Введение к работе
Актуальность темы. Отсутствие на фармацевтическом рынке достаточного выбора противовирусных химиопрепаратов обусловлено, прежде всего, особенностями жизненного цикла возбудителей вирусы являются клеточными паразитами, подчиняющими себе репликативный и метаболический аппарат клетки-хозяина, и невозможно влиять на жизненный цикл вируса, не затрагивая клетку, поэтому для большинства веществ существует проблема общей и селективной токсичности Кроме того, в результате мутаций появляются устойчивые к действию данного вещества вирусные субпопуляции, вакцинопрофилактика вирусных инфекций в ряде случаев затруднена появлением новых антигенных вариантов возбудителя, а значит, химиотерапия вирусных инфекций часто является единственным средством лечения Поэтому поиск новых препаратов и подходов в терапии инфекционных вирусных заболеваний остается крайне актуальным
Можно выделить две группы веществ, используемых в терапии вирусных инфекций вещества, непосредственно ингибирующие вирусную репродукцию на разных стадиях и вещества - индукторы эндогенного интерферона, а также коммерческие препараты интерферона
Известные индукторы интерферона - циклоферон, неовир, камедон ,амиксин (тилорон) - обладают широкой противовирусной активностью, иммуномодулирующим и противоопухолевым действием Вместе с тем, учитывая разнообразие их фармакологических свойств, изучены они недостаточно
Поиск новых веществ, имеющих противовирусные свойства, ограничивается, в основном, производными пуринов и пиримидинов, и, как правило, это дериваты уже известных препаратов, например, ацикловира или зидовудина (de Clercq Е, 1997, Киселев О И и др , 1999) В то же время, многие проблемы, связанные с применением противовирусных препаратов, можно решить включением их в полимерную матрицу (Плата Н А , 1986) Благодаря этому повышается их эффективность, снижается токсичность, преодолевается эффект вирусной резистентности, регулируется продолжительность действия и скорость выведения из клетки и организма (Киселев О И , 1999)
Одним из направлений в разработке новых препаратов направленного противовирусного действия является использование специфических
олигонуклеотидных последовательностей, которые взаимодействуют только с комплементарными нуклеотидными участками соответствующих нуклеиновых кислот Поскольку используемые олигонуклеотидные последовательности комплементарны участкам кодирующих, т е смысловых (sense) цепей нуклеиновых кислот, их принято называть анти-смысловыми (antisense) олигонуклеотидами Антисмысловые олигонук-леотиды могут выступать в качестве ингибиторов вирусной репликации Так, препарат фомивирсен, представляющий собой антисмысловой оли-гонуклеотид, эффективен при терапии ретинита, вызванного цитомега-ловирусом, у больных СПИД (Wiegand Т W , Young L Н, 2006) Однако лишь малая часть чужеродной ДНК проникает через клеточную мембрану, и, попав в цитоплазму, очень быстро деградирует под действием клеточных ферментов Полимерные катионы образуют с ДНК устойчивые комплексы, с высокой эффективностью транспортируют ее внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз, и имеют ряд преимуществ удобство в хранении и очистке, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений Наиболее широко используются в генотерапевтических исследованиях поли(Ь-лизин), поли-этиленимин, полидиметиламиноэтилметакрилат, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные липиды, хитозан - катионный полимер глюкозамина
Цель исследования. Целью настоящего исследования явилась характеристика биологических и физических свойств комплексов полиал-лиламина, полидиметиламиноэтилметакрилата и их производных с плаз-мидной ДНК и антисмысловыми олигонуклеотидами для ингибирования репродукции вируса герпеса 1-го типа и цитомегаловируса человека
Задачи исследования.
-
Изучить эффективность связывания исследуемых полиаминов с ДНК
-
Исследовать токсичность полиаллиламина, полидиметиламиноэтил-метакрилата и их производных в культуре клеток
-
Изучить трансфекционную активность интерполиэлектролитных комплексов полиамин-ДНК in vitro
-
Исследовать противовирусное действие полиаминов в культуре клеток
-
Изучить влияние интерполиэлектролитных комплексов полиаминов с антисмысловыми олигонуклеотидами на репродукцию вируса простого герпеса 1-го типа и цитомегаловируса в культуре клеток
Научная новизна.
-
Впервые показано вирулицидное действие полиаллиламина, полиди-метиламиноэтилметакрилата и их производных в отношении вируса простого герпеса и цитомегаловируса in vitro
-
Впервые показано, что низкомолекулярные полиаллиламин и далиди-метиламиноэтилметакрилат в низких концентрациях эффективно переносят ДНК в эукариотические клетки m vitro, не проявляя токсичности
-
Разработан высокоэффективный способ трансфекции эукариотиче-ских клеток
-
Впервые показано, что антисмысловые олигонуклеотиды в составе интерполиэлектролитных комплексов с полиаллиламином, полиди-метиламиноэтилметакрилатом и их производными способны проникать в клетки и интибировать вирусную репродукцию
Научно-практическая значимость работы. Полученные в рамках проведенных исследований данные о физико-химических и биологических свойствах интерполиэлектролитных комплексов синтетических поликатионов с ДНК имеют большое практическое значение для развития генотерапевтических методов Разработан быстрый и эффективный способ трансфекции эукариотических клеток с помощью катионных полимеров В результате проведенных исследований показана возможность использования интерполиэлектролитных комплексов антисмысловых олигонуклеотидов с синтетическими поликатионами для ингибирования вирусной репродукции, что представляет большой интерес для поиска новых подходов в терапии вирусных инфекций
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и их производные образуют устойчивые комплексы с ДНК, обеспечивая ее трансмембранный перенос и защиту от клеточных гидролаз
-
Антисмысловые олигонуклеотиды в комплексе с синтетическими поликатионами способны проникать в инфицированные клетки и интибировать вирусную репродукцию
-
Ингерполиэлектролитные комплексы полиаллиламина и полидиме-тиламиноэтилметакрилата с ДНК способны с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки и могут быть использованы для разработки средств генной терапии
Апробация работы.
Материалы по теме диссертации были представлены
1 3-й международный симпозиум "Molecular mobility and order in
polymer systems", С - Петербург, 1999 г
2 II Всероссийский Каргинский симпозиум "Химия и физика полиме
ров в начале XXI века", Черноголовка, 2000
-
Всероссийская научная конференция "Современные аспекты вакци-нопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций", С -Петербург, 2001
-
Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003
-
III Всероссийская Каргинская конференция "Полимеры - 2004"
-
5th hit Symp «Molecular mobility and order in polymer systems», S Petersburg, 2005
-
IV Всероссийская конференция, посвященная 100-летию акад В А Картина «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов, результатов иссле
дований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литера
туры Работа изложена на страницах машинописного текста, содер
жит таблиц, 26 рисунков Список литературы содержит /3J? наиме
нований на русском и английском языках
