлены у выдр (Wells et al., 1989; Manas et al., 2001), скунсов и енотов (Oie etal., 1996).
В экспериментальных условиях путем введения вируссодержащей суспензии в мозг и внутрибрюшинно удается заразить сосунков белых мышей, хлопковых крыс и других животных. Тем не менее, после заражения только у хорьков и соболей обнаруживали противовирусные антитела и развитие характерных поражений органов; у скунсов, лисиц, песцов - только образование противовирусных антител (Зуев, 1988).
Окончательно не решен вопрос о патогенности ADV для человека. Во многом опубликованные данные носят противоречивый характер. У человека единично описано заболевание с клиническими признаками АБН (Eklund, Hadlow, 1973). Однако другие исследователи считают данный случай алеутской болезни ошибкой (Porter, Larsen, 1974). В 1974 г. проведено сравнительные обследование крови двух групп людей на наличие противовирусных антител. Были использованы сыворотки 23 человек, подвергавшихся повторному риску заражения ADV (работники ферм, ветеринарные врачи) и 23 человек, никогда не контактировавших с живыми норками и хорьками. Результаты показали отсутствие противовирусных антител в сыворотке лиц как одной, так и другой групп обследованных. Однако в другом исследовании показано, что фермеры и рабочие лабораторий имеют антитела к ADV (McGuire, Crawford, 1980). По всей видимости, данная проблема требует проведения дальнейших исследований с использованием современных технологий выявления AT и АГ.
Получение препарата ADV-DV (дальневосточный изолят)
Препарат частиц ADV-DV получали методом дифференциального центрифугирования (Остерман, 1981) с учетом рекомендаций (А.с. № 2052995, 1996): 1. 50 г органов инфицированных норок (селезенка, почки, печень) гомогенизировали в буферной системе (50 мМ трис-НС1,0.15 М NaCl, рН 7.2), содержащей l%NP-40,1 мМ фенилметил сул ьфонил фторида, 1% дезоксихолата натрия, в соотношении 1/10. Гомогенат подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию с последующей ультразвуковой обработкой в течение 60 с при частоте 22 кГц/с на аппарате Ultrasonic disintegrator type UD- 20. 2. Неразрушенные клетки удаляли низкоскоростным центрифугированием в течение 20 мин при 2200 g, 10 С. К супернатанту добавляли 10% ПЭГ в присутствии 0.1 М NaCl для осаждения иммунных комплексов с последующим уплотнением их низкоскоростным центрифугированием в течение 30 мин при 10000 g, 10 С. 3. Осадок растворяли в минимальном количестве буфера TNE (10 мМ трис-НС1, рН 7.4, 0.1 М NaCl, 1 мМ натриевой соли ЭДТА, 0.05% NP-40) в течение ночи при 4 С. Осаждали вируссодержащие комплексы одним циклом дифференциального центрифугирования (160000 g, 2.5 ч, 10 С, далее три экстракции с последующим центрифугированием при 4000 g, 10 мин, 10 С). 4. Для диссоциации иммунных комплексов к вируссодержащей суспензии добавляли равный объем НСІ-глицинового буфера (0.05 М глицин, 0.2 н НСІ до рН 2.4). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре. 5. Вирусные частицы концентрировали высокоскоростным центрифугированием (160000 g, 2.5 ч, 10 С) через слой 20%-ной сахарозы, составляющей 1/7 объема пробирки. 6. Очистку вируса от сопутствующих белков и ферритина осуществляли гельхроматографией на сефарозе 6В (Serva, США) в щелочной среде карбонатного буфера (0.15 М Na2C03, 0.35 М NaHC03, рН 9.6). Концентрацию белка в элюатах определяли спектрофотометрически и рассчитывали по формуле (Бейли, 1965): где, К - концентрация вируса, Е260 и E2g0 - значения оптических плотностей вируссодержащей суспензии при длинах волны 260 и 280 нм, соответственно. Для электронномикроскопического исследования вирионов применяли метод негативного контрастирования (Уикли, 1975).
Сеточки, покрытые формваровой (0.3-1.0%-ный раствор поливинилформаля в дихлорэтане), либо коллодиевой (1.5-2.0%-ный раствор нитроцеллюлозы в амилацетате) пленкой, опускали в каплю препарата вируса на 4-5 мин, промывали в дистиллированной воде и погружали в 2%-ный водный раствор уранилацетата (рН 4.0) (Sigma, США) на 30 с или контрастировали 2%-ным раствором фосфорновольфрамовой кислоты (рН 6.0-7.5) в течение 2-3 мин. После отмывания сеточки в дистиллированной воде сушили и просматривали в электронном микроскопе JEOL- JEM 100 В. Выделение ДНК ADV-DV осуществляли согласно методике А. Мешкова с соавт. (1989) в нашей модификации: 1. 300-400 мкг вируса по белку суспендировали в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трисгНСІ, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА) с добавлением NaCl до 0.1 М. Вирионы разрушали добавлением N-лаурилсаркозила до 1% и проназы Р до 0.5 мг/мл. Инкубировали раствор в течение 2 ч при 37 С. 2. ДНК экстрагировали равным объемом фенола (насыщенного ТЕ), содержащего 0.2% 2-меркаптоэтанола и 0.1% ортооксихинолина. Раствор эмульгировали, фазы разделяли центрифугированием в течение 10 мин при 10000 g. Водную фазу последовательно очищали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (соотношение 25:24:1) и хлороформом с изоамиловым спиртом (соотношение 24:1). 3. К водной фазе добавляли 1/10 часть З М ацетата натрия (рН 5.4). ДНК осаждали равным объемом изопропанола и оставляли при -20 С на 1-2 ч. Вирусную нуклеиновую кислоту собирали центрифугированием в течение 20 мин при 16000 g. Осадок промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ. Выделение суммарной клеточной ДНК из органов норок проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984): 1.100 мг ткани растирали с добавлением 1.2 мл лизирующего буфера (0.1 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8.0, 25 мМ ЭДТА, 0.5% ДСН, протеиназа К до концентрации 0.1 мг/мл). Гомогенат инкубировали в течение часа при 37 С. 2. Депротеинизацию материала осуществляли последовательно экстракцией равным объемом фенола, затем фенолом с хлороформом и чистым хлороформом. Под «хлороформом» понимается смесь хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1. Фазы разделяли центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. 3. Нуклеиновые кислоты осаждали равным объемом изопропанола, промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ. Освобождение ДНК от РНК производили следующим образом: 1. К 100 мкл препарата нуклеиновых кислот добавляли 5 мкг РНКазы А и инкубировали при 37 С 1 ч. 2. Добавляли равный объем фенола и хлороформа, эмульгировали. Фазы разделяли центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. Экстракцию хлороформом повторяли. 3. ДНК осаждали равным объемом изопропанола, промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в ТЕ. Электрофоретический анализ вирусспецифических полипептидов осуществляли в ПААГ в присутствии ДСН в аппарате для вертикального электрофореза (Атабеков (ред.), 2003). ПААГ содержал 12% акриламида, 0.37% МДчГ-метиленбисакриламида, 1% ДСН, и в качестве инициаторов полимеризации - 0.75% персульфат аммония и 0.05% Т\Г,М,Щ -тетраметилэтилендиамина. Электрофорез проводили при напряжении ПО В в трис-глициновой буферной системе (0.192 М глицин, 0.025 М трис, рН 8.34, 0.1 % ДСН) при комнатной температуре. Для построения калибровочной прямой в качестве белков-стандартов использовали М (м. м. 225 кДа), БСА (м. м. 68 кДа), ОА (м. м. 45 кДа), ХТГ (м. м. 25.7 кДа). Подготовку проб осуществляли смешиванием 10 мкл вирусного препарата с двойным объемом диссоциирующего буфера (0.06 М трис-HCl, рН 6.8, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 0.05% 2-меркаптоэтанол, 2% ДСН, 0.002% БФС). Пробы выдерживали на кипящей водяной бане 2 мин и подвергали электрофорезу. Окрашивание гелей. По окончании электрофореза гель фиксировали в течение 45 мин при 60 С в растворе этанол-уксусная кислота-вода в соотношении 3:1:6, окрашивали 20 мин при 60 С в растворе 0.125%-ного Кумасси бриллиантового синего (R-250) (Reanal, Венгрия) этанол-уксусная кислота-вода в соотношении 9:2:9 и отмывали в 7%-ной уксусной кислоте.
Секвенирование генома ADV-DV и филогенетический анализ штаммов вируса
Для амплификации фрагментов вирусного генома получили препараты ДНК из органов инфицированных норок. Установлено, что выход нуклеиновых кислот, полученных из ткани селезенки, сердца и почки, был достаточно высок, наименьший при использовании ткани легкого. Растворы ДНК прозрачны, а отношение Е260/Е280 составило около 1.8, что свидетельствовало о высокой степени чистоты (Дрейпер, 1992). Структура праймеров для ПЦР-амплификации и секвенирования гена ADV, кодирующего капсидный белок Vp2 (ГКБ), была рассчитана после выравнивания нуклеотидных последовательностей этого гена штаммов вируса, выделенных ранее и информация о которых имелась в банке генетических данных EMBL. Рассчитаны три пары олигонуклеотидных праймеров, структура и свойства которых представлены в табл. 3, локализация в геноме вируса на рис. 9. Как видно из электрофореграммы (рис. 10), все три пары праймеров позволили синтезировать специфические продукты, длины которых соответствовали расчетным.
Таким образом, с помощью предложенных праймеров была получена полноразмерная копия анализируемого гена в виде трех перекрывающихся фрагментов ДНК, которые далее были очищены и секвенированы. В результате секвенирования трех ПЦР-фрагментов определена полная нуклеотидная последовательность структурного белка Vp2 дальневосточного изолята ADV (регистрационный номер в банке генетических данных NCBI выведена аминокислотная AY428961, сокращенное название ADV-DV). Размер гена у изучаемого изолята составил 1942 н. о. Последовательности изолятов вируса, выделенных в различных хозяйствах края, были идентичными. На основе полученной нуклеотиднои последовательности последовательность длиной 647 аминокислот. Полученную нуклеотидную последовательность гена Vp2 сравнивали с ранее определенными (на момент выполнения работы были доступны 6 полных последовательностей гена) (табл. 4). Обнаружено 207 полиморфных нуклеотидных позиций, 85 из которых наблюдались у двух и более штаммов, то есть были филогенетически значимыми (табл. 4). Более половины выявленных мутаций локализованы в третьем положении кодонов (более 52%). В рассматриваемых последовательностях обнаружены мутации замещения, приводящие к заменам аминокислотных остатков. Из 647 аминокислот, кодируемых геном Vp2, 77 оказались вариабельными. Мутации замещения происходили примерно с одинаковой частотой в первом и втором положениях кодонов. В третьей кодонной позиции выявлено 12 замещающих мутаций. Генетическое разнообразие штаммов ADV оценивали по нуклеотидным дистанциям между полными последовательностями гена Vp2 штаммов. Значение дистанций довольно значительно варьировало от 0,00263 ± 0,00118 до 0,07789 ± 0,00615. Среднее составило 0,04150 ± 0,00290 (табл. 5, колонки «а»). Представленные данные свидетельствуют, что изолят ADV-DV генетически близок американским штаммам Utah 1 и Utah lkit. Наиболее значительные различия установлены между дальневосточным изолятом и штаммом Pullman. HaNJ-филогенетическом древе (рис. 11) мы выделили 3 кластера. Вершину дерева образует кластер сильнопатогенных американских штаммов группы Utah, который включает и дальневосточный изолят. Второй кластер объединяет сильнопатогенные штаммы TR, SL3 и непатогенный G. В основе дерева расположен штамм Pullman, патогенный только для норок алеутского генотипа. Необходимо отметить, что при использовании других алгоритмов (Jukes-Cantor, Tajima-Nei, Kimura) расчета эволюционных дистанций, топология деревьев не менялась. Во всех случаях воспроизводимость порядка ветвления оказывалась чрезвычайно высокой (близкой к 100%).
Выявление методом дот-блот гибридизации ДНК
Настоящий раздел посвящен разработке тест-системы диагностики ADV на основе метода гибридизации нуклеиновых кислот с нерадиоктивной меткой. В качестве последней использовали доступный фермент - пероксидазу хрена. Разработка метода включала следующие этапы: 1. Подготовку ДНК-зонда. 2. Подбор метода взятия и подготовки биоматериала к гибридизации. 3. Оптимизацию условий гибридизации и визуализации зонда. В качестве зонда использовали ПЦР-фрагмент 1F-1R длиной 690 п. н. Достаточно протяженная длина зонда должна обеспечивать высокую специфичность метода. Фермент «пришивали» к ДНК-зонду глутаровым альдегидом. Полученный таким образом зонд сразу же вносили в реакционную смесь, так как при хранении его активность быстро снижалась. Однако, компоненты, используемые для его приготовления стабильны продолжительное время. В серии экспериментов установлено, что при температуре инкубации более 55 С эффективность отжига зонда с ДНК-мишенью резко снижается, а при 42 С и менее заметно возрастает фоновое окрашивание. Таким образом, оптимальная температура гибридизации для данного зонда находится в пределах 50-55 С. Максимальная чувствительность метода достигнута при концентрации зонда 4-5 мкг/мл и инкубации в течение 16 ч. Гибридизационный сигнал представляет собой комплекс зонд-ДНК окрашенный в коричневый цвет (при использовании в качестве субстрата а-хлорнафтола).
Специфичность зонда доказывали в тесте молекулярной гибридизации с очищенным препаратом вируса и вирусной ДНК. В качестве положительного контроля использовали немеченый фрагмент 1F-1R690. В результате реакции зонд необратимо отжигался с вирусной ДНК, специфическое окрашивание также наблюдали в точке нанесения препарата вируса (рис. 21). Зонд не реагировал с гетерологичной нуклеиновой кислотой (ДНК горбуши Oncorhynchus gorbuscha). Гибридизационный сигнал также отсутствовал в точке нанесения суммарной клеточной ДНК, полученной от неинфицированной ADV норки. Таким образом была доказана строгая специфичность зонда и его способность необратимо связываться с ДНК ADV. Для определения чувствительности метода ставили реакцию с использованием мембраны, на которую предварительно наносили серию 3-кратных разведения препарата ADV с определенной концентрацией. Установлено, что метод позволяет выявить вирус, концентрация которого в пятне не менее 3 нг. Далее отрабатывали способ диагностики вируса в образцах крови животных. При использовании сыворотки инфицированных животных без какой-либо предварительной обработки специфический гибридизационный сигнал не наблюдали. Для того, чтобы ДНК вируса, содержащуюся в ЦИК, сделать доступной для взаимодействия с зондом, тестируемые сыворотки подвергали щелочной обработке (рис. 22). Было установлено, что данную процедуру с одинаковой успешностью можно проводить как в отдельности с каждой пробой, так и с фильтром с предварительно нанесенными сыворотками. Предложенный вариант метода позволяет успешно выявлять вирус не только в цельной сыворотке, но и при ее разведении более чем в 1000 раз (рис. 23).
Настоящая работа посвящена идентификации и генетическому типированию вируса, вызывающего ухудшение качества пушнины, снижение плодовитости самок и повышенную смертность норок в трех зверосовхозах Приморского края: Тавричанский, Силинский и Подгородненский в течение 1997-2004 гг (собственные наблюдения). Поскольку норок в условиях клеточного содержания инфицируют вирусы разных семейств (Литвинов, Яременко, 1998), первоначально наше исследование было направлено на выявление этиологического агента и установление его таксономического статуса. Использовали доступные коммерческие тест-наборы для детекции вирусов методом встречного иммуноэлектрофореза. Было показано, что все три стада животных в значительной степени инфицированы ADV. Отметим, что мониторинг инфицированности норок в ЗАО «Подгородненский» в течение 4-х лет выявил тенденцию к увеличению количества инфицированных животных (рис. 24). Уменьшение численности больных норок алеутской болезнью в 2001 г. связано с тем, что последний сбор данных произведен в мае. Однако, уже за 5 мес. пораженность стада составила более 60% от показателя предыдущего года.
