Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Белки с цинковыми пальцами – универсальные транскрипционные факторы эукариот 14
1.1. Общая структура, классификация семейства по типу доменов, днк и белок связывающая функции 14
1.2. Цинковые пальцы с2h2 типа 14
1.3 Участие в днк-белковых взаимодействиях 16
1.4. Участие в белок-белковых взаимодействиях 18
Глава 2. Классификация белков с цинковыми пальцами 21
2.1. Btb/poz-домен 21
2.2 krab-домен 25
2.3. Scan-домен 28
2.4. Семейство белков с zad-доменом у drosophila
2.4.1 Структура zad-домена 33
2.4.2 Биологическая значимость белков с zad-доменом 37
Материалы и методы 47
Глава 1. Методы работы с рекомбинантными белками 47
1.1. Использованные плазмиды 47
1.2 Экспрессия и очистка белков 47
1.3 Химическая сшивка белков глутаральдегидом 48
1.4 СО-осаждение рекомбинантных белков («pull down assay») 48
1.5 Анализ торможения в геле днк-белковых комплексов (emsa) 48
Глава 2. Методы работы с культурой клеток drosophila 49
2.1 Использованные плазмиды 49
2.2 кОиммунупрецепитация белков в s2 клетках 49
Глава 3. Метод Chip-SEQ 50
3.1 Сбор эмбрионов, иммунопреципетация хроматина 50
3.2 Секвенирование библиотеки 51
3.3 Биоинформатический анализ chip-seq данных 51
Глава 4. Использованные антитела 52
Глава 5. Методы работы с линиями мух D.Melanogaster 52
5.1 Использованные векторы 52
5.2 Получение трансгенных линий мух 53
5.3 Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе 54
5.4 Анализ полученных трансгенных линий мух 54
Глава 6. Методы работы с дрожжами 56
6.1 Дрожжевая двугибридная система 56
6.1.1 Использованные плазмиды 56
6.1.2 Использованный штамм дрожжей 56
6.1.3 Наращивание и трансформация дрожжей 57
6.2 Метод анализа дистанционных взаимодействий в дрожжах 58
6.2.1 Использованный штамм дрожжей 58
6.2.2 Использованные плазмиды 58
6.2.3 Интеграция плазмидной днк в геном дрожжей 59
Результаты 61
Глава 1. В эмбрионах дрозофилы белки zw5, pita, zipic преимущественно связываются с промоторами генов 61
Глава 2. Zad-домены белков pita, zipic, zw5 способны к специфической гомодимеризации в экспериментах in vitro 66
Глава 3. Zad-домены белков pita, zipic, zw5 способны к специфической гомодимеризации в экспериментах in vivo 70
Глава 4. Сайты связывания белков pita, zipic, zw5 способны сближать дистанционно расположенные участки в геноме drosophila Melanogaster 74
Глава 5. Дистанционные взаимодействия между сайтами связывания для разных zad-белков не поддерживаются 79
Глава 5. Сайты связывания белка zipic способны дистанционно Взаимодействовать в модельном организме saccharomyces cerevisiae. Обсуждение 88
Выводы 92
Благодарности 93
Список литературы 94
- Участие в днк-белковых взаимодействиях
- Семейство белков с zad-доменом у drosophila
- СО-осаждение рекомбинантных белков («pull down assay»)
- Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе
Введение к работе
Актуальность работы
Архитектура хроматина и регуляция экспрессии генов - комплексные и одни из
центральных проблем современной биологии и медицины. Гены высших эукариот
находятся под управлением сложных регуляторных районов, усиливающих или
подавляющих транскрипцию, которые могут иметь протяженность во много раз
превышающую кодирующие части генов. Прогресс в полногеномных
исследованиях архитектуры хроматина показал, что хромосомы состоят из больших доменов, внутри которых происходят дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами (энхансерами, сайленсерами и промоторами) (Dixon, 2012; Nora, 2012; Rao, 2014). Специфичные дистанционные взаимодействия между границами больших доменов и между регуляторными элементами внутри домена определяют правильную экспрессию генов. В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что мутации в регуляторных областях генов, являются причиной основной части наследственных, онкологических и других социально значимых заболеваний человека, однако до настоящего времени не было предпринято системных попыток разобраться в механизмах установления и поддержания дальних взаимодействий.
Дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами
обеспечиваются особыми ДНК-связывающими белками, которые получили название «архитектурные белки». Основной архитектурный белок, найденный в геноме человека – CTCF. Совместно с когезиновым комплексом CTCF участвует в формировании границ топологических доменов, а также в дистанционных взаимодействиях между регуляторными элементами внутри доменов (Gomez-Marin, 2015; Steiner, 2016; Tang, 2015). В геноме Drosophila melanogaster был описан гомолог белка CTCF – dCTCF, который также имеет домен цинковых пальцев С2H2-типа, связывается с похожим сайтом на ДНК и необходим для работы инсуляторов (Holohan, 2007). Участие белка dCTCF в дистанционных взаимодействиях было подтверждено в трансгенных линиях D. melanogaster. По крайней мере, еще для двух белков дрозофилы - Su(Hw) и Zw5 - была показана способность сближать регуляторные участки в геноме (Kyrchanova, 2013; Maksimenko, 2008). Описанные архитектурные белки объединяет наличие ДНК-связывающих доменов с цинковыми пальцами C2H2-типа, что указывает на возможную ключевую роль белков с такими доменами в организации дистанционных взаимодействий в геномах эукариот.
Белки с цинковыми пальцами появились рано в процессе эволюции и
представлены большими группами транскрипционных факторов у многих
эукариот. Помимо ДНК-связывающего домена цинковых пальцев такие белки, как
правило, имеют ассоциированные эффекторные домены. На N-конце некоторых
С2Н2-белков у многих высших эукариот был обнаружен высоко консервативный
ВТВ/POZ-домен. У позвоночных можно выделить KRAB и SCAN-домены, которые
не встречаются у других животных. Для насекомых характерным является N-
концевой ZAD-домен. Ассоциированные домены могут участвовать в
специфичных белок-белковых взаимодействиях, а также за счет способности
димеризоваться и олигомеризоваться регулировать связывание транскрипционных факторов с хроматином.
У D. melanogaster группа белков с цинковыми пальцами C2H2-типа и ассоциированным ZAD-доменом (ZAD-C2H2) включает в себя 95 представителей. Немногочисленные исследования белков этой группы продемонстрировали, что ZAD-C2H2 белки выполняют важную, но неизвестную роль в регуляции экспрессии генов. Для одного представителя данного семейства - белка Zw5, было показано участие в работе инсулятора scs (Gaszner, 1999), а также в образовании локальных дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами. Два новых описанных инсуляторных белка - Pita и ZIPIC - также содержат ZAD-домен (Maksimenko, 2015). Данная работа посвящена исследованию инсуляторных белков Pita, ZIPIC, Zw5, имеющих на N-конце специфичный ZAD-домен, и определению их роли в организации специфичных дистанционных взаимодействий.
Цель и задачи исследования
Основная цель работы заключалась в исследовании способности инсуляторных белков Pita, ZIPIC, Zw5 к организации специфичных дистанционных взаимодействий.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Идентифицировать сайты связывания инсуляторных белков Pita, ZIPIC, Zw5
в хроматине эмбрионов дрозофилы и провести их биоинформатический анализ.
2. Исследовать способность ZAD-доменов белков Pita, ZIPIC и Zw5 к
взаимодействиям в экспериментах in vitro и in vivo.
3. Проверить способность инсуляторных белков, содержащих ZAD-домен, к
поддержанию дистанционных взаимодействий в трансгенных линиях Drosophila
melanogaster.
4. Создать модельную систему для исследования способности белков к
дистанционным взаимодействиям в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В данной работе впервые был проведен полногеномный анализ распределения
белков Pita, ZIPIC, Zw5 в эмбрионах с помощью метода иммунопрецепитации
хроматина с последующим глубоким секвенированием. Дальнейший
биоинформатический анализ позволил обнаружить мотивы ДНК, с которыми могут связываться белки Pita, ZIPIC и Zw5. На модельной системе GAL4/white в D.melanogaster, было продемонстрировано, что предсказанные мотивы связывания белков могут дистанционно взаимодействовать на расстоянии более 5 тысяч пар нуклеотидов и приводить к сближению регуляторных элементов в трансгенных конструкциях. Впервые в независимых экспериментах in vitro и in vivo было установлено, что ZAD-домены исследуемых белков способны специфически гомодимеризоваться, образование гетеродимеров между разными представителями семейства ZAD-белков не обнаружено. Подобный комплексный подход, примененный в работе, может быть использован для исследования других
потенциальных архитектурных белков насекомых и возможно позвоночных на способность поддерживать дистанционные взаимодействия.
В данной работе была разработана и протестирована новая тест-система, позволяющая на примере модельного объекта S.cerevisiae изучать способность белков и их доменов поддерживать дистанционные взаимодействия. Созданная тест-система позволила подтвердить способность белка ZIPIC сближать участки хромосом и впервые показать роль ZAD-домена в осуществлении этой функции белка. Данная модельная система может использоваться для проверки способности других архитектурных белков дрозофилы и млекопитающих взаимодействовать на дальних расстояниях.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики. В ходе выполнения диссертационной работы был использован широкий спектр методов, таких как: молекулярное клонирование, иммунопрецепитация хроматина, экспрессия и очистка белков, метод изменения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле, анализ белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе.
Личный вклад автора
Автор внесла существенный личный вклад в получение изложенных в
диссертации новых научных данных. Автором выполнен основной объём работ:
создание генетических конструкций, получение трансгенных линий Drosophila и
их фенотипический анализ, получение антител к изучаемым белкам, получение
конструкций для иммунопреципитации белков в культуре клеток Drosophila,
анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе,
разработка модельной системы в организме S. cerevisiae. Полногеномное
секвенирование проводилось совместно с Группой геномного секвенирования
Лаборатории эволюционной геномики факультета биоинженерии и
биоинформатики МГУ. Первичная биоинформатическая обработка полученного массива данных была проведена И.В. Кулаковским. Кроме того, соискатель принимала участие в разработке стратегии научного исследования и написании статей.
Положения, выносимые на защиту
1. Белки Pita, ZIPIC и Zw5 связываются преимущественно вблизи промоторов
генов и в значительной доле участков колокализуются с белком CP190.
2. ZAD-домены белков Pita, ZIPIC и Zw5 образуют димеры в условиях
экспериментов in vitro и in vivo.
3. ZAD-домены белков Pita, ZIPIC, Zw5 не образуют гетеродимеров с ZAD-
доменами других белков.
-
В трансгенной модельной системе в геноме D.melanogaster сайты связывания Pita, находящиеся на расстоянии около 5 тысяч пар нуклеотидов способны взаимодействовать, сближая активатор GAL4 и промотор гена white. Аналогичными свойствами обладают сайты связывания белков ZIPIC и Zw5.
-
Дистанционные взаимодействия между сайтами разных белков Pita - ZIPIC, Pita - Zw5, ZIPIC - Zw5 не возникают.
-
В модельной системе в геноме дрожжей белок дрозофилы ZIPIC, связываясь со своими сайтами, обеспечивает взаимодействие между активатором GAL4 и промотором гена HIS3, расположенными на расстоянии более одной тысячи пар нуклеотидов.
7. ZAD-домен необходим для взаимодействия между белками ZIPIC на
расстоянии. Делеция ZAD-домена позволяет мутантному белку связываться со
своими сайтами, но приводит к потере способности взаимодействовать
дистанционно.
Степень достоверности и апробация результатов
Цель, поставленная в работе, достигнута, достоверность полученных результатов не вызывает сомнений. Результаты работы были опубликованы в трех рецензируемых научных журналах и представлены автором на российских и международных конференциях.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, включая 28 рисунков. Список цитируемых литературных источников включает 105 наименований.
Участие в днк-белковых взаимодействиях
Структура малых белковых доменов обычно стабилизируется образованием дисульфидных мостиков или связыванием ионов металла (чаще всего цинка). Связывание ионов металла увеличивает термическую и конформационную стабильность малых доменов, но как правило не влияет напрямую на их функции. Среди таких доменов цинковые пальцы типа Cys2-His2 (C2H2) наиболее хорошо изучены. Первоначально используемый для обозначения повторяющихся цинк-связывающих мотивов у транскрипционного фактора TFIIIA Xenopus laevis термин «цинковый палец» сейчас используется для обозначения любых компактных доменов, стабилизированных ионом цинка.
Всего известно около 20 различных типов доменов цинковых пальцев, различающихся по способу стабилизации структуры ионом цинка. Наиболее часто встречающийся тип доменов цинковых пальцев, найденный у большинства эукариотических организмов это цинковые пальцы типа Cys2-His2 (C2H2).
Домены этой группы состоят из -шпильки (антипараллельный бета-лист из двух бета-тяжей) и следующей за ней -спиралью, которые формирует левозакрученную -структуру. Атом цинка координируется двумя цистеинами с одного конца -листа и двумя гистидинами с С-концевой части -спирали (Рис. 1А). Классический цинковый палец типа C2H2 обычно состоит из последовательности 28 14 аминокислот, включающую в себя два консервативных цистеина и два консервативных гистидина. Однако, другая комбинация Cys/His как цинк хелатирующих оснований также возможна. Связывающие нуклеиновые кислоты С2Н2 цинковые пальцы взаимодействуют с большой бороздкой ДНК через N-конец -спирали. Узнавание специфической ДНК последовательности достигается взаимодействием оснований ДНК с боковыми цепями поверхности -спирали. Все С2Н2 цинковые пальцы связывают ДНК подобным образом. Специфичность и высокая афинность ДНК связывания достигается кооперативным связыванием -спиралей нескольких цинковых пальцев С2Н2 расположенных друг за другом (Krishna, 2003)
Рисунок 1 А. Каноническая структура цинкового пальца типа C2H2. Ленточная диаграмма третьего цинкового пальца транскрипционного фактора TFIIIA Xenopus laevis (PDB ID 1TF3) показывает стабилизацию структуры координированием иона цинка (желтым) двумя остатками цистеина (зеленый) и гистидина (синий) Б. ДНК связывающий цинковый палец. Ленточная диаграмма показывает ДНК связывающий цинковый палец типа C2H2 белка Zif268 (PDB ID 1ZAA). Аминокислоты, вовлеченные во взаимодействие с ДНК обозначены в позициях -1 (зеленым), 2 (синим), 3 (красным), и 6 (оранжевым). Адаптировано из (Brayer,Segal 2008) Домены цинковых пальцев C2H2 были изначально описаны как ДНК-связывающие домены. Однако, появившееся большое количество данных указывает на важную и широко распространенную роль этих доменов в связывании белков. Известно, что в некоторых случаях последовательность цинковых пальцев может содержать сигнал ядерной локализации (Mingot, 2009). Белки с цинковыми пальцами могут иметь от одного до сорока цинковых пальцев, которые чаще всего расположены в кластерах тандемно расположенных доменов. У белков, которые содержат несколько доменов цинковых пальцев обычно только некоторые вовлечены в связывание ДНК. Оставшиеся пальцы часто вовлечены в другие типы взаимодействий. В некоторых случаях, как например, у хорошо изученных белков Zif268 и SP1, цинковые пальцы, как оказалось, играют двойную роль, выполняя и ДНК, и белок-связывающие функции (Seto, 1993).
Одна из ранних работ по расшифровке структуры комплекса цинковых пальцев с ДНК была выполнена для белка Zif268 млекопитающих (Pavletich,Pabo 1991). Структура комплекса пептида из трех цинковых пальцев с консенсусным сайтом связывания ДНК показала, что тандемно расположенные цинковые пальцы являются эффективным мотивом для ДНК-белкового распознавания. Три цинковых пальца образуют структуру полукругом, которая располагается в большой бороздке ДНК (Рис. 2). Каждый из трех цинковых пальцев использует аминокислоты в одних и тех же позициях -спирали для связывания с тремя нуклеотидами ДНК. Два -слоя, образующие шпильку, играют очень разную роль в образовании комплекса с ДНК. Первый -слой не имеет контактов с ДНК, тогда как второй слой контактирует с сахарно-фосфатным остовом вдоль цепи ДНК. Всего цинковый палец Zif268 образует 11 критичных водородных связей с большой бороздкой ДНК. Важные боковые цепи -спирали - аргинин в позиции -1 (в принятой нумерации номер +1 соответствует началу -спирали), а также аминокислотные остатки в позиции 2,3 и 6. Водородные связи устанавливаются с G-богатой цепью консенсусного сайта связывания (5 -GCGTGGGCG-3 ). Если сравнивать с 5 - 3 направленностью ДНК цепи то можно сказать, что общая сборка белка «антипараллельна» к цепи ДНК. Связывающийся пептид располагается таким образом, что первый цинковый палец связывается с триплетом ближе к 3 концу цепи (GCG TGG GCG), второй палец с триплетом в центральной части (GCG TGG GCG), и третий вблизи 5 конца (GCG TGG GCG). Анализ комплекса TFIIIA-ДНК также показал, что большинство контактов цинковых пальцев происходит с гуанин богатой цепью ДНК, и что цинковые пальцы TFIIIA белка также располагаются «антипараллельным» способом относительно цепи ДНК
Семейство белков с zad-доменом у drosophila
Около одной трети генов человека, имеющих цинковые пальцы типа C2H2, содержит KRAB-домен (Bellefroid, 1991). Как и BTB, KRAB-домен является репрессорным транскрипционным модулем. По сравнению с BTB/POZ-белками, особенность KRAB-содержащих белков состоит в том, что они присутствуют только в геномах четвероногих позвоночных животных. KRAB-домен не обнаружен в аминокислотной последовательности белков с цинковыми пальцами у рыб, Drosophila, растений, дрожжей, и других грибов, но был найден в геноме человека, мыши, крысы, цыпленка. Такое распространение только у позвоночных животных позволяет предположить, что появление KRAB-домена произошло относительно рано в эволюции, даже несмотря на то, что большая часть KRAB-содержащих белков имеет мотив цинковых пальцев, которые представлены у организмов от одноклеточных эукариот до человека.
Гомология KRAB-доменов составляет приблизительно 75 аминокислот в длину, предсказанная структура представляет собой две амфипатические спирали. KRAB-домены у разных белков состоят из одного или двух боксов KRAB A и KRAB B. Два бокса KRAB-домена всегда кодируются отдельными экзонами, разделенными интроном вариабельной длины. Экзон-интронная организация приводит к образованию различных продуктов при альтернативном сплайсинге. Известно, что белки с цинковыми пальцами, которые содержат только бокс KRAB A, могут являться продуктами генов, которые кодируют только A-бокс и не имеют B-бокса, либо от генов, которые содержат оба бокса KRAB A и B при образовании транскрипта альтернативным сплайсингом. В отличии от этого домен цинковых пальцев чаще всего кодируется одним экзоном. Это отличает представителей KRAB-семейства белков от других белков с цинковыми пальцами, которые кодируют ДНК-связывающий домен более чем одним экзоном.
Функция, которая в настоящее время приписывается семейству KRAB-белков связана с репрессией транскрипции РНК-полимеразы I, II, и III промоторов, а также со связыванием и сплайсингом РНК. KRAB-домен репрессирует транскрипцию рекрутированием корепрессоров. Бокс А играет ключевую роль при связывании корепрессоров, а бокс B усиливает репрессию бокса A через мало известный механизм (Vissing, 1995).
В настоящее время функцию репрессии транскрипции белками с KRAB-доменами связывают с ролью белка KAP-1(KRAB-associated protein-1). Впервые описанный в трех независимых исследованиях, данный белок, по всей видимости, является универсальным репрессорным кофактором для всех белков c KRAB доменами. Связывание RING-B-box coiled-coil (RBCC) мотива белка KAP-1 абсолютно необходимо для репрессии транскрипции KRAB-содержащими белками. В работах (Friedman, 1996; Kim, 1996; Moosmann, 1996) было показано, что KAP-1 связывает KRAB-домен в виде олигомера, выполняя роль платформы для рекрутирования гетерохроматинового белка 1 (HP1 изоформы , , ), гистоновых деацетилаз (HDAC), и белка Setdb1, метилирующего лизин 9 гистона H3. Как известно, HP1 белок связывает метилированный по лизину 9 гистон H3, что приводит к конденсации хроматина (Nakayama, 2001). На основании всех этих данных была предложена модель (Рис. 6) (Schultz, 2002).
Рисунок 6. Модель сборки комплекса белка с KRAB-доменом с другими белками на промоторе гена-мишени. Адаптировано из (Urrutia 2003) Эта модель предсказывает, что KRAB-белки связываются с ДНК с помощью цинковых пальцев, рекрутируют на KRAB-домен корепрессор KAP-1 (Friedman, 1996). Связанный корепрессор взаимодействует с промоторами генов-мишеней привлекая гистоновые деацетилазы и метилазы, модифицирующие гистоны и подавляет экспрессию генов путем образования факультативного гетерохроматина.
KRAB-содержащие транскрипционные факторы вероятно играют важную роль во многих процессах морфогенеза и клеточной дифференцировки у позвоночных. Например, экспрессия некоторых KRAB-содержащих белков снижена при миелоидной дифференцировке (Bellefroid, 1991), в то время как другие гены, кодирующие белки с KRAB-доменами экспрессируются только в лимфоидных клетках, и играют важную роль в дифференцировке лимфоцитов (Bellefroid, 1993).
SCAN-домен был впервые описан в составе транскрипционного фактора с цинковыми пальцами типа C2H2 у человека ZNF174 (Williams, 1995). SCAN-домен, также известный как LeR (leucine-rich), поскольку имеет лейцин богатую первичную последовательность, составляет около 87 аминокислот в длину и встречается только у позвоночных животных в числе одной копии на белок. SCAN-домен функционирует как белок-связывающий домен, который отвечает за гомодимеризацию или селективное взаимодействие с другими белками.
Как и белки с цинковыми пальцами ассоциированные с KRAB-доменом белки со SCAN-доменами широко распространились только в геномах позвоночных. С помощью биоинформатического анализа в геноме человека был найден 71 белок со SCAN-доменом, что составляет приблизительно 10% от известных белков с цинковыми пальцами типа C2H2. Гены, кодирующие SCAN-домен кластеризованы, часто тандемно расположены на хромосомах, как в геноме человека, так и мыши. Около 90% генов, кодирующих SCAN-белки, имеют открытые рамки считывания, то есть большая часть генов функциональна. Все представители данного семейства имеют схожую структуру со SCAN-доменом на N-конце и вариабельным числом цинковых пальцев (от 2 до 22) на С-конце. SCAN-домен отделен от доменов цинковых пальцев аминокислотной последовательностью, которая варьирует по длине и не имеет общей гомологии. Кроме SCAN-домена, члены этого семейства могут иметь также и KRAB-домен на N-конце. Интересно, что около половины белков семейства SCAN содержат новый район гомологии, который был найден на N-конце предсказанных белков. Этот участок в 13 аминокислот с последовательностью EqEGLLiVKvEEe (где большие буквы соответствуют аминокислотам консервативным более чем у 51% членов семейства, и малые буквы аминокислотам, консервативным у 35% белков), и похож на описанный ранее N-концевой кислый домен миелоид-специфичного гена с цинковыми пальцами MZF-2 у мыши (Murai, 1997). Биоинформатический анализ генома человека показал, что этот район может быть найден только в составе белков - членов семейства SCAN. Кровая последовательность N-концевого домена содержит сайт для связывания SUMO. Как убиквитин, SUMO - малый пептид, который ковалентно связывается с остатками лизина белка субстрата (Gill 2003). Пострансляционная SUMO-модификация белков членов SCAN-семейства может влиять на некоторые их функции. По аналогии с другим белками, SUMO-модификация белков со SCAN-доменом может препятствовать убиквитинилированию белка, потенциально защищая белок от деградации протеасомами. Кроме того, SUMO-модификация может разрушать белок-белковые взаимодействия с некоторыми белками, содействуя при этом взаимодействию с другими белками.
СО-осаждение рекомбинантных белков («pull down assay»)
В кристалле две молекулы ZAD-домена ассоциированы в виде димера голова к хвосту способом. Взаимодействующая поверхность ZAD-домена покрывает около 20 % от всей площади поверхности. Важно то, что большая часть аминокислотных остатков, консервативных среди представителей ZAD-семейства (Chung, 2002), отвечает за контакты между двумя субъединицами. В частности, гидрофобные основания длинной C-концевой 2-спирали составляют большую часть контактирующей поверхности. Предполагаемая поверхность димера, таким образом, сильно отличается от остальной поверхности, которая состоит из полярных остатков и имеет отрицательный электростатический заряд.
Молекулярное взаимодействие ZAD-доменов белка Grau было подтверждено в эксперименте по химической сшивке (Jauch, 2003). Где было показано, что две молекулы эффективно сшиваются в состояние димера, тогда как образование олигомеров более высокого порядка не наблюдалась. ZAD-домен Grau почти полностью сворачивается в отрицательно заряженную структуру, что указывает на неспособность ZAD-домена связывать ДНК. Кроме того, мутантный белок Grau, лишенный ZAD-домена сохранял способность связывать ДНК in vitro, тогда как часть белка Grau, которая содержала ZAD-домен в отсутствие цинковых пальцев не имела ДНК связывающей активности (Chen, 2000), что указывает на то, что ZAD-домен не имеет собственной ДНК-связывающей активности.
В другом исследовании изучалась способность к димеризации дикой формы и нескольких мутантных форм белка Sry- (Payre, 1997). Эти результаты показали, что белок Sry- способен гомодимеризоваться. При делеционном анализе удалось выявить участки белка, необходимые для формирования гомодимера. Мутация либо в ZAD-домене, либо в шестом цинковом пальце C2H2 вызывала потерю формы димера. Это особенно интересно, поскольку цинковые пальцы C2H2 в Sry- также необходимы для специфичного связывания с сайтами на ДНК. Это значит, что мотив цинковых пальцев функционирует в данном белке как белок связывающий домен (с ZAD-доменом) и как ДНК-связывающий домен.
Семейство ZAD-транскрипционных факторов представлено разным числом у разных видов насекомых: 29 белков у Apis mellifera, 75 - у Tribolium castaneum, 86 у -Bombyx mori, и 97 - у Drosophila melanogaster. Считается, что многие представители семейства ZAD-белков произошли при дупликации исходных копий генов и в дальнейшем закрепились положительным отбором. Широкое распространение и видоспецифичность ZAD-доменов может указывать на роль этих белков в развитии адаптивных структур, присущих конкретным видам организмов. Вероятно, это может быть связано с процессом оогенеза, в частности, развитием у насекомых мероистических ооцитов (ооцитов, соединённых цитоплазматическими мостиками с несколькими питающими клетками, которые несут свою синтетическую нагрузку) (Krystel,Ayyanathan 2013). Интересно, что экспрессия большинства ZAD-транскрипционных факторов приходится на период созревания ооцитов и раннего эмбрионального развития дрозофилы.
Среди известных белков с ZAD-доменами, только для некоторых показана функция. Среди них белки, участвующие в оогенезе – Grauzone, Serendipity, Trade Embargo, Weсkly, Ranshi, DIP1. И белки с более широко представленными функциями – M1BP, Zw5, Pita, ZIPIC.
Белок Grau (Grauzone) локализуется в ядрах питающих и фолликулярных клетках ооцита. Транскрипты белка Grau присутствуют в ооцитах и на более поздних стадиях развития. Как было показано на примере cortex гена Grau является транскрипционным фактором. В экспериментах по анализу подвижности белковых комплексов в геле было показано, что Grau связывается с промотором гена cortex (Chen, 2000). Активация транскрипции гена cortex белком Grau необходима для завершения мейоза в ооцитах Drosophila, и установления пути, который специфически регулирует женский мейотический клеточный цикл (Chu, 2001). Так, митоз и мейоз у мужских особей не нарушается в мутантах по белкам Grau и Cortex, тогда как у самок приводит к стерильности. Было показано, что мутации в белке Grau, которые нарушают его функцию приводят к разрушению ДНК - белковых взаимодействий (Chen, 2000). В самках дрозофилы отсутствие белка Grau приводит к остановке роста на стадии мейоза II, тогда как гомозиготные по мутации grau эмбрионы, которые получили материнский белок развиваются в нормальных взрослых особей. Мутантные фенотипы по белку Grau позволяют предположить, что данный белок является транскрипционным фактором, необходим на стадии оогенеза и белок Cortex является его геном-мишенью (Chen, 2000).
Линии и мутации drosophila melanogaster, использованные в работе
Мы предположили, что способность ZAD-доменов димеризоваться может иметь ключевую роль для образования контактов между удаленно расположенными участками в геноме, за счет ассоциации расположенных на расстоянии связанных с хроматином белков. Для того, чтобы выяснить, способны ли сайты связывания ZAD-содержащих белков поддерживать дальние взаимодействия, мы использовали GAL4/white модельную-систему в трансгенных линиях мух (Рис.21). GAL4/white модельная-система включает в себя универсальный дрожжевой активатор GAL4 и ген white (отвечает за пигментацию глаз), между которыми расположен ген yellow (отвечает за окраску кутикулы, крыльев и щетинок), создавая тем самым дистанцию между активатором GAL4и промотором white около 5 т.п.н. GAL4, связываясь с участком, расположенным перед геном yellow не может стимулировать промотор гена white, расположенный на 3 -конце гена yellow (Kyrchanova, 2007). Фрагменты, содержащие сайты связывания исследуемых белков, встраивались перед промотором гена yellow и перед промотором гена white. При наличии взаимодействия между тестируемыми элементами сайты связывания GAL4-активатора сближаются с промотором гена white, что приводит к активации его экспрессии и, в результате, к изменению пигментации глаз у взрослых мух. Без активации GAL4, как и при отсутствии взаимодействия, наблюдается базовая экспрессия гена white, при которой окраска глаз варьирует от светло-желтой до темно-желтой.
Схема трансгенной конструкции, использованной для анализа функциональных взаимодействий между сайтами связывания тестируемых белков. Сайты связывания GAL4 (обозначены как G4) располагаются на расстоянии 5 т.п.н. от гена white. Ген yellow вставлен между сайтами связывания G4 и промотором white. Гены yellow и white показаны в виде прямоугольников, со стрелкой, указывающей направление их транскрипции. Треугольниками обозначены сайты связывания исследуемых белков Направленные вниз стрелки обозначают сайты связывания Cre рекомбиназы (lox). Если сайты исследуемых белков взаимодействуют, то GAL4 белок активирует промотор гена white, что приводит к усилению экспрессии гена white и изменению окраски глаз у взрослых особей.
Ранее для восьми сайтов связывания белка Zw5 из инсулятора scs было показано, что в такой модельной системе сайты связывания белка могут эффективно поддерживать дальние взаимодействия (Kyrchanova, 2013). Мы решили протестировать аналогичным образом взаимодействие между парами сайтов связывания белков Pita или ZIPIC.
Для получения конструкций мы использовали ДНК фрагмент, содержащий четыре мотива связывания для белка Pita, расположенных в одной ориентации (Рх4). Связывание белков с этими мотивами in vitro было подтверждено с помощью EMSA (Maksimenko, 2015). Фрагмент Рх4 был протестирован в GALAIwhite модельной-системе. (Рис. 21). Ранее на подобной модельной системе было показано, что ориентация тестируемых элементов относительно друг друга в конструкции может влиять на конфигурацию петли хроматина и, как следствие на стимулирование промотора гена white активатором (Kyrchanova, 2008). Чтобы исключить ориентационно-зависимое влияние на активацию транскрипции Рх4, расположенный перед промотором гена white был вставлен в прямой, либо противоположно направленной ориентации (Px4R). Таким образом были созданы конструкции G4(px4)Y Рх4 w G4(Px4)Y Px4R W (Рис 22).
Аналогичным способом были получены конструкций с сайтами связывания белка ZIPIC. ДНК-фрагмент, содержащий четыре мотива связывания белка ZIPIC (Zpx4), вставлялся перед промотором гена white в прямой (Zpx4), или обратной (Zpx4R) ориентации (конструкции G4(Zpx4)Y Zpx4W G4(Zpx4)Y Zpx4R W) (Рис 22).
Так как тестируемые конструкции встраивали в геном мух с помощью P-элемента, то для каждой конструкции анализировали несколько независимых линий. После трансформации всего было получено 18 трансгенных линий с конструкцией, содержащей сайты Pita в одной ориентации и 9 линий, содержащих сайты Pita в противоположной ориентации. Во всех линиях окраска глаз варьировала от бледно-желтой до оранжевой. После индукции белком GAL4 окраска глаз изменялась во всех линиях от темно-желтой до красной. Что говорит об активации промотора white белком GAL4. В данном случае пара сайтов связывания белка Pita приводила к стимуляции транскрипции белком GAL4 независимым от ориентации способом.
Чтобы продемонстрировать, что стимуляция гена white белком GAL4 была вызвана сближением сайтов связывания Pita, мы удалили фрагмент с сайтами связывания белка Pita, окруженный /ax-сайтами, путем скрещивания с линией мух, несущей Сге рекомбиназу. Всего было проанализировано 3 трансгенных линии для конструкции с однонаправленными сайтами и 4 линии для конструкции с противоположно направленными сайтами. Во всех проанализированных линиях экспрессии активатора GAL4 не вызывала изменение окраски глаз, что говорит о том, что GAL4 утрачивал способность стимулировать экспрессию гена white вследствие разрушения дистанционных взаимодействий.
Тестирование функциональных взаимодействий между ДНК- фрагментами, содержащими сайты связывания белков (A) Pita (белые круги) или (B) ZIPIC (черные круги) в GAL4/white модельной системе. Строка «+GAL4» показывает фенотип глаз в трансгенных линиях после индукции GAL4 экспрессии. Верхний индекс «R» показывает, что соответствующие элементы вставлены в обратной ориентации в конструкции. В столбиках показано количество трансгенных линий с разным уровнем экспрессии гена white. Н - это количество линий, в которых мухи приобрели новый white (w) фенотип; В - общее количество линий, проверенное для каждой конкретной конструкции. Наверху представлена схема трансгенной конструкции использованной для проверки функционального взаимодействия между сайтами связывания тестируемых белков (обозначение как на рисунке 20) Таким образом, можно заключить, что сайты связывания Pita могут поддерживать стимуляцию на дальних расстояниях промотора гена white белком GAL4. Кроме того, можно сделать вывод о том, что ориентация сайтов относительно друг друга в конструкции не влияет на топологию хроматиновой петли и, как следствие, на активацию промотора white.
Подобные результаты были также показаны для сайтов связывания белка ZIPIC. Всего было проанализировано 6 линий мух с конструкцией, содержащей однонаправленные сайты ZIPIC. Окраска глаз трансформантов варьировала от бледно-желтой до темно-желтой. После экспрессии белка GAL4 в 5 из 6 линиях с однонаправленными сайтами происходило усиление экспрессии гена white, что оценивалось по изменению фенотипа глаз – цвет глаз становился более темным: от темно-желтого, до темно-оранжевого у отдельных линий. Для конструкции с противоположно ориентированными сайтами всего было получено 24 линии мух, окраска глаз в разных линиях варьировала от бледно-желтой до оранжевой. После активации изменение фенотипа глаз происходило в 21 из 24 проанализированных линий. Окраска глаз изменялась в диапазоне от бледно-желтой до коричневой у разных линий мух.
После вырезания сайтов ZIPIC с помощью Cre/lox системы способность белка GAL4 активировать промотор white утрачивалась. У проанализированных линий (5 линий с однонаправленными и 6 линий с противоположно направленными сайтами) окраска глаз не изменялась.
Таким образом, было показано, что сайты связывания белков Pita и ZIPIC, способны сближать регуляторные участки в геноме Drosophila melanogaster. Можно предположить, что такая функция белков связана с присутствием в их структуре эффективно димеризующихся доменов.