Введение к работе
Актуальность проблемы. На современном этапе развития молекулярной зирусологии определены и проанализированы полные последовательности еномов большинства известных вирусных групп, что позволило сделать выводы эб их эволюционных связях и предсказать функции ряда вирусных белков. С завершением "эры сиквенса", основными направлениями современной зирусологии растений становятся исследования экспрессии вирусных генов, а также функциональный анализ кодируемых ими белковых продуктов.
Объектом данной работы является клостеровирус желтухи свеклы (ВЖС), типовой представитель рода Closterovirus семейства Closteroviridae. Спостеровирусы имеют очень большие позитивные РНК геномы и обладают эядом уникальных свойств организации генома и структуры вирионов. Гибкие нитевидные частицы клостеровирусов имеют морфологически полярную структуру (получившую название структуры "гремучей змеи"), в которой небольшой концевой сегмент покрыт минорным 24-кДа структурным белком (СБ), тогда как большая часть инкапсидирована мажорным 22-кДа СБ (Agranovsky et зі., 1995). Следует отметить, что структура такого рода уникальна для нитевидных вирусов, и способы ее сборки и функциональный смысл пока не «учены. Исследование положения молекулы РНК внутри частицы ВЖС является первым шагом для решения этой проблемы, открывающей перспективы для построения моделей сборки вириона ВЖС и его диссоциации на ранних этапах инфекции в клетке, а также взаимодействия различных сегментов вириона с эелками растений-хозяев и насекомых-векторов.
Одной из характерных особенностей экспрессии консервативных генов репликазы ВЖС [открытых рамок считывания (ОРТ) 1а/1Ь] является автопротеолиз папаин-подобной протеиназой, приводящий к выщеплению N-концевого фрагмента с мол. весом 66 кДа (Agranovsky et а/., 1994а). В настоящей работе были получены плазмидные конструкции для экспрессии фрагментов ОРТ 1а в бактериях, отработаны методы очистки рекомбинантных фрагментов белка 1а и получены высокоспецифичные моноклональные антитела (монАТ) к консервативным доменам репликазы ВЖС. С помощью монАТ была впервые .оказана экспрессия ОРТ 1а ВЖС in vivo и определена локализация компонентов
репликазного комплекса в субклеточных фракциях. Обнаружение продукті экспрессии репликативных генов клостеровируса в зараженных растени: представляется перспективным для последующего изучения процессі репликации вирусной РНК и локализации субклеточных структур, в которых оі происходит.
В геномах клостеровирусов закодирован также ряд неконсервативнь белков с неизвестными функциями. Один из таких белков (р21) закодирован ОРТ 8 ВЖС. Получение специфичной антисыворотки к р21 и определені локализации данного белка в зараженных тканях растений, проделанные данной работе, важны для последующего изучения функции р21 и для поисі клеточных белков, которые могли бы взаимодействовать с ним.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработі методов иммунологического обнаружения ряда структурных и неструктурнь белков ВЖС и изучение их локализации в вирионе и в зараженной клетке. В хо/ исследования решались следующие задачи:
экспрессия рекомбинантного белка р21 ВЖС и получение специфичнс поликлональной антисыворотки к этому белку;
определение локализации р21 in vivo с помощью полученных антител;
разработка методов определения участка геномной РНК ВЖС, покрыто минорным СБ в вирионе, и картирование этого участка;
- получение моноклональных антител к консервативным домена
метилтрансферазы (МТ) и хеликазы (ХЕЛ) в белке 1а ВЖС;
- исследование экспрессии и субклеточной локализации репликативнь
белков ВЖС в зараженных растениях с помощью моноклональных антител.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работ была осуществлена экспрессия неструктурного белка р21 ВЖС в Е. coli получена антисыворотка к рекомбинантному белку. С помощью серологическог анализа р21 был идентифицирован в зараженных растениях.
Были разработаны новые методы для решения задачи картирования конц вирусной РНК, покрытой в составе вириона минорным СБ. Полученные с и помощью результаты позволяют сделать вывод о локализации минорног сегмента вириона на 5'-конце РНК ВЖС. Авторская методика, использовавшаяс для решения поставленной задачи, может в дальнейшем применяться дл
пределения локализации минорного СБ в вирионах других клостеровирусов.
Получены моноклональные антитела к метилтрансферазному и еликазному доменам продукта ОРТ 1а ВЖС; впервые показано, что in planta энные домены присутствуют в составе отдельных белковых фрагментов, а не в дном большом белке, как предполагали ранее. Результаты могут иметь пределенное практическое и теоретическое значение для дальнейшего зучения схемы процессинга клостеровирусных репликативных белков.
Полученные в работе поликлональные и моноклональные антитела могут 'ыть использованы для диагностики клостеровирусной инфекции.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном аседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела 'Иохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. АН. іелозерского 16 марта 1998 г. Материалы исследований, представленных в аботе докладывались на международных конференциях: "Lomonosoff-98" Москва, 1998), "Biocatalysis-98: fundamentals and applications" (Пущино, 1998), на I Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и находится в ечати 6 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение",
Эбзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", список
итированной литературы включает более 200 публикаций. Работа
зложена на страницах, содержит 13 рисунков и 2 таблицы.