Введение к работе
Актуальность проблемы
ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - главный фермент, осуществляющий процесс транскрипции генетического материала в клетках всех живых организмов. Процесс транскрипции включает три основные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками транскрипционного комплекса и изменениями контактов РНКП с ДНК-матрицей. РНКП является эволюционно консервативным ферментом, структура которого сходна у всех изученных прокариот и эукариот. Однако, кор-фермент РНКП не способен самостоятельно узнавать последовательность промотора - для этого необходимо наличие а-субъединицы, которая диссоциирует из комплекса с ферментом после его перехода к элонгации. В последние годы понимание тонких молекулярных механизмов функционирования РНКП стало возможным благодаря успехам в расшифровке пространственной структуры РНКП термофильных бактерий Thermus aquaticus и Thermus thermophilus и РНКП II Saccharomyces cerevisiae, а также частичных структур элонгационных комплексов этих РНКП. Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что молекулярные механизмы разных стадий синтеза РНК РНК-полимеразой очень похожи у бактерий и у эукариот. Благодаря более простому строению, бактериальная РНКП может служить удобной моделью для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и ее регуляции.
Каталитически активный кор-фермент бактериальной РНКП представляет собой комплекс из пяти субъединиц (агРР'ш); две наиболее крупные субъединицы - Р и Р', -образуют активный центр, расположенный в глубине главного канала РНКП, и принимают участие в формировании основных контактов РНКП с ДНК и РНК, которые в процессе транскрипции располагаются внутри главного канала. Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП, который содержит дополнительную а-субъединицу, необходимую для узнавания промоторов и плавления ДНК вокруг стартовой точки транскрипции; большинство промоторов узнается при участии так называемой главной а-субъединицы. В ходе инициации РНКП может синтезировать короткие абортивные РНК-продукты, оставаясь при этом прочно связанной с промотором. Переход к синтезу полноразмерных РНК сопровождается диссоциацией а-субъединицы из транскрипицонного комплекса. Элонгационный комплекс РНКП характеризуется очень высокой стабильностью, что является необходимым условием для обеспечения процессивности работы фермента, позволяя РНКП оставаться связанной с ДНК и РНК в течение всего процесса элонгации. Таким образом, эффективный и точный синтез РНК обеспечивается сложными динамическими взаимодействиями РНКП с нуклеиновыми кислотами.
Анализ пространственной структуры РНКП позволил предположить, какие домены фермента ответственны за узнавание промоторов, плавление ДНК, уход РНКП с промотора и стабилизацию промоторных и элонгационных комплексов. В то же время, функции большинства из этих районов РНКП в процессе транскрипции и ее регуляции детально не изучены. Сделанные на основе структурного анализа предположения о роли различных доменов РНКП во взаимодействиях с ДНК требуют экспериментальной проверки. Структура РНКП Escherichia coli, которая лучше всего изучена биохимическими и генетическими методами, остается неизвестной. Кроме того, неизвестна пространственная структура промоторных комплексов бактериальной РНКП. В связи в этим, в настоящее время назрела необходимость поиска новых подходов к изучению механизмов взаимодействий РНКП с ДНК на разных стадиях
транскрипции. Одним из таких подходов может являться анализ ДНК-аптамеров, специфически узнаваемых РНКП, который может быть использован для изучения механизмов РНКП-ДНК взаимодействий на разных стадиях транскрипции, в том числе, специфических взаимодействий с промоторами.
Сравнение пространственных структур РНКП в различных состояниях выявило несколько подвижных доменов в Р" и Р'-субъединицах (в частности, домен P'-clamp, «зажим»), которые способны занимать различное положение на разных стадиях транскрипции и участвовать в контактах с ДНК. Было предположено, что P'-clamp играет основную роль в стабилизации транскрипционных комплексов, за счет «закрывания» переднего дуплекса ДНК и ДНК-РНК-гибрида внутри главного канала РНКП. Домен P'-clamp соединяется с основным телом РНКП через несколько подвижных «шарниров» (так называемые switch-районы), наиболее консервативным из которых является район P'-switch2 (SW2), который напрямую контактирует с матричной цепью ДНК в районе активного центра фермента. В холоферменте РНКП район SW2 взаимодействует с районом 3.2 ст-субъединицы, который, в свою очередь, участвует в связывании инициаторных нуклеотидов и в уходе РНКП с промотора в процессе инициации. Это позволяет предполагать, что SW2 может также играть роль в инициации транскрипции. Рядом с районом SW2 находится участок связывания важнейшего ингибитора бактериальной РНКП - антибиотика рифампицина, однако, возможное участие района SW2 в подавлении активности РНКП рифампицином остается неизвестным. Таким образом, детальное исследование функциональной роли района SW2 должно дать важную информацию о механизмах инициации и элонгации транскрипции РНКП.
В ходе элонгации транскрипции РНКП может совершать временные остановки (паузы), которые могут быть вызваны наличием в ДНК особых регуляторных сигналов. Транскрипционные паузы имеют важное значение для регуляции работы оперонов прокариот, а также многих генов эукариот. В настоящее время предложено несколько различных моделей образования таких пауз, но молекулярные механизмы узнавания сигналов пауз РНКП во многом остаются неисследованными. Предположительно, узнавание некоторых типов сигналов может происходить в результате контактов нематричной цепи ДНК с РНКП. Точное положение нематричной цепи ДНК в транскрипционных комплексах неизвестно, но моделирование показывает, что в области активного центра она должна контактировать с районом P-fork-loop2 (FL2) Р-субъединицы РНКП. Таким образом, исследование функциональной роли района FL2 на разных стадиях транскрипции, в том числе, при взаимодействии с промоторами и при узнавании сигналов пауз, позволит более детально понять некоторые принципы регуляции транкрипции и вклад в них специфических взаимодействий РНКП с нематричной цепью ДНК.
Важно подчеркнуть, что понимание детальных механизмов транскрипции и ее регуляции представляет не только фундаментальный интерес, но и имеет важнейшее практическое значение. РНКП является одной из привлекательных мишеней для создания новых антибиотиков, которые могут применятся для терапии широкого спектра инфекционных заболеваний человека и животных. Детальное изучение функциональной роли районов РНКП, взаимодействующих с ДНК, и механизмов работы известных ингибиторов РНКП необходимо для разработки новых методов подавления активности РНКП и получения новых антибиотиков.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий бактериальной РНКП Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипции: при узнавании и плавлении промоторов, инициации и элонгации синтеза РНК. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи.
Охарактеризовать одноцепочечные ДНК-аптамеры, специфически взаимодействующие с холоферментом РНКП Е. coli. Получить искусственные промоторы на основе аптамеров и определить, какие элементы последовательности ДНК являются необходимыми для инициации транскрипции.
Изучить функциональную роль участков РНКП P'-switch2 и P-fork-loop2, взаимодействующих с матричной и нематричной цепями ДНК в районе активного центра фермента, на разных стадиях транскрипции: в образовании промоторных комплексов, связывании инициаторных нуклеотидов, уходе РНКП с промотора, элонгации синтеза РНК и узнавании регуляторных сигналов на стадии элонгации.
Научная новизна и практическая значимость работы
В работе впервые охарактеризованы ДНК-аптамеры, специфически взаимодействующие с холоферментом бактериальной РНКП. На основе аптамеров получены искусственные однонитевые транскрипционные матрицы; идентифицированы элементы в последовательности аптамеров, которые являются необходимыми для инициации транскрипции. Получены новые данные о функциональной роли контактов района P'-switch2 РНКП с матричной цепью ДНК в области активного центра на разных стадиях транскрипции. Впервые показано, что мутации в районе P'-switch2 РНКП приводят к серьезным нарушениям в инициации транскрипции, в том числе, к ухудшению связывания инициаторных нуклеотидов, снижению стабильности промоторных комплексов, нарушениям в плавлении ДНК в ходе инициации и к снижению эффективности ухода РНКП с промотора. Кроме того, установлено, что район P'-switch2 играет важную роль в стабилизации транскрипционных комплексов. Показано, что антибиотик рифампицин и мутации в районе P'-switch2 оказывают сходное влияние на связывание инициаторных нуклеотидов в активном центре РНКП, что указывает на возможную роль района Р'-switch2 в подавлении транскрипции рифампицином. Впервые изучены эффекты мутаций в районе P-fork-loop2 РНКП, предположительно контактирующем с нематричной цепью ДНК в области активного центра РНКП, на разных стадиях транскрипции. Установлено, что мутации в районе P-fork-loop2 влияют на стабильность промоторных коплексов и уход РНКП с промотора. Впервые показано, что возникновение транскрипционных пауз может быть связано с образованием специфических контактов района P-fork-loop2 РНКП с нематричной цепью ДНК.
Полученные в работе данные существенно расширяют имеющиеся представления о структуре и функциональной роли контактов РНКП с ДНК на разных стадиях транскрипции. Результаты работы могут быть использованы для создания модельных систем для структурных исследований транскрипционных комплексов и разработки новых ингибиторов бактериальной РНКП.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих семинарах, конференциях и симпозиумах: VII Международной конференции по биоинформатике «Структура и регуляция генома» (Новосибирск, Россия, 2010), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010), Французско-Российском научном семинаре «Транскрипция - от основных механизмов к созданию лекарств» (Монпелье, Франция, 2009), 2-ом Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), XX Международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 - статьи в рецензируемых научных изданиях, 6 - материалы международных и всероссийских конференций и симпозиумов.
Структура и объем работы
