Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время намечается язмене-ше отрагэгяи заши раатеняй и сельскохозяйственных продуктов, іредусматриващсе ограничение применения химических препаратов. Рачительно эозроо интєрєа к разработке новых путей рэгулироэа-[яя чиолениоогя вредных насекомых, учитывающих но только зконо— [кчсолие. по и экологические, [ледико-биологячсакив, оошальяые ЮП6КТН проблеми. С.этих позиций, основой современной а. будуаіей тратегии должна быть долговременная .актогргрованпая одстзма задеты раотопий, оочетапцая рациональное использование химичеозих, иологичеокнх орадотв..агротехнических, оргаднзгаионно-хозяйот-еннта я других мер. 3 рамках этой системи существенное практи-еокое значояие. приобретает бдолокгчеокай и, прежде всего мккро-пологетвекзй негод, ооеовзнеый на использовании естэотЕонных эл-омопятогеиоз - вирусов, бактерий, грибов я др., ссоообяых визнать эпззотие а популяциях вредителей и таким образом регулпро-іть их численность (0.А.Алешина,1982; В.Л.Ваоильеза, А.Л.Гураль,
3S9; H.t.HostBttar, CK.Ignoffo IS84; H.D.Bnrg33 IS87; ЬТагаа-
nohi 1987; K.B.Sendoi-bnd 1990).
Еольшуп перопекгйну янєої энтомоаатогеяные азруон. .Ияоекк--їдено препарат» на ах осново достаточно эффективна, экоасмичнн, oawoe главаоо, характвразуюїся наиболее энраяэнпоЗ среди еэйх «оыопатогоншк микроорганизмов избирательностью патогокпого до??~ гаая, которая оосіааляеі тэоретяческуа еонову гяраниш вх г^еди-їйской и зкологачеокой безопааноотя (И.ПЛ'ое, IS80; Е.В.Орлов-«ш, 1981; В.В.Гулнй и ооавт.,1982: ЗД.Ваоильева, А.Л.Гураль,
389; S.P.Hivera 1976; T.b\Tinflloy чі. all., I960; У.М« Lopor-
iia 1988; r. uovie, IS89; a.shftpiro Ї383; c.i.Boyis *t an., 1930).
Указанное теоретическое положение не может служить оакованием для широкого иопользования вирусных энтсыопатогенов а практике защита раотекий. Б ооответотваи о рекомендациями международных организаций БОЗ я ФАО изучение эффективности и экономичности этих шруаов а препаратов на их оонозе необходимо воота на фоне всесторонней, научной оценки их возможных вредных потэивдй для человека! полезных животных и природных биоцено-80в (Техн.докл. ВОЗ, И 531, 197?К
Опубликованные в мировой литературе ыногочкаленкио данные как правило, овидетельотвушї о том. что энтсыопатогзнные взруок и препарата де ояазыааюг вредного воздойотвйя на человека и ки-вотяшс других клаооов, кротче конкретного членнотоногого-хоздаш: (В.Л.Ваошіьова а соапг.,1989; А.Л.Гураль а ооевт.,1979; cp.ig
coffo 1973; A.M.Heimpal, I97'i; H.T.H-oang at all., 1877; А.К.Д
i»P«l| 1980; H-IJUltsnburger, 1980; A.Oraner, CS.DSller, 193
K.Reimat-ji, H.D.Mtltenburgar, r 1983; J.Hubar, 1988 R.Lewis, 19
Указанные данные базируются, главаим образом, на результатах и ченкя соурой и хроничвокой токоачнооти этлх агентов и недоозаі по затрагивают другне стороны проблемы медико-биологической о ки безопасности вирусных инсектицидов.
Сущеотвуэт опасения, что известная пластачноатъ и изменмі йооїь вирусов можбї1 дриаодить к изменению спектра их патогенні действия. Не отвергнуты к теоретические предположения, что в < чаэ массового производства а применения варуоннх энтоыопатоге всзмоаны изменения вяруледїпсоїи. адаптация к новым хозяевам появление в дрнроде нафекцноыкой болезни, ранее не авойогаєш другому биологическому Еиду. Предполагают возмоякоать геаетет оких рекомбинаций, сенсибилизирующее, мутагенное и кашдерогеї; дейотвие и т.п. (В.Л.Васильева, А.Л.Гураль,1983.1989;
T.w.Tineiey, 1979; H.D.Bargea et all., 1980; с.с.Гаупв, 1982;
a.o.niuerijnrger, A.JCrieg 1984; J.H.i*nxa 1989; s.sjuoree,
1991: K.Helnhard, 1991).
Опубликованные материала отражают; главным образом, результаты иоолелований безопаонооти биоинаектишдов на основе вируоов ядерных полиэдрозов (ВЯП), фрагментарно иэученн препарати, действующим началом ноторкх я.вляютоя вируоц граяулезов (ВТ). Что ае каоаегоя эятомопагогэшшх вируооэ. огяооящихоя к другим оемейот-вам, то оценке юс безопаонооти посвящены единичные сообщения.
Изложенное позволяет конотатировать. что несмотря на значительную перспективу использования энтомопагогешшх вируоов в качестве бисаноектишдоз', многие вопрооы, овязанкне о проблемой кх медино-биологачвохой безопаонооти, изучена недостаточно и требувт дальнейшей научной и практической разработки.
В настоящее время в различных научно-иооледовательоких учреждениях проводятся интенсивные исследования по разработке перспективных энтомопатогенных вируоннх препаратов. К их числу отнс-оятоя биоиноекгяыидн. на основе ВТ г. Вириа-КМ, Внриц-ОС и ориги- ., нальный вяруоннй- иноэктищд - Зароден, дейотвущзм началом которого япляегоя вируо деноонуклеоза комара (ВДН).
Цель и задачи доследования. Изучение возможной патогенноетк (їойоичнооїи, инфекционное ти, осноибилизируодея активности) для теплокровных животных ВТ картофельной моли (БГ КМ), озимой оозкв (ВТ ОС), ВДН а энтомопатогенных препаратов на пх оонове - Евряя--Ш. Бпран-02, Виролен, предназначенных для применения о народном хозяйстве.
Были поогавленн следующие задача:
I. Разработать ызтодичеоккв подходы к оценке беэопаанооти ВГ КМ. ВГ ОС. ВДН и зиоектишдннх предапатоп на их оонове.
2. Провеоги изучение воэыоааого гокаического дейотвия виру-
оов и препаратов, сконструированных на их ооноае для теплокровных
3. Иооледовать возмохнуо инфекщоннооть ВТ КМ, ВГ ОС и БДН,
поведение этих аируоов в организме теплокровных животных при раз-
лйчнкх йутях поступления: возыовнооть проникновения в ток крови,
адаптации.к клеткам к репродукции в теплокровном организме.
4. Изучить оеноибклиэирувдую активность иооледугмых шруоов.
б, На соноьашхй проведенных иооледований дать заключение о
возможно*)'» постановка ивоектишдных препаратов Вириц-КМ. Вирин-OG а Еиродеа на государственные испытания, рекомендации по безо-такому их применении.
Рок овине положения диооартацич, предотамекиые к saggire;
-
Методы изучения взаимодеЙотвЕЯ БГ Ш, ВГ ОС и ШЇ о организмом теплокровных клзотшх, индикации этих вирусов в организмах, кульгуралышх аадксотях. в разЛлчаых биооуботратах.
-
Особенности поведения ВГ в гзплонровнса организме: способность проникать в ток крова при. различных njTax введения вирусов, поступать во внутренние органы о последующей элиминацией из орга-еязлй. Дроникнсвбнзе БГ в организм на сопровождается их реиродук-
цией.
3. ВГ КМ, ВГ ОС, ВйН к созданные па их основе препараты ви
русных инсектицидов Варин-КМ, Виргн-ОС и виродеи - ыато токсична
И ВЄ ВНфвКШОВНН ДЛЯ ТеПЛОКрОВіШХ ЕИ.ЭОТЕЦХ.
4. Ж' КМ, ВГ СС и ЗШ обладаю? сэноабилиэяругацей актвностхю.
ручная новизна. Воервыа проведены комплексные иооледоваїшя
оо изучении возможной яатогоняооти (токсичности, ивфекшонвооти, ооноибнлизирувщей активности) для теплокровных гивотанх ВГ ЮЛ, ВГ ОС и ВДН. являющихся действующим началом препаратов аируовых
5 инсектицидов Вирин-КМ, Вирин-ОС и Вяроден; получены новые данные о взаимодействии этих вирусов о организмом теплокровных животных;
разработаны методы изучения взаимодействия ВГ КМ, ВГ ОС я ВДН о организмом теплокровных животных, индикации этих вируоов я антител к ним;
изучены особенности поведения ВГ в организме теплокровных гавотных и при этом установлено, что независимо от опоооба введения ати вирусы способны проникать в ток крови, поогупать во внутренние органы о последующей элиминацией яз организма (9-му дню) 5ез адаптации к клеткам и репродукции;
показано, что изучаемые вируоы и созданные на их основе препараты вируоных иноектишдоэ мало токсичны я не инфекоионны ия теплокровных животных; .
впервые получены данные о сенсибилизирующем действии аиру-)ов гранулева и ВДН.
фактическая значимость и внедрение результатов наследований. Доведенные исследования позволили разработать и рекомендовать а іаучно-практичеоких пелях схему оценки безопаонооти (ннфекшонно-1ти, токоичнооти, оеноибилизируодей активности) ВГ КМ, ВГ ОС, ВДН і препаратов вируоных иноектяцядов Вирин-КМ. Вирин-ОС и Вироден. Шучно обоонованн рекомендации по безопаоному производству и дри-іененио вирусного инсектицида Вирин-ОС, оштно-производотвенноыу применению препарата Вироден.
По материалам проведенных иооледовашзй в МЗ СССР и Гооудар-ітвенную комиооию по хиыичеоким средствам борьбы с вредителями, . іолезиями растений и сорняками при МСХ предотавлеїш заключения о іезультатахмадико-баологичеокоя оценка препаратов Вирин-ОС и Ва-)оден. На ооновании этих материалов эти препараты допущены к гооу-іаротвенннм иопнтанЕям и опытно-произзодотвенному примекаиип. Зак-
лечение по оценка безопасности биоиаоектяцида Вирин-КМ представлено в НИИ карантина и станцию зашиты растения (г.Симферополь), что язалооь основанием для проведения опытно-солевых испытаний по оценке эффективности и экономичное та препарата. Вирин-ОС вклї чвв з "Слисок химических а биологичеаких средств борьбы о вредителями, болевшим рао гений,' сорняками и регуляторами роога раог< ний, разрешенных для применения в оельоком ХОЗЯЙСТВО !Ш I9S6 -1990 гг." (Ш., 1987).
Ревультаты исследований по мвдако-биояогичеакой оценке вирусных инаектададоЕ Зарин-ОС, Варая-ІШ я Виродзн опоооботвозалк решенкэ важной народно-хозяйственной задачи по внедрению в прак текя защити раетеанй новых зкологачеоки безопасных оредогв защн раотэндЕ.
Апробация работа* Основные положения диссертация долозгени и обададаш на Ученчх ооаегах а научных конференциях Киовокого Ш. эшщамиоломи к инфзкийовныхг болезной йм.Я.В.Громашавского МЗ 3 раина (1987-19Э1 от.), конференции "Генетические последа тавд se грязиения окрз?жавдэй ореды" (Ереван^ 1986), конференции по "Мол к?ляркой баологин ДЯК-оодеркащих вирусов" (Киев. 1987, 1990) т заседаний секция генетических аспектов проблема "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР (Kusa.ISSS), Ш съезде кикробиологкческо; оощооїса (Киев, IS88), Всесоюзной научной конференция "Зитомош тогеяааз вирусы и юс роль п ващите.раотеааіі" (Ковосибарпк. IS8i Всесоюзной ноггфербнвдн "Проблема создания и применения микробк логических средств гадата растений" (Велегож, 1983), 11-м Симп зиу«е огран-членоа СЭВ по. микробным пеатацидам (Протвино, 1990 Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы применения пеотгщяов и полимерных материалов в народном хозяйстве" (Киеі 1990). XII Украинском съезде микробиологов, эпидемиологов й пс эитологов (Харькоэ.1991).
Публикации. По теме диооертации опубликовано 13 наянах pair.
Объем и огрукгурз диооортацяи. Работа изложена на 149 отра-цах машинописного текста, кллоттрировааа 20 таблицами и 7 рийками. Состоит из введения, шеотп глав, заклнпеняя, выводов и пока цитируемой литературы, когорий внлшавт 214 источников: отечеотзояншс и 115 зарубежных.
Материалы и методы. Изучали гри перспективных вируоннх ия-кгашша: Варин-ІШ, Вирин-ОС и Вироден. Экспериментальный прэ-рат Вирив-КМ ооздан на ооновз ВТ КМ на Крымской отаашш защиты отвний (г.Симферополь). Препарат Вирян-OG разработан и предло-н длл применения з качестве шюектишда научнс-ясоледователь-им ииотитутом биологических моїодоа затяти растений (г.Кшгинев). оектиишгай препарат Вироден разработай в Проблемной научно-ио-едовательокой лаборатории экологии и токсикологии Киевского .уяа-роитета им.Тарааа Шевченко.
Препараты Вирии-ЯМ и Вирин-ОС предотааляют собой ауопекзя>? анул в 50^-ном глицерине, полученных из трупов гусениц, ПОГЯб-х от оостзетотвукцих болезней. Титр препаратов - 1*10 -1*10А' а пул в ыи. Бкроден - 555-ная виру оная суоаенэия о _ глицерине.
Объекты наследования: а) гранулы, на основе которых создались энтснодатогениые парусные препараты; б) вируенно чаотиш ириоиы), выделенные пз гранул; в) БДИ; г) препаративные форми руоных инсектицидов.
В оонову работы положен принцип, комплексного иоолелова'ния, котором оочаталиоь вирусологические, токсикологические, кммуно-
ГИЧО0КИЄ И ОгаТЙОГИ-ЧООКИе ИеТОДЦ исследования.
8 Эксперимента проведены на 680 беспородных белых мышах различных возраотов ыаооой 12-25 г; на 460.белых крыоах маооой 100-200 г; 830 гзипейских свинках - 200-500 г; 15 кроликах породы шиншилла - 3-4 кг; 370 развивавдихоя куриных эмбрионах 9-Ю ди.); на пэрвачной (ЧЭТ) человеческой эмбриональной ткани л перевиваемой ( ь -41) культуре клеток, лейкоцитов человека.
Вируоологичеокие методы иооледования включали выделение и очиотку гранул и ВДЙ из соответствующих вкруоных препаратов, получение вариояов из гранул ВГ ЮЛ, ВГ ОС, инфицирование белых мышей, белых крас, кулмивируешх культур клеток млекопитающее и куриных эмбрионов.
Выделение гранул из препаратов проводили при помощи дифференциального центрифугирования о очисткой в градазнте плестпоо-ти сахарозы (В.И.Барановокай, С.А.БахЕзлоа, 1974; А.С.Надерет. 1991; !f»'saten,i3si). Количество граеул подсчитывали по формуле Вкнаградокого-Брада в микроскопе "Дюмам Р-3" (М.Н.Пкмексва и ооавт., 1971).
Прп віиелєнии внриовов из гранул использовали иодвфйциро-
вансый нами метод С.вдвц, о.в.огісь, (1977). Сущность ыодкфа:
вда заключалась в создании более щадящих условий щелочной обработка гранул путем о шагания значений РН раотзора с 11,0-11,5 до 10,0-9,5. Очистку варионов проводили по методу Е.В.КолтукоЕа 'USS2 г,) о учетом разницу в размерах вирусных частиц.
ВДН акцелнли из препарата при помош дифференциального іка трифугироаанал о исследующей очисткой а линейном градиенте плот доога сахарозі*. їїіхр ВДН определяла в реакции обратной лаозивпо гемаилютиаацяи (РОПГА) и виражала в генагглюгиапруащих единица 1ГЕ). Содержанке белка в препарате определяли на опекгрофогокет СФ-І6 (Л.П.Бучапкий.1982; В.Л.Васильева и ооавт..1990).
Новорожденных белах мышей І-3-х-дневного возраота инфицнро-іали интраперебрально и оубкутанно. половозрелых - вкутрибрюшн-10. порсральпо и кнтраназачьно очищенной вэвеоьго гранул, шриояса. іццеленнмх из них а ВДН. Для изучения воздейотвия указанных агентов на организм экспериментальных животных вели наблюдение за их юзеденкем. заболеваемостью, смертностью, маооой тела, показагэ-шка гемограммы. Производили макро- и микроскопические иоолэдсва-нія внутренних органов, определяли их относительную ыэосу.
Инфекдаоннозть указанных вирусов, а также юс повеление в теплокровном организме изучала в опытах на белых крысах. О отой целью из внутренних органов подопытных животных (печень, почка, сегкие я солепзкка), забитых в разные сроки пооло введения виру-зов., готовили гомогенати в виде 10#-ной суспензия а 0,85*-ноы растворе »аС1 для последующего исследования а РОПГА. ША и Рй&. 3 сыворотке крови подопытных яийотннх определяли специфические антител»» в РПГА.
Культуры клеток ь -41 и ЧЗТ йафдцйроаади различными дезами
иоолелуемкх вирусов и вирионоз, выделенных из гранул (1'10 -
9 1*10 гря/мл. 4—32 ГЕ). Проведено по 5 серийных ааооажей. Инйаци-
рованнив культури врооштривалЕ под оаеговыа микроскопом для обнаружения ЦПЭ. Наличке зяруеннх аяїкгоноз определяли з РОПГА. ISA к РШ.
С целью равного выявления воздействия ВГ на культуры клеток прозеденн исследования о использованием феноменов гемадсорбпва и вирусной изтврферэаякя (С.Я.Гайдгмовяч, 1885; crs.ignoffo,
R.R.Eafelio, 1972).
В опытах на куриных эмбрионах в алланговоную полооть 9-10-дневных эмбрионов вводила различные дозы гранул от 0,2*10 до 0.2'Ю11 и ВДН - от 4 до 32 ГЕ. Мазни-оглечатки из различных орга-
bob и жидкоотей эмбрионов изучали в ?Ш.
Токоикологичеокие исследования проводили в ооответотши о рекомендациями ІЮЗ. а также по охемам. разработанным в КШІЛЗИБ в острых, подоогрнх и хронических опытах на белых мышах, крноах. гкшейоких овянках. кроликах при интраназальном. пероральнок введении їіаіерпалов. ненеоеняи ка кожу и слизистую глаз (Техн.докл. ЕОЗ, J5 531, IS75: В.Л.Васильева, А.Я.Гураль, I98S). Для оценки возможного токсического действия изучаемых препаратов использовали комплекс визуально-метрических иетсдов: проводила обвий осмотр подошгаих животных, обращая вкашкие ка. поаадеіше, внешний вид (состояние волосяного покрова, глаз, рта, носа, ушей), развитие, наличие прлзнакоз интоксикация и х.п. Измеряли температуру и мао-оу тела гиаоїшх, проводили гематологические исследования, макроскопические оболедоваиия внутренних органов, в конце опита - определение их относктельной каоан. Дел сценки острой токсичности изучаемых зируоов шшояьзозали таяже геог отека конечности белых мышей (Е.Б.Акоенова, I960; A.M.Грачева и ооавт.,1980; В.В.Квирикздзі 1980; Л.И.Корзая,1982).
}йшуцологнческяе кетояи. Дот яылаления антител к изучаемым вирусом, обнаружения вирусных антигенов в культуральных жидкостях й других биооубстрагах применяла РИГА, РОПГА и ISA.
Антигенные и аишгельнке диагностические препараты получала
путем присоединения вирусных антигенов и специфических иммуногло
булинов к формаланизирозаншш эритроцитам барана при помощи би
функционального соединения 4-4-биодифенилондаазонийборофторада
(А.Я.Гураль в соавт., IS83/. Гранулезные антигены для конструиро
вания ЭД ЛСЛучалИ ИЗ ОЧИВДеКНЮС Гранул ПО МвГОДУ СГ.НосЬлишл,
(197? р.) в кашей ыодцфикаши. которая заключалась в увеличения количеотва гранул, подвергащихоя щалочаой обработке, и в опоаобе
очиотки антигенов. Антигены ВДН получаля по методико, оаиоаннои Л.П.Бучапким (1982). Количество белка з антигенах определяли по метода Лоури ( o.H.Lcwiy et oil., 1951) и на спектрофотометре СФ-Ї6.
Гиперкммуннао кроличьи оызорогкя получали по разработанной, применительно к исследуемым вирусам схеме, предусматривающей трехкратное, а интервалом в 7 дней внутривенное введение 2 мл взвеад счищепикх гранул (ВГ ИМ - І'ІО10 грн/мл, ВТ ОС - 1*109 грн/ми) я ВДН (2 ыг белка в I т). Вылаленве Ie из кроличьих антиаывороток провопили риванолсульфатным ооаадєшіем (И,Брод,1979) о последующим обссо'олїшанием на осфадексе С-25 (ТДетерман,1970). Наличие Is контролировали на спектрофотометре СФ-Ї6 лра длина волен 280 им.
Для изучения взаимодействия наследуемых вирусов, о организмом теплокровных использовали РИГА а РОПЕА, котсрае огадили в панелях р-типа микротигратора Тадзчя (Л.Л.Гураль. В.Л.Ваояльова. I9S3), прямой и непрямой варианты РИФ (3.И.Трусов.1981) к прямой твердофазный метод ІІФА (В.М,Трусов, С.й.Рыбалко, 1990).
Изучение влияния паруосв гращлеза а ЗДН аа шядунологическуо реактивиноть организма, пх сенсибилизирующих овойогв, проводили путем постановки-у экспериментальных жшвояпас РИГА. КАП. РСЛЛ, а также при помощи опытов переноса ггперчуштвЕгельнооти. Тсс-г ТОМ отазкла по методико, предложенной для вкнятедил а изучения овнии-Зилязагая химической и лекарственной эгдологии (Л.Л.Луеаа, Р.Н.Бару, 1978}. Опыта переноса гиясрчувотвиташюоги проводили по методике Г.А.Артемовой (1970 г.).
Сгаткотическая обработка полученных дакпнх в ходе аеолсдояа-пай осуществлялась методами вариационной отагиотшш о цопользсэа-геем критерия Стьтаента (Л.С.Каминокий,19б4: А.К.Беяоуо, В.И.Коло-їяяіийЛ97і). Математическую обработку показататей отпсангольгсой лас он внутренних органов проводили путом пччяслоипя среднего квад-
12 . ратического отклонения по размаху (амплитуде) (Р.Н.Бирюкова,1962). Температурные показатели анализировали методом вепараметричеоких критериев о помощью вичисленая медианы (Me) и квартилей (Он и Qb). т. е. вахоадеяия оредной варианты и ее размаха (К.В.Лашков.Л,Е.Поляков. 1971).
Исследование инфєкционн'ооїЕ в токоачнооти изучаемых материалов вшюлнены оовыеотно 'с к.б.н. В.И.Труоовнм и А.С.Нещеретом.