Введение к работе
Актуальность проблемы.'.. Впуо гепатита Б (hbv) является
озбудителем тяжелого инфекционного заболевания, порззащего
ече.л человека. По .оценкам ВОЗ более 300 мдн. человек в мире
зляются хроническими носителями этого вируса. Эпидемиологические
энные о распространении этого заб левания в СССР достаточно
эотиворьчизы. Есть сведения, что в СССР- ежегодно заболеввют
фусньіми гепатитами до Імлн. человек, при этом, доля больных
шатитом В составляет около 133. Особенно ваяна возможность
--редачи вируса ноюрсжденкым от hbv-поэиткбных матерей. По данным
.rgoiis у 70-80 детей, рожденных в США от матерей-носительниц,
ігистрируется наличие hbv. Эпидемиологические исследования
демонстрировали,, что возникновение гепатоцеллюлярной карциномы,
ного из наиболее распространенных в мире онкологических
оолеваний мохэт являться следствием HBv-носительства. В
стоящее время hbv ЗЛЯ6ТСЯ одним из немногих вирусов, участие
горых в рззвитии онкологического заболевания доказано.
В связи с Быиеиалозенным огромное значение приобретает
фвоотка новых вакцин против гепатита В.- hbv не способен
іектиБНо' размножаться в клеточных культурах,. что- существенно
юаняет создание противогепатитной вакцины.; Суа^ствущая в
!тоящее время плазматическая вакцина из ийаз*ы хронических
'-носителей, наряду с несомненными достоинствами имеет. ряд
ествеккых недостатков, что и определилj 4 дазвитяе нового
раэления - разработки рзкомбинантной і^тизогепатлтной вакцины.
настоящее время сконструировано несколько вариантов
омбинатяой вакцины против hbv, основанных на использовании
шей для синтеза в них вирусного, антигена,'.либо- на
эльзввании з качестве вектора: кяуса, зкспрессирувдего белки
. Особый интерес представляет возможность создания
ю-инженерной яизой вакцины против гепатита В к" основе одного
представителей семейств? ноксвирусоз - вируса 'осповакцины.
Основой для всех существущих вариантов противогвпатитно! ваища сдугат юверхнрстаьй антиген вируса гепатита В (HBsAg) который является. одним из ключевых, 'антигенов, индуцирущиз выработку в организме зіфус-нейтрализуицих антите". Поэтому особьй интерес представляет .изучение антигенной структуры белков, входалщ--, в "состав поверхностного антигена wbv, в частности, соотношение различных антагенны*. детерминант HBsAg. По-видт'мому, рекомбинашкые протиьигепатитаые вакцины следупрх поколений буду!
ОСК.занЫ ЧВ ИСПОЛЬЗОВаНИИ раЗЛИЧНЫХ КОМПОНЄНТОВ HBsAg или из
отдельных доменов, несущих наиболее существенные антигенные де.ерминаяты.
Цель и задачи исследования. В задачи проведенного нами исследования входи)..]
I.Изучение антигенной структуры и соотношения между антигенными детерминантами поверхностного антигена вируса гепатита В.
-
Анализ иммуногекности препаратов HBsAg, полученных из , сыворотки крови человека и рекомбинантного дрожжевого штамма.
-
Сравнительный анализ »ммукогвшости разных вариантов
рЭКОМЗИНаНТКЫХ ВИРУСОВ ООПОВаКЦИНЫ, ЭКСПреССИруХЩИХ HBsAg.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной роботы нами был впервые разработан комплекс вариантов иммунофернентного. анализа (Ш), позволящий выявлять дао
Важнейшие аНТИГеННЫе ДеТермИНаНТЫ . HBsAg (а . и
presa-детерминанты), участок связывания г. полиальбумином и их соотношение в природном и рекомЗшантном нвздд, а также антитела к Э1им детерминантам и к белкам вируса осповакцины.
С домощьэ описанных вариантов ЙФА впервые была обнаружена и иг~чена гетерогенность популяции HBsAg-содержащих частиц . в сыворотках человека по содержаний полизльбумин связывавдих участков.На основании анализа тгой гетерогенности предлохена к<шая
юдель взаимодействия р.-*2г-сод9р^аи{йх:.- 'частиц.. . HBsAg с :олрэд~ркзовйнным сьвороточньм альбумином человека..
Описанные варианты ІШ использованы для.оЦбШі шяукогенности оксвирусмд рекомбшзнтов, эксцрессиругащ HBsAg. в результату равнительного анализа ищрногекностй . семи . вариантов '
ЭКОМбШаНТНЬЕ ВИРУСОВ ОСГОВаКЦИНЫ (РВОВ), ЗКСПрЭССИруЩИХ НЗзАд,
отношении антигенных дв'тчрмйртет HBsAg,, '; и, белков вируса жвакшны, показано, что FB0B, сконструированше на основе ужа vss более иммуногенны для. мышей, чем РВОЗ на основе, штамм^ ster; ТК+зарианты РВОВ более иммуногенны, чем - Инварианты, итаи'е ргезг-области -в составе' -гена, . айспрессируемого
КОМбШаНТОМ,, СНИЖЗеТ-ВДДУКЩт аНТЙТеЛ К а-ДетерМИНаНТе HBsAg, но
дуцирует образование антител к presa-детерминанта HBsAg. При авнении иммуногенности семи вариантов РВОВ обнаружена корреляция вд накоплением антител к . белкам. ..вируса осповакцины и
ЮШІЄШЄМ аНТИТеЛ К ЗКСПреССИруеМОМУ РВОВ HBsAg.
Разработанные варианты иммуноферментного анализа могут быть юльзовэны для анализа содерз8ндаг антигенных детерминант в каратах HFsAg, применяемых для вакцинации, ' а ' также для івкительной оценки иммуногенности различных типов рекомбинантной тивогепатитной В8кциньі. Данные по сравнительной иммуногенности иантов РВОВ» экспрессиругащ HBsAg, могут быть использованы при оре наиболее иммуногеннкх штаммов да вакцинацій'.
Основные положения, выносимые на защиту.
I.Разработаны варианты №;мунсферментного анкЙїза, позволящие гчественно .оценить наиболее важные антигенные детерминанты i,g (а к рі-езг) и участки связывания с полизльбу№шом в гаражах природного и рекомбшантного kbsAo, а также антитела к
2.Обнаружена к изучена гетерогенность . популяции з-содоржащих частиц в сьворотках больных гепатитом В з
отношении активности шлиальбумин связыващих участков. Ї основании анализа этой гетерогенности предложена новая MOflej взаимодействия ргезг-содераащш частиц нвзАд с полимеризованш сывороточным альбумином человека.
3.Проведен сравнительный анализ иммуногенности разлічи вариантов рекомбинвнтного вируса осповакцины, экспрессиругащ нвзАд, в результате которого показано, что иммуногенкос рбкомбинантных вирус з оспозакцины зависит от птамма ь.фуі -ве" Х'ра, от его ТК-фенотша и от размеров встроенного ген: При сравнении иммуногенности семи вариантов рекомбинанткых вирус< осчовакцины обнаружена корреляция между накоплениям антител белкам вируса осшзэкцикы и накоплением антител к зкспрессируемої
ВИруСОМ HBsAg.
Апробация работы. Материалы диссертации были долохены : конференции "Новые направления биотехнологии" в г.Пущино в 1992г Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совмести . конференции Отдела структуры и функции. микроорганизмов Институ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН и Лаборатор генетики вирусов Института биологии гена РАН 18 марта IS92r.
Публикации. ПО матовала?' диссертационной работы опуоликова 3 работа.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит введения, обзора литературы, акспериментальной части, вкшочащ методический раздел, результаты собственных исследований с обсуждением, выводов, а такке раздела библиографии. Общий объем работы составляет 100 страниц машинописного текст включая 7 рисунков и 10 таблиц и библиографир - 134 чсточкк отечественной'и зарубежной литературы.