Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных. Морфологическая, эпидемиологическая и клиническая характеристика ВЗН .
1.1. Общая характеристика ВЗН, Классификация флавивирусов. 16
1.2. Эпидемиология ВЗН. 20
1.3. Клиническая картина ЛЗН. 22
1.4. Циркуляция ВЗН в природных очагах, 26
1.5. Структура вириона ВЗН и родственных флавивирусов. 27
1.6. Цикл репродукции флавивирусов в клетке хозяина. 38
1.7. Мш-юклональные антитела против структурных белков ВЗН и их использование для изучения антигенной структуры. 41
1.8. Рекомбинантиые белки, моделирующие структурные белки Е и М флавивирусов , 45
1.9. Заключение. 50
Глава 2. Исходные материалы и основные методы.
2.1. Исходные материалы. 53
2.2. Основные методы.
2.2.1. Животные. 58
2.2.2. Вирус, клеточные культуры. 58
2.2.3. Получение поликлональных и моноклинальных антител. 59
2.2.4. Криоконсервация гибридных клеточных линий. 63
2.2.5. Наработка препаративных количеств МКА in vivo. 64
2.2.6. Очистка препаратов МКА. 66
2.2.7. Биотинилирование белков. 67
2.2.8. Иммуноферментный анализ. 67
2.2.9. Электрофорез. 68
2.2.10. Иммуноблотинг. 68
2.2.11. Конкурентный иммуноферментный анализ. 69
2.2.12. Реакция нейтрализации. 70
2.2.13. Реакция торможения гемагглютинации. 71
2.2.14. Моделирование трехмерной структуры белков Е и М флавивирусов. 71
2.2.15.Измерение константы аффинности. 72
2.2.16. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов 73
2.2.17. Получение рекомбинантных полипептидов
Глава 3. Результаты и обсуждение исследований.
3.1. Исследование схожести пространственной структуры белка Е флавивирусов. Выбор участков белка Е и белка ргМ ВЗН для имитирования антигенной структуры. 75
3.2. Изучение способности полипептидов Еі і8о, Егбо-4бб ргМ имитировать антигенную структуру белков Е и РгМ ВЗН. 81
3.3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному полипептиду Е М80. 89
3.4. Картирование эпитопов 1-го и П-го доменов белка Е ВЗН. 92
Заключение по исследованию N-концевого фрагмента 1-180 а.о. белка Е ВЗН. 97
3.5. Исследование иммунохимических свойств МКА против рекомбинантного фрагмента Е2бо-4бб ВЗН. 101
3.6. Картирование эпитопов, узнаваемых МКА. Перекрестная реактивность МКА. 104 Заключение по исследованию С - концевого фрагмента белка Е ВЗН. 109
3.7. Получение коллекции МКА против белка РгМ ВЗН. Свойства моноклональных антител против белка РгМ ВЗН. 111
3.8. Изучение взаимодействия МКА против белка ргМ с рекомбинантными фрагментами М31 -75-Е j .30 и Е2ы).ш- - 115
3.9. Изучение взаимодействия МКА против белка ргМ ВЗН с реКОмбииаНТНЫМ ПОЛИПЄПТИДОМ E260-466- 118
3.10. Изучение биологической активности МКА методами РН и РТГА. Эпитопы, распознаваемые созданными МКА. 120
3.11. Моделирование пространственной структуры схожих участков белков Е и М вируса Денге и ВЗН. 121
Заключение по исследованию белков М и РгМ ВЗН. 125
Заключение. 1.31
Выводы. 137
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 139
Благодарности. 142
Список используемой литературы. 144
- Мш-юклональные антитела против структурных белков ВЗН и их использование для изучения антигенной структуры.
- Рекомбинантиые белки, моделирующие структурные белки Е и М флавивирусов
- Моделирование трехмерной структуры белков Е и М флавивирусов.
- Изучение способности полипептидов Еі і8о, Егбо-4бб ргМ имитировать антигенную структуру белков Е и РгМ ВЗН.
Введение к работе
Вирус Западного Нила (ВЗН), относящийся к семейству Flaviviridae, является возбудителем инфекционного заболевания человека - лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Клинические формы течения ЛЗН разнообразны, от бессимптомных форм заболевания до тяжелых менингоэнцефалитов с высокой летальностью (Campbell G.L. et al, 2002). В настоящее время отсутствуют специфические средства терапии и профилактики ЛЗН. Нерешенной остается проблема специфичности и чувствительности разрабатываемых диагностических систем для выявления данного заболевания.
Глобальное распространение ВЗН на территории Евразии, Африки, Австралии, Северной Америки сочетается с увеличением частоты вспышек ЛЗН с преобладанием тяжелых форм течения заболевания (Petersen L.R. et al, 2001). На территории России вспышки ЛЗН были описаны в южных регионах европейской части: Астраханской, Волгоградской областей и Краснодарского края (Lvov D.K. et al, 2004). В 2002 году ВЗН был также обнаружен в южных регионах Западной Сибири (Терновой В.А. и др, 2004). Эпидемиологические данные позволяют предполагать дальнейшее расширение ареала и активацию природных очагов ВЗН. Высокая чувствительность широкого спектра млекопитающих, птиц и членистоногих обусловливает распространение ВЗН с высокой скоростью после вторжения на новые территории. Ярким
примером быстрой экспансии ВЗН является его распространение по территории Северной Америки в период с 1999 года, когда была зафиксирована первая в истории Северной Америки вспышка ЛЗН в Нью -Йорке, по 2005 год. В настоящее время ареал ВЗН охватывает полностью территорию США, южных провинций Канады, север Мексики и страны Карибского Бассейна (Dauphin G. et al, 2004). Ежегодно регистрируется высокая заболеваемость ЛЗН, в 2005 году выявлено 2819 случаев ЛЗН со 105 летальными исходами ().
Повышению заболеваемости способствует наличие множества путей передачи ВЗН: наряду с заражением ВЗН посредством укуса комаров, описано инфицирование человека при переливании крови, кормлении грудью, трансплантации органов, пересадки стволовых клеток. Отсутствие диагностических систем для проверки донорской крови и органов на наличие ВЗН может привести к увеличению числа иатрогенньтх случаев заражения людей.
Таким образом, всемирное распространение ВЗН и рост
заболеваемости ЛЗН повышает актуальность задач по созданию
специфических средств профилактики, диагностики и лечения данного
заболевания. На современном этапе решение проблемы связано с
исследованием антигенной структуры флавивирусов и выявлением наиболее
иммунологически значимых участков структурных белков для последующего
применения знаний в области создания полиэпитопных вакцин и систем
диагностики.
Ранее картирование антигенных детерминант вирусов Марбург и Эбола было успешно проведено с использованием технологии создания рекомбииантных полипептидов (Sorokin A.V. el al, 2002; Рудзевич Т.Н. и др, 2003). В данной работе использовался этот же подход для картирования антигенных детерминант структурных белков ВЗН, формирующихся из различных фрагментов полипептидной цепи. Принципиальным отличием использованного подхода было наличие данных рентгенеструктурного анализа белка Е ВКЭ, что позволило, используя структурную схожесть белка Е флавивирусов, сконструировать короткие рекомбинантные полипептиды с минимальными нарушениями структуры доменов.
Цели и задачи исследования.
Основной целью нашей работы являлось изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков ЕиМВЗН.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: исследование иммунохимических свойств рекомбииантных полипептидов, моделирующих структуру белков ЕиМ ВЗН;
создание коллекций гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) против эпитопов белков ЕиМ ВЗН;
картирование белка Е ВЗН при помощи созданных МКА;
- исследование биологической активности полученных МКА
посредством реакций нейтрализации (РН) и реакции торможения
гем агглютинации (РТГА);
изучение перекрестной реактивности МКА с другими ф лави виру сами: вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) и вирусом Японского энцефалита (ВЯЭ);
поиск схожих по структуре эпитопов белков ргМ, М и белка Е
взн.
Научная новизна и практическая ценность.
В результате проделанной работы впервые получены рекомбинантные полипептиды, соответствующие иммунологически значимым участкам поверхностного структурного белка Е Российского штамма LEIV-Vlg99-27889-human (Vlg 27889) ВЗН.
Получены оригинальные коллекции гибридом путем слияния клеток мышиной миеломы NS0 и клеток селезенки мышей линии Balb/C, иммунизированных полученными рекомбинантными полипептидами: двенадцать типов МКА распознавали участок 1-180 аминокислотных остатков (а.о.) и семь типов МКА - участок 260-466 а.о. белка Е ВЗН.
Впервые получены МКА, распознающие район 86-126 а.о. домена II, где расположен пептид слияния (98-110 а.о.) флавивпрусов, который обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембран.
Ранее Протопоповой Е.В. были получены МКА 10Н10 против
эпитопа белка Е ВКЭ, распознающего клеточный рецептор - ламинин
связывающий белок (Протопопова Е.В. с соавт., 1996). Картирование эпитопа
для антирецепторных МКА 10Н10 между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН
показало пространственную близость пептида слияния и ко-рецепторного района белка Е, взаимодействующего с ламинисвязывающим белком (ЛСБ) на поверхности клеток,
Мозаичность взаимодействия МКА с короткими рекомбинантными
полипептидами и белком Е вируса клещевого энцефалита позволила выявить
не менее шести различных антигенных детерминант в составе доменов I и II
гликопротеина Е ВЗН. Результаты конкурентного ИФА позволили
идентифицировать не менее 7 различных эпитопов в составе участка 260 -
466 а.о. гликопротеина Е ВЗЫ. Полученные данные показали, что полипептид
Е26о-4йґ> содержит эпитопы, индуцирующие образование
вируснеитрализующих антител и антител с антигем агглютинирующей активностью.
Впервые созданы рекомбинантные полипептиды с аминокислотной последовательностью, соответствующей белкам М и его предшественнику ргМ. Получены оригинальные МКА, распознающие эпитопы белка М ВЗН.
Показана возможность индуцирования вируснеитрализующих антител белком М ВЗН. Впервые описано наличие эпитопов со схожей структурой в пределах 260-466 а.о. белка E и белка М ВЗН.
Полученные данные важны для разработки полиэпитопных вакцин, не несущих дополнительной антигенной нагрузки. В результате проведенной работы получены видоспецифические антитела и рекомбинантные полипептиды, которые могут быть использованы для разработки
диагностических систем и терапевтических средств. Дальнейшее
исследование ранних этапов взаимодействия ВЗН с клеткой хозяина с помощью созданных МКА поможет найти новые подходы к предотвращению заболевания ЛЗН,
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
Международная школа - семинар "6th John Humphrey advanced summer programme in immunology", Пущино, 2002;
Международная конференция " Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека", Судак, 2004;
Международная конференция "Chemical and Biological Problems of Proteomics", Новосибирск, 2004;
Международная конференция FEBS "Frontiers of cellular microbiology and cell biology", Сан Фелиу, Испания, 2004;
- Международная школа - семинар DAAD ""Current trends in
comparative immunology", Санкт-Петербург, 2005;
- Всероссийская научно - практическая конференция "Современная
ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке",
Томск, 2006;
- Международная конференция FEBS "Interface of cell biology and
cellular microbiology. Macromolecular complexes in microbial pathogenesis,
membrane trafficking and cell signalling", Сан Фелиу, Испания, 2006;
- Российская научная конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2006.
По материалам диссертации опубликована статья. Данные получены лично автором и в соавторстве с к.б.н, Протопоповой Е.В., к.б.н. Терновым В.А., Ивановой А.В., к.б.н. Качко А.В., к.ф.-м.н. Иванисенко В.А.
Положения, выносимые на защиту:
Рекомбинантные полипептиды ЕМ80, Е53-і2б, ЕК86, Е2йо-4бб, ргМ, Мзі„75-Е]_зо имитируют соответствующие участки гликопротеина Е и белков М, ргМ ВЗН.
Получены три коллекции гибридом: из двенадцати типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка .1.-180 а.о. белка Е ВЗН; из семи типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН; из гнести типов гибридом, синтезирующих видоспецифические МКА против участка 31-75 а.о. белка М ВЗН.
Обнаружено 13 различных антигенных детерминант в структуре белка Е ВЗН: 6 эпитопов между 1-180 а.о. белка Е ВЗН, 7 эпитопов - в составе участка 260 - 466 а,о. белка Е ВЗН, включая индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Не менее четырех эпитопов в структуре участка 31 - 75 а.о. белка М
ВЗН.
Локализован эпитоп для МКА 10Н10, распознающих сайт связывания гликопротеина Е ВКЭ с ламининсвязывающим белком, между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН.
Локализованы группо - и типоспецифических эпитопы в пределах участков 1 - 180 и 260 - 466 а.о. белка Е ВЗН.
6. Показано сходство по структуре эпитопов, локализованных между
260 -466 а.о. гликопротеина Е ВЗН и 31-75 а.о. белка М ВЗН.
Мш-юклональные антитела против структурных белков ВЗН и их использование для изучения антигенной структуры.
Создание панелей МКА против структурных белков ВЗН вызвано необходимостью получения специфических реагентов для развития диагностики, фундаментальных исследований изменчивости структуры поверхностных белков штаммов ВЗН, проникновения ВЗН в клетку хозяина и цикла размножения ВЗН в клетке.
Группоспецифические эпитопы в структуре белка Е ВЗН были детектированы с использованием коллекции МКА против ВЯЭ (Kimura-Kuroda J. et a/, 1986) и панели МКА против ВКЭ (Niedrig М. et al, 1994).
В 1982 году Peiris J.S. с соавт. создали три типа МКА против белка Е прототипного штамма Egypt 101 ВЗН, включавших МКА подкласса lgG2a, обладающее вируснейтрализующей активностью, и два типа МКА подкласса TgGl с антигемагглютинирующей активностью. Все три типа МКА обладали свойством усиливать репликацию ВЗН на клетках мышиных макрофагов P388D (Peiris IS. etal, 1982).
В 1988 году Besselaar T.G. и Blackburn N.K. сообщили о создании коллекции, включающей 17 типов МКА против белков Е, NS1 и NS4A южноафриканского штамма Н442 ВЗН, Анализ взаимодействия полученных МКА с белками 16 южноафриканских изолятов позволил идентифицировать две антигенные группы ВЗН, циркулирующих на территории Южной Африки (Besselaar T.G. et al, 1988). В 1990 Mathiot С.С. посредством иммунофлюоресцентного анализа эпитопов с использованием панели девяти типов МКА показал близость структуры штаммов ВЗН, выделенных на территории Бангладеша и Центральной Африканской Республики от людей и комаров, и ее отличие от белков прототипного штамма Egypt 101 ВЗН (Mathiot С.С. et al,)990), Подобный анализ с помощью коллекции МКА позволил выделить 5 групп среди 52 изолятов ВЗН, выделенных на Мадагаскаре с 1978 года (Morvan J. et al, 1990).
В 1991 году получение трех типов группоспецифических МКА и двух типов типоспецифических МКА против белка Е вируса Кунжин, циркулирующего на территории Австралии, было описано в работе Hall R.A. Не менее четырех эпитопов в пределах белка Е было картировано с помощью полученных МКА. Позднее результаты ИФА с использованием созданных МКА показали наличие не менее трех антигенных типов вируса Кунжин на территории Австралии (Adams S.C. et al, 1995).
В 1988 Darale сообщил о создании 9 типов МКА против белка Е штамма Индия 804994 ВЗН и 5 типов МКА против белка Е штамма Египет 101 ВЗН. 14 типов МКА согласно данным кросс - реакций были разделены на видоспецифические и группоспецифические МКА (Damle R.G. et а/, 1998). После вспышки ЛЗН в 1999 году в Нью-Йорке в рамках создания системы глобального наблюдения ArboNet за распространением ВЗН по территории Северной Америки идет разработка систем детекции ВЗН в образцах, получаемых от птиц и комаров. Успешное использование МКА при разработке диагностических систем было описано Hunt A.R. в 2002 году, BUtvich B.J. в 2003 году. Девять типов МКА против гликопротеина Е ВЗН было получено при использовании трех различных стратегий иммунизации: инактивированньш вирусом, плазмидой, содержащей целевой ген, и рекомбинантным белком, большинство (7 типов) взаимодействовало с доменом III (Sanchez M.D., 2005). Четыре МКА обладали вируснейтрализующей активностью и связывались с одним и тем же эпитетом домена III с высокой активностью. Способом конкурентного анализа было картировано четыре эпитопа в пределах домеыа Ш и один на домене I. Вируснейтрализующие антитела были получены при иммунизации инактивированньш вирусом и при комбинации с ДНК плазмидой. Антитела без вируснейтрализующей активности являлись протективными и перекрестно взаимодействовали с рядом флавивирусов, включая вирус энцефалита Сент - Луис, Японского энцефалита, желтой лихорадки и вируса Повассан. Из них три типа МКА взаимодействовало с доменами I и III белка Е. МКА шести типов распознавали белок Е в иммуноблотте только при условии частичной денатурации в SDS-PAGE, что показывает наличие конформацинных эпитопов в составе III домена. Обработка вирионов ВЗН при рН 4,0 не нарушила распознавания вируса методом ИФА, тем самым подтвердив сохранность эпитопов домена III при кислом рН. Полученные МКА связывались с 306, 307, 330 и 332 а.о. домена III.
С помощью МКА 5Н10, 5С5, 7Н2 против рекомбинантного полипептида, моделирующего домен Ш белка Е североамериканского штамма USA99b, было картировано три эпитопа в пределах домена III (Beasley D.W.C. et al, 2002). В 2005 году описана коллекция гибридом, секретирующих МКА против Российского штамма ВЗН, 9 из 16 типов МКА распознавали гликопротеин Е в иммуноблотте, МКА обладали вируснейтрализующей активностью (Razuraov LA. et al., 2005).
Рекомбинантиые белки, моделирующие структурные белки Е и М флавивирусов
В настоящее время получены данные об успешном использовании технологии получения рекомбинантных белков для моделирования иммунологи чески значимых участков белков флавивируеов. Рекомбинантные белки, моделирующие структурные белки Е и М ВКЭ.
В 2001 году группа оксфордских ученых (Marx F. et al, 2001) представила данные об эффективности использования бакуловирусной системы для экспрессии белка Е ВКЭ. В данной системе были экспрессированы полноразмерный белок Е и белок Е без трансмембранного сегмента (Etr),, использованный в дальнейшем для изучения методами ИФА и иммуноблота взаимодействий между данным белком и антителами сывороток людей, вакцинированных против ВКЭ. Результаты исследований подтвердили, что рекомбинантный Etr имеет антигенную структуру, необходимую для распознавания антителами против ВКЭ. Формирование субвирусных частиц ВКЭ, стабильных при наличии якорной части белка Е, при совместной экспрессии в Cos - клетках белков Е и М было описано Allison с соавторами в 1995. В 2003 году была проведена совместная экспрессия белков РгМ и Е ВКЭ в клетках насекомых с использованием системы бакуловируса (Jaaskelainen A. et al, 2003). Секреция белков в культуральную среду происходила в виде вирусоподобных частиц. Полученные рекомбинантные белки реагировали с пятью МКА против ВКЭ и были успешно использованы в тест - системе при распознавании антител ВКЭ- М-позитивных сывороток. При проведении иммунофлюоресцентного анализа было зафиксировано связывание рекомбинантных белков ргМ и Е с антителами класса IgG против ВКЭ. В том же году группа японских авторов представила данные об успешном использовании экспрессированных в клетках млекопитающих в виде вирусоподобных частиц рекомбинантных белков ргМ и Е для диагностических целей (Kentarou Y. at al, 2003).
Методом ИФА было выявлено отсутствие перекрестных реакций между рекомбинантными белками РгМ и Е ВКЭ и антителами сывороток больных японским энцефалитом людей, подтвердив высокую специфичность новой тест - системы с использованием рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки, моделирующие структурные белки Е и М вируса Денге. В 1995 году был получен рекомбинантный штамм Е. соїі, продуцирующий химерный белок, состоящий из 204 а.о. С - концевой части белка Е вируса Денге-2, 65 а.о. N - концевой части белка NS1 и белка А стафилококка (Srivastava А. К. et al, 1995). Рекомбинантный белок взаимодействовал с поликлональньши и МКА против вируса Денге-2. Полученные против данного белка поликлональные мышиные антитела обладали вируснейтрализующей и антигемагглютинирующей активностью, обеспечивая защиту мышей при интракраниальном заражении вирусом. Денге-2. В 1998 году был экспрессирован рекомбинантный полипептид, соответствующий 298 - 400 а.о. домена III белка Е вируса Денге-2 (Е 298 400) (Ashok К. S. et al, 1998). Рекомбинантный полипептид Е 298-400 взаимодействовал с нейтрализующими МКА ЗН5 против вируса Денге-2 и с сыворотками людей, переболевших лихорадкой Денге. Путем иммунизации мышей полученным рекомбинантный белком были получены вирус нейтрализующие антитела, обладающие протективными свойствами. Иммуногенные свойства рекомбинантного белка, соответствующего 80% N концевой части белка Е вируса Денге-2 (г80Е), были оценены путем иммунизации макак резус (Putnak R.J. et al, 2005).
После первичной иммунизации г80Е в сыворотках 37 из 39 животных присутствовали вируснейтрализующие антитела против вируса Денге-2, после иммунизации бустером в сыворотках всех животных титр вируснейтрализующих антител составил от 1:100 до 1:9700. Иммунизация rSOE бвіла более эффективной по сравнению с иммунизацией инактивированным и живым ослабленным вирусом. Смесь четырех рекомбинантных полипептидов, соответствующих N -концевой части белка Е всех серотипов вируса Деиге, была успешно исполвзована для создания тест системы (Videa Е. et al, 2005). Рекомбииантный полипептид, соответствующий домену 111 белка Е вируса Денге, был использован для иммунизации мышей линии BALB/c Полученные поликлональные мышинвте антитела обладали вируснейтрализующей и протективной активностью (Mota J. et al, 2005) Рекомбинантные белки, моделирующие структурные белки Е вируса Западного Нила. В 2001 году Wang с соавторами получили рекомбииантный полноразмерный белок Е с использованием системы экспрессии Е. coll (Wang Т. et al, 2001). Рекомбииантный белок Е далее был успешно использован для предварительной разработки тест системы (Wang Т. et al, 2001). Иммунизация мышей полноразмерным рекомбинантиым белком Е обеспечивала протективный эффект, так же как пассивное введение поликлональных мышиных антител против данного белка, Важная роль домена III во взаимодействии ВЗН с клеточным рецептором подтверждается данными о блокировании проникновения ВЗН в клетки VERO и клетки комаров С6/36 рекомбинантным полипептидом с аминокислотной последовательностью, соответствующей домену III белка Е ВЗН (Chu J.J. et al, 2005). Данный полипептид был способен ингибировать проникновение ВЗН в клетки VERO и клетки комаров С6/36, а также частично блокировал проникновение вируса Денге-2 в клетки VERO и полностью блокировал проникновение вируса Денге 2 в клетки С6/36. Мышиная поликлональная сыворотка против рекомбинантного полипептида домена III ВЗН ингибировала инфицирование ВЗН и в меньшей степени вируса Денге-2, что было продемонстрировано с помощью реакции нейтрализации. Таким образом, ранее была показана возможность успешного моделирования как полноразмерных белков Е и М флавивирусов, так и функционально значимых отдельных доменов с сохранением антигенной структуры. Полученные поликлональные и МКА против рекомбинантных полипептидов успешно использовались для разработок в сфере диагностики и фундаментальных исследований. Успешность технологий создания рекомбинантных белков флавивирусов явилась предпосылкой для использования данной техники при исследовании белков Российского штамма Vlg99-27889 ВЗН.
Моделирование трехмерной структуры белков Е и М флавивирусов.
Компьютерный анализ 3-D структуры белков Е и М проведен Иванисенко В.А. (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Для построения полной пространственной структуры белка Е ВЗН были использованы данные Protein Data Bank о пространственной структуре домена Ш белка Е ВЗН (PDB ID 1S6N), полученные с помощью техники ядерного магнитного резонанса (Volk D.E. et al, 2004). Более полная пространственная структура белка Е ВЗН была получена при реконструкции координат атомов для данного белка с использованием программы предсказания пространственных структур белков ESyPred3D (Lambert С. et al, 2002). В качестве референс образцов использовались данные о структурах белка Е ВКЭ (PDB ID 1SVB) и вируса Денге (PDB Ш 10КЕ). Совмещение пространственных структур осуществлялось с помощью программы MultiProt (Shatsky М. etal, 2002). В работе использовалась пространственная структура комплекса белков Е и М вируса Денге (PDB ID 1р58), полученная с применением криоэлектронной микроскопии, как модель для вируса ВЗН, Структурное выравнивание последовательностей белков Е и М вируса Денге и ВЗН проводили с использованием программы СЕ (Shindyalov I.N. et а!, 1998). Данное выравнивание последовательностей использовалось как профиль для построения множественного выравнивания между белками Е, М и РгМ. Множественное выравнивание осуществляли с использованием программы ClustalW с применением опции выравнивания профиля с поел едо вател ьн остью. Константа аффинности для взаимодействия МКА и рекомбинантного полипептида РгМ определялась по изотерме связывания, полученной методом ИФА, описанным выше. Для этого теоретическая зависимость изотермы связывания подгонялась к экспериментальным точкам методом наименьших квадратов.
В качестве теоретической зависимости использовалась модель моновалентного связывания, которая описывается уравнением: В = - - —, где В - концентрация связанного белка, R - общая KD + L концентрация вирусных рецепторов, L - концентрация свободного белка и Ко - константа диссоциации (величина обратная константе связывания) (Варфоломеев С.Д. и др., 1999). Расчеты проводились при помощи программы Origin 6.1. Класс и подкласс МКА определяли методом ИФА с использованием козьих антител против подклассов иммуноглобулинов мыши по прилагаемой к набору ("Sigma", США) инструкции. Методом ОТ ПЦР были получены фрагменты кДНК ВЗН 935-1475, 1091-1310, 935-1193, 1712-2333, 878-1088, 466-966 п.н. (LEIV-Vlg99-27889-human, Gene bank locus, AY277252). Фрагменты были очищены с помощью набора S.N.A.P. Gel Purification Kit ("Invitrogen", США) и клонированы в плазмиды pCR/T7/NT ("Invitrogen", США). В результате были получены рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты кДНК ВЗН, кодирующие полипептиды Е]_шь Е53.ш, Ei_S6, Е2бо-4бб, М31.75-Е1-30. ргМ соответственно. Полученными плазмидами были трансформированы клетки E.coli BL21(DE3)pLysS ("Invitrogen", США). Индукцию синтеза рекомбинантных белков проводили добавлением к культуре клеток (А6оо 0.5-0.8) изопропил-D-тиогалактозида (IPTG) до конечной концентрации I тМ. Бактериальную культуру после добавления IPTG инкубировали в течение 4-6 часов. Очистку рекомбинантных белков проводили методом афинной хроматографии на Ni-NTA агарозе («QIAGEN», Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Концентрацию белка в очищенных препаратах рекомбинантных полипептидов измеряли с помощью набора Bio-Rad Protein Assay ("Bio-Rad", США). Картирование антигенных детерминант при помощи рекомбинантных полипептидов позволяет уточнить расположение антигенно значимых районов вирусных белков (Кеннет Р. Г. и др., 1983) Этот подход был ранее успешно использован для вирусов Марбург и Эбола (Рудзевич Т.Н. и др., 2003; Sorokin A.V. et al, 2002). В данной работе был использован этот же подход для картирования антигенных детерминант доменов белка Е ВЗН, а также исследования иммунохимических свойств белков М и РгМ ВЗН. Принципиальным отличием использованного подхода было наличие данных рентгеноструктурного анализа белка Е ВКЭ (Rcy F., 1995), что позволило, используя структурную схожесть белка Е флавивирусов, сконструировать короткие рекомбинантные полипептиды с минимальными нарушениями структуры доменов. Для построения полной пространственной структуры белка Е ВЗН были использованы данные Protein Data Bank о пространственной структуре III домена белка Е ВЗН (PDB ID 1S6N), полученные с помощью техники ядерного магнитного резонанса (Volk D.E. et al, 2004). Более полная пространственная структура белка Е ВЗН была получена при реконструкции координат атомов для данного белка с использованием программы предсказания пространственных структур белков ESyPretDD (Lambert С. et al, 2002). В качестве референс образцов использовались данные о структурах белка Е ВКЭ (PDB ГО 1SVB) и вируса Денге (PDB ID 1 ОКЕ). Совмещение пространственных структур осуществлялось с помощью программы MultiProt (Shatsky М. et al, 2002). При совмещении трехмерных структур белков Е вирусов Денге, ВКЭ и ВЗН, представленным на рисунке 9, было выявлено их значительное сходство. Выявленное сходство 3D структур гликопротеинов Е флавивирусов, наряду с данными по схожести их первичных и вторичных структур (Rey F. et al, 1.995) позволило использовать полученные ранее данные по картированию белка Е флавивирусов для выбора иммунологически значимых участка гликопротеинаЕ ВЗН.
Изучение способности полипептидов Еі і8о, Егбо-4бб ргМ имитировать антигенную структуру белков Е и РгМ ВЗН.
Полученную коллекцию MKAEI-180 использовали для исследования взаимодействия МКА с рекомбинантньши полипептидами Е\.$б, В52.ш, Емко. Полученные данные представлены в Таблице 7. Четыре типа МКА (2Н5, 2В9, ЗС7, 10Н10) взаимодействовали с полипептидом Е б , а с полипептидом E53-126 реагировали десять типов МКА. (2В9 ЗС7, ТОНЮ, 7В4, 2С5, 2С6, 3D8, 4F1, 4G9, 6G5). С этими двумя рекомбинантньши лолипептидами взаимодействовали только МКА 2В9 и ЗС7, а также антирецепторные группоспецифические МКА 10Н10 против ВКЭ. Все исследованные МКА были способны взаимодействовать с полипептидом El-180- Эпитопы домена I. Поскольку МКА 2Н5 реагировали с полипептидом Е и не реагировали с Е5з-і2б , то можно предположить, что МКА 2Н5 узнают эпитоп в пределах 1-53 а.о, домена I белка Е ВЗН. В то же время, МКА 8G8 и 2НЗ не взаимодействовали с рекомбинантньши полипептидами Е_86 и Е53-126 и узнавали эпитопы только самого большого полипептида Е5_щ. По всей вероятности, эпитопы для этих МКА расположены в пределах домена I (137- 180 а.о.) или домена ТІ (126-136 а.о.) гликопротеина Е ВЗН. Эпитопы домена П. Взаимодействие МКА 10Н10, 2В9 и ЗС7 с двумя рекомбинантньши полипептидами EbS6 и Е5м26 показывает наличие эпитопов для этих МКА в пределах 53-86 а.о. домена II гликопротеина Е ВЗН. Из этой группы выделяются группоспецифические МКА 10Н10 к ВКЭ, которые способны узнавать эпитоп общий для ВЗН и ВКЭ, и тем самым отличающийся от эпитопов для МКА 2В9 и ЗС7, которые специфичны для ВЗН. Можно также предположить (на основании представленных в таблице 7 данных), что МКА 6G5, 4G9, 7В4, 2С5, 2С6, 3D8 и 4F1 взаимодействуют с эпигонами, расположенными в пределах 86-126 а.о. домена П гликопротеина Е ВЗН. Из этой группы антител удается выделить только МКА 6G5, взаимодействующие с ВКЭ с титром 1/24300 (таблица 6), указывая на наличие общего для ВЗН и ВКЭ эпитопа между 86 и 126 а.о. Гипотетическая модель расположения антигенных детерминант, узнаваемых МКА к доменам I и II гликопротеина Е ВЗН представлена на рисунке 16 (А, Б). Рис. 16В. Гипотетическая модель расположения антигенных детерминант, узнаваемых МКА к доменам I и II гликопротеина Е ВЗН. Модель строения участков гликопротеина Е, соответствующих 126 - 180, 86 - 126 а.о.. Для создания модели были использованы данные по трехмерной структуре белка Е ВКЭ и ВЗН, депонированные в Protein Data Bank (PDBID Isvb и PDB Id ls6n).
Первой структурной особенностью моделируемого района 1-180 а.о. белка Е является расположение в этом районе пептида слияния в районе 98-110 а.о.. Этот район находится практически в центре полипептида Е53-126- Нам удалось получить 7 типов МКА, узнающих район 86-126 а.о. домена П. Эти МКА эффективно взаимодействовали как с вирусным белком, так и с рекомбинантными полипептидами. Все это внушает оптимизм в отношении возможности изучения взаимодействия пептида слияния белка Е ВЗЫ и клеточных мембран при помощи полученной панели МКА к этому району гликопротеина Е ВЗН. Второй особенностью изучаемого района является взаимодействие с ним антирецепторных МКА 10HI0. Конкуренция этих МКА с ЛСБ при взаимодействии с гликопротеином Е ВКЭ указывает, что именно этот район белка Е является рецепторным или ко-рецепторным районом флавивирусов (Protopopova E.V. et al, 1999). Ранее район связывания МКА 10Н10 был картирован методом фагового дисплея для ВКЭ и он включал 73, 74, 76, 77, 103, 105, 107 и 112 а.о. домена П (Локтев А.В. и др., 2002.). В случае ВЗН район связывания антирецепторных антител достаточно однозначно картируется между 53 и 86 а.о. домена И. По всей вероятности, 103, 105, 107 и 112 а.о. не участвуют в формировании эпитопа, распознаваемого МКА 10Н10,дляВЗН. МКА 10И10 имеют группоспецифическую активность и способны реагировать с различными представителями флавивирусов, такими как вирус Японского энцефалита, ВКЭ и ВЗН (Протопопова Е.В. и др., 1996; Чешенко Н,В. и др., 1997; Белавин П.А. и др., 1997). Это дало основание предположить, что эпитоп, распознаваемый МКА 10Н10, достаточно консервативен и также связан с 53 и 86 а.о. домена II белка Е вируса Японского энцефалита, ВКЭ и ВЗН, Этот же район узнают еще два МКА 2В9 и ЗС7, но они не способны взаимодействовать с ВКЭ, что показывает наличие между 53-86 а.о. гликопротеина Е не менее двух различных эпитопов для МКА. В этом районе имеются две поверхностные петли, короткая ab - петля (61-64 а.о.) и более протяженная be - петля (73-89 а.о.). На рисунке 16А видно, что пептид слияния (cd-петля) флавивирусов пространственно расположен непосредственно рядом с be - петлей. Вышесказанное позволяет высказать гипотезу, что именно be - петля домена II является рецепторним районом, взаимодействующим с ЛСБ, а пространственная близость этого района с пептидом слияния указывает на возможность согласованного взаимодействия этих районов в процессе проникновения вирионов в клетку. Третьим аспектом, связанным с доменами I и И, является их возможная роль в формировании антивирусного иммунитета. Ранее было показано, что антитела против пептида слияния обладают вируснейтрализующей активностью (Butrapet S. et al, 1998). Это подтверждает значимость этих районов в индукции иммунного ответа и важную функциональную роль II домена. Полученные МКА позволят в дальнейшем более подробно исследовать механизм нейтрализации ВЗН и участия в нем эпитолов домена II. Другим доменом, отвечающим за индукцию вируснейтрализующих антител, является домен Ш (Beasley D.W.C. et al, 2002). Механизм нейтрализующего действия антител против этого района обычно связывают с ингибированием рецепторного района домена III. Наши результаты по исследованию коротких рекомбинантных фрагментов домена II показывают, что механизм нейтрализации флавивирусов значительно более сложен, чем считалось ранее. Вовлечение сразу нескольких районов гликопротеина Е в индукцию нейтрализующих антител требует пересмотра подходов к созданию вакцинных препаратов на основе коротких фрагментов белка Е, а также возможного поиска антивирусных препаратов, направленно блокирующих функцию отдельных районов гликопротеина Е флавивирусов. Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что полипептиды Емко, E.g6 и Е5з-12б полноценно моделируют эпитопы гликопротеина Е ВЗН. Двенадцать типов МКАЕ]_180 реагировали с вирусным гликопротеином Е ВЗН, что показало иммунохимическое подобие коротких рекомбинантных полипептидов и лолноразмерного белка Е ВЗН. Мозаичность взаимодействия МКАЕМ80 с короткими рекомбинантиыми полипептидами и белком Е ВКЭ позволила выявить не менее шести различных антигенных детерминант в составе доменов I и II гликопротеина Е ВЗН. 7 типов МКА узнавали район 86-126 а,о. домена II, где расположен пептид слияния (98-110 а.о.) флавивирусов, который обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембран. Картирование эпитопа для антирецепторных МКА 10Н10 между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН показало пространственную близость пептида слияния и ко-рецепторного района белка Е, взаимодействующего с ламинисвязывающим белком (ЛСБ) на поверхности клеток. Пространственная модель белка Е позволила предположить, что Ьс-петля (73-89 а.о.) домена II взаимодействует с ЛСБ и вместе с cd-петлей (пептид слияния) участвует в ранних фазах проникновения вирионов флавивирусов в клетку.
