Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. История открытия флуоресцентных белков 8
1.2. Характеристика GFP: структура и свойства 9
1.3 Биологическая функция флуоресцентных белков 12
1.4 Применение флуоресцентных белков 13
1.5 Проблема олигомеризации флуоресцентных белков 18
1.6 Мономерные флуоресцентные белки 20
1.7 Заключение 35
2. Материалы и методы 37
2.1 Оборудование и реактивы 37
2.1.1 Оборудование 37
2.1.2 Реактивы 38
2.1.3 Буферные растворы 39
2.1.4 Микробиологические среды 39
2.1.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии 40
2.2 Методы исследования и анализа результатов 40
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК 40
2.2.2. Случайный (Random) мутагенез 41
2.2.3. Сайт-специфический мутагенез 42
2.2.4. Трансформация клеток Е. Coli з
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК 43
2.2.6. Переосаждение ДНК 43
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 44
2.2.8 Выделение и очистка рекомбинантных белков 44
2.2.9 Определение скорости созревания хромофора 45
2.2.10 Гель-фильтрация 46
2.2.11 Спектроскопические методы 46
2.2.12. Трансфекция эукариотических клеток
2.2.14 Получение рекомбинантных конструкций 49
2.2.14.1 Получение бактериальных экспрессионных векторов 49
2.2.14.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов 50
2.2.14.3 Получение FusionRed 51
2.2.14.4 Получение mKateKFPl и mKateKFP2 53
2.2.14.5 Получение FusionRed-657 53
2.2.15 Трансгенные Xenopus laevis 55
3. Результаты и обсуждение 56
3.1 Красный мономерный флуоресцентный белок 56
3.1.1 Получение белка FusionRed 56
3.1.2 Характеристика и сравнение FusionRed с аналогами in vitro 60
3.1.3 Характеристика и сравнение белка FusionRed с аналогами in vivo64
3.2. Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки 71
3.2.1 Получение белков mKateKFPl и mKateKFP2 72
3.2.2 Изучение фотоактивационных свойств белков mKateKFPl и mKateKFP2 73
3.3. Дальне-красный мономерный белок 77
3.3.1 Получение дальне-красного мономерного белка 78
3.4 Заключение 85
Выводы 87
Список литературы
- Применение флуоресцентных белков
- Бактериальные штаммы и клеточные линии
- Трансфекция эукариотических клеток
- Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки
Применение флуоресцентных белков
В настоящее время GFP и его варианты и гомологи различных цветов используются в различных областях молекулярной и клеточной биологии. ФБ широко распространены как неинвазивные метки для изучения различных биологических моделей от отдельных молекул до клеток и целого организма. Использование ФБ позволяет проследить практически весь путь жизни исследуемого белка: его экспрессию, локализацию, движение, взаимодействие с другими белками и активность в клетке, расположение в ткани или организме. В число основных применений ФБ входят: изучение регуляции активности промотора исследуемого гена, мечение белков, обнаружение белок-белковых взаимодействий, прослеживание движения белков, а также наблюдение за изменением определенных клеточных параметров с помощью флуоресцентных сенсоров на основе ФБ.
Флуоресцентные метки широко используются для наблюдения за активностью промоторов исследуемых генов. Ген, кодирующий ФБ, помещается под контроль промотора-мишени, благодаря чему за активностью промотора легко следить по изменению флуоресцентного сигнала. Большое число флуоресцентных белков подходит для таких исследований, что делает возможным одновременное наблюдение за несколькими промоторами с использованием 4-5 различных флуоресцентных меток [26].
Флуоресцентные белки позволяют проводить наблюдение за промоторами во времени. ФБ с коротким временем созревания хромофора обеспечивают минимальную задержку между активацией промотора и появлением флуоресцентного сигнала. Более того, существуют так называемые таймерные белки (Timer-FP), которые с течением времени меняют флуоресценцию с голубой на зеленую, а затем на красную. Их использование позволяет получить информацию о продолжительности активности промотора [26]. Также таймеры могут быть использованы для наблюдения за динамикой экспрессии генов в различных тканях [27], для наблюдения за белковым транспортом [28, 29], и для анализа распределения органелл в зависимости от времени их возникновения [30]. Первый такой белок, названный DsRed-E5, был описан в 2000 году [31, 32]. DsRed-E5 производит зеленую флуоресценцию в течение нескольких часов после синтеза, но позже преобразовывает в красную флуоресцентную форму.
Относительно недавно были получены так называемые «расщепленные» («сплит») ФБ. Они синтезируются как две отдельные части одного белка, но способны при слиянии формировать целый функционирующий флуоресцентный белок. Последовательности ДНК, кодирующие эти ФБ, могут быть помещены под контроль двух изучаемых промоторов, и в таком случае сигнал возникает только в случае одновременной активности обоих промоторов [33]. Более того, если в половинки «сплит» белков внести точечные мутации, приводящие к появлению различий в спектральных характеристиках ФБ, то по результирующему спектру флуоресценции можно выявить определенную комбинацию или соотношение комбинаций промоторов, активных в данной системе.
Флуоресцентные белки нашли широкое применение в качестве меток клеточных компартментов, органелл и отдельных белковых молекул in vivo. Для направления ФБ в определённую часть клетки в последовательность белка вводятся соответствующие сигналы, а для исследования локализации и перемещения исследуемых белков создаются химерные молекулы, где С- или N-конец ФБ соединён с белком-мишенью полипептидным линкером в одной рамке считывания. Основной проблемой в таких экспериментах является тенденция большинства GFP-подобных белков к олигомеризации, что может значительно влиять на сохранение активности исследуемого белка и приводить к формированию токсичных агрегатов. В связи с этим при создании химерных белков предпочтение отдаётся мономерным ФБ. Для получения достоверных результатов также необходим нативный фолдинг как флуоресцентного белка, так и белка-мишени, поэтому важным является правильный подбор длины линкера и учёт возможных стерических взаимодействий между частями химерной молекулы [34].
Для детекции белок-белковых взаимодействий в живой клетке широко распространены методы, основанные на эффекте FRET (fluorescence resonance energy transfer) [35]. FRET - это безызлучательный перенос энергии от возбужденного донора-флуорофора к флуорофору-акцептору, который находится вблизи донора ( 10 нм) и имеет спектр поглощения, перекрывающийся со спектром излучения донора. Факторами, влияющими на эффективность FRET, являются степень перекрывания спектров эмиссии донора и поглощения акцептора, расстояние между ними (эффективность переноса зависит от расстояния между донором и акцептором как 1/R6), а также относительная ориентация дипольного момента обоих хромофоров. Следовательно, с помощью FRET можно регистрировать любые биохимические сигналы, изменяющие взаимную ориентацию дипольного момента хромофоров или расстояние между ними [36, 37]. FRET может быть детектирован несколькими способами, основанными на изменениях параметров флуоресценции, которые могут быть измерены методами современной флуоресцентной микроскопии [38].
Ряд методов, позволяющий оценить подвижность белковых молекул, основан на явлении фотообесцвечивания (photobleaching). Небольшой участок клетки облучают направленным лучом света высокой интенсивности и наблюдают движение необесцвеченных молекул из соседних участков клетки в обесцвеченный участок (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) [39]. В другом подходе, участок клетки периодически облучают до полного исчезновения в ней флуоресценции (Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP). FLIM является одним из самых надежных методов для количественной оценки эффекта FRET [40, 41]. Изучение флуоресцирующих белковых химер с помощью этих методов позволяет вычислить коэффициент активной диффузии (Deff) и определить мобильную фракцию белка (Mf) [42].
За последние несколько лет значительный прогресс был достигнут в разработке так называемых фотоактивируемых ФБ (ФАФБ). Фотоактивация может происходить различными путями: за счет увеличения квантового выхода флуоресценции или молярного коэффициента поглощения при данной длине волны, а также за счет смещения максимума длины волны возбуждения и/или эмиссии флуоресценции. Все ФАФБ по механизму фотоактивации чётко делятся на две группы: обратимо и необратимо фотоактивируемые.
Необратимо фотоактивируемые белки изменяют флуоресценцию однократно. Первым таким белком стал мутантный вариант avGFP - РА-GFP [43]. Позже в нашей лаборатории на основе флуоресцентного белка медузы Aequorea coerulescens был получен PS-CFP [44].
Для обратимо конвертируемых ФАФБ характерна способность к многократному повторению фотоконверсии. Первый белок такого типа -фотоактивируемый хромобелок asFP595 морского анемона Anemonia sulcata - был описан в 2000 г. [5]. Облучение этого белка интенсивным зеленым светом переводит его в красное флуоресцентное состояние за счет увеличения квантового выхода флуоресценции более чем в 100 раз. Белок возвращается в исходное состояние за несколько секунд в темноте или под воздействием синего света. Позже был получен мутантный вариант asFP595, названный KFP1 (Kindling Fluorescent Protein - разгорающийся флуоресцентный белок) [45]. KFP1 флуоресцирует в красной области спектра при облучении желтым или зеленым светом (525-580 нм). Кроме обратимо «разжигающихся», существуют и обратимо «гаснующие» ФАФБ, такие как зеленый флуоресцентный белок Dronpa [46], который обратимо фотоконвертируется в нефлуоресцентное состояние при облучении синим светом (белок получил свое название от японского термина для ниндзя «Dron», что означает мгновенное исчезновение тела и РА - от photoactivation). При облучении фиолетовым светом белок Dronpa быстро возвращается в исходное флуоресцентное состояние.
Бактериальные штаммы и клеточные линии
Долгое время единственным синим ФБ был EBFP [60, 61], мутантный вариант avGFP, несущий замену Tyr66His. На основе EBFP в комбинациях с различными производными GFP были разработаны FRET-пары, позволяющие отслеживать колебания кальция [62-64] и апоптоз [63].
Однако EBFP обладал меньшей яркостью флуоресценции по сравнению с белком-предшественником. На основе EBFP были получены синие ФБ, названные Azurite [65] и EBFP2[66] (см. рис. 3). Эти белки сохранили мономерные свойства avGFP и хорошо работают в составе химерных конструкций с белками слияния [67, 68]. Следует отметить, что синие ФБ, несущие замену Tyr66His, могут уступать синим белкам, имеющим GFP-подобный хромофор. Таким синим мономерным ФБ является TagBFP [69, 70], яркость флуоресценции которого почти в 2 раза превосходит яркость EBFP2 (см. рис. 3). Максимум эмиссии флуоресценции TagBFP приходится на 457 нм, максимум возбуждения флуоресценции- на 402 нм. Благодаря своим спектральным характеристикам, данный ФБ легко отличить от зеленых и циановых белков.
В 2011 году была опубликована улучшенная версия белка TagBFP-белок TagBFP2 [71]. При экспрессии в живых клетках TagBFP2 в 1.2 раза ярче белка-предшественника. Полученный белок обладает большей скоростью созревания и лучшей фотостабильностью по сравнению с TagBFP.
В целом, синие ФБ, разработанные на сегодняшний день, могут быть широко применены для мультицветового мечения и при разработке биосенсоров на основе FRET. Голубые флуоресцентные белки
Первый флуоресцентный белок, обладающий эмиссией в голубой части спектра, был обнаружен одновременно с BFP во время мутагенеза хромофора GFP [61, 72]. Единственная мутация ТугббТгр привела к получению белка, обладающего максимумом эмиссии при 485 нм. После внесения ряда замен (Phe64Leu - увеличивает скорость созревания, Ser65Thr) был получен белок, названный ECFP [73]. Успешным применением ECFP можно считать создание биосенсоров на основе FRET-пары ECFP и желтого ФБ. Недостатком данного белка является низкая яркость флуоресценции (40% от яркости EGFP). Направленная эволюция ECFP привела к появлению ряда циановых флуоресцентных белков с улучшенными характеристиками, таких как Cerulean [74], SCFPs [75], TagCFP (Evrogen), и mTurquoise [76], характеризующихся увеличением яркости флуоресценции и/или скоростью созревания. Подобно синим ФБ, палитра голубых белков была обогащена мономерным белком, обладающим GFP-подобным хромофором. Этот белок, названный mTFPl [77, 78] , является мономерным вариантом тетрамерного белка CFP484, полученного из кораллов Clavilaha sp. Яркость флуоресценции белка mTFPl превосходит в несколько раз яркость других голубых мономерных белков (см. рис. 3). Этот белок обладает высокой рН- и фотостабильностью, а также высокой скоростью созревания. Однако, максимум эмиссии флуоресценции (492 нм) белка mTFPl близок к зеленым ФБ. На практике это усложняет его спектральное разделение с желтыми ФБ.
Зеленые флуоресцентные белки На сегодняшний день доступно большое количество зеленых мономерных белков. avGFP не является оптимальным белком для большинства практических применений, так как он обладает двумя пиками поглощения. Замена в хромофоре в 65 положении серина на треонин привела к получению зеленого белка, обладающего одним пиком поглощения (484 нм). Данный белок получил название EGFP (Enhanced GFP) [60, 79]. На основе данного белка был получен вариант, сохраняющий мономерные свойства даже при высоких концентрациях- mEGFP, несущий замену Ala206Lys [80]. Среди лучших зеленых мономерных белков стоит также отметить Emerald (EmGFP) [81]. Кроме замены Ser65Thr содержит еще 4 точечные мутации, которые улучшили скорость созревания данного белка и увеличили яркость флуоресценции. Недостатком Emerald является низкая фотостабильность в клетках млекопитающих.
Зеленый мономерный ФБ AcGFP был получен в ходе случайного ПЦР-мутагенеза бесцветного белка, выделенного из Aequorea coerulescens [82]. Замена глутаминовой кислоты на глицин в 222 аминокислотном остатке превратила бесцветный белок дикого типа в высоко люминесцентный белок, обладающий максимумом поглощения при 480 нм и максимумом эмиссии флуоресценции при 505 нм. Яркость флуоресценции AcGFP сопоставима с яркостью EGFP (см. рис. 3). На основе флуоресцентного белка из коралла Galaxeidae был создан Azami-Green (AG) [83]. Аминокислотная последовательность Azami-Green всего лишь на 6% гомологична аминокислотной последовательности EGFP. Мономерный вариант Azami-Green -mAGl [84] (максимумы возбуждения/эмиссии флуоресценции 492/505 нм соответственно), обладает высоким квантовым выходом флуоресценции. mWasabi [85] (максимумом эмиссии флуоресценции при 509 нм) -мономерный зеленый флуоресцентный белок, полученный на основе белка mTFPl. Яркость флуоресценции белка mWasabi в 2 раза больше яркости EGFP. При этом mWasabi обладает сходной с EGFP рН- стабильностью и фотостабильность.
Среди зеленых мономерных ФБ следует отметить разработанный в нашей лаборатории белок TagGFP2 [86] (максимумы возбуждения / эмиссии 483 и 506 нм, соответственно), обладающий высокой рН-стабильностью и высокой скоростью созревания. Данный белок обладает сходными спектральными характеристиками с EGFP.
Желтые флуоресцентные белки Кристаллографический анализ зеленого ФБ показал, что 203 аминокислотный остаток (Thr203) расположен вблизи хромофора и потенциально способен влиять на спектральные характеристики [11]. Замена триптофана на тирозин (Thr203Tyr) привела к получению белка с батохромным сдвигом максимума эмиссии флуоресценции. Один из первых опубликованных желтых ФБ EYFP [11], несущий замену Gln69Lys, обладает низкой рН-стабильностью, обладает чувствительностью к ионам хлора и значительно уступает по фотостабильности зеленым мономерным белкам. Стратегия направленного мутагенеза, которая привела к оптимизировации мономерных вариантов ECFP, также относились и к EYFP. Работа была направлена на увеличение яркости флуоресценции белка и на увеличение скорости созревания белка. Эти усилия привели к получению белка, который был назван "супер" желтым флуоресцентным белком - SYFP, который значительно ярче белка предшественника как в бактериях, так и в клетках млекопитающих. Улучшенный вариант SYFP- SYFP2 в 12 раз ярче EYFP при экспрессии в бактериальных клетках. При экспрессии в клетках млекопитающих улучшения оказались менее явными. Тем не менее, SYFP2 в полтора раза ярче EYFP при экспрессии в клетках линии HeLa [87].
Трансфекция эукариотических клеток
Многие белки слияния и большинство биосенсоров на основе ФБ чрезвычайно чувствительны к олигомеризации и неспецифическим внутриклеточным взаимодействиям. За последнее десятилетие ряд красных димерных и тетрамерных белков подвергался искусственной мономеризации, которая в большинстве случаев приводила к потере яркости, уменьшению скорости созревания и снижению стабильности флуоресценции. И, тем не менее, лучшие образцы красных мономерных белков уступают природным зеленым мономерным белкам в составе белков слияния. Эта проблема объясняется их остаточной слабой димеризацией, токсичностью, склонностью к формированию агрегатов в живых клетках. В настоящей работе нас мотивировала задача получения красного флуоресцентного белка, качество работы которого в составе белков слияния не уступало бы лучшим естественно мономерным зеленым флуоресцентным белкам, таким как mEmerald или mEGFP.
На основании таких характеристик как высокая яркость флуоресцентного сигнала, высокая скорость созревания хромофора, и низкая токсичность, белок mKate2 был выбран нами в качестве основы для разработки красного мономерного белка, для которого не будет характерна проблема слабой димеризации. На основании анализа трехмерной структуры белка mKate [115] мы выбрали ряд положений аминокислотных остатков, которые способны влиять на олигомерные свойства белка mKate2. С помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза (см. раздел 2.2.3) мы внесли следующие замены в микроокружение хромофора: R164A, К182Е, Y200N. Кроме того, мы заменили гидрофобный С-концевой участок, стабилизирующий, согласно данным о структуре белка mKate, формирование димера, на Gly-богатый участок (см. рис. 6).
Аминокислотные остатки, ответственные за димеризацию, показаны красным. Две субъединицы mKate окрашены в желтый (полупрозрачный) и синий цвета. Модель основана на данных кристаллографического анализа белка mKate. Полученный на этом этапе белок был назван mKate2.5. Его мономерность при концентрации до 10 мг/мл была подтверждена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC. Однако, следствием введения мономеризующих замен стало ухудшение ряда характеристик белка. В частности, недостатками mKate2.5 являются относительно невысокая яркость флуоресценции, а также низкая рН-стабильность (кажущееся значение рКа = 7.0, тогда как для исходного белка mKate2 рКа = 5.0). Наша дальнейшая работа была направлена на оптимизацию спектральных и биохимических характеристик белка mKate2.5, которая, однако, не должна была произойти за счет потери его мономерных свойств.
Основываясь на нашем предыдущем опыте работы с белками этого семейства (потомками белка дикого типа eqFP578), а также на данных о трехмерной структуре белка mKate, мы предположили, что аминокислотные замены в окружении хромофора, такие как K69R, S148N, С165Т, L181F и R203H приведут к созданию флуоресцентного белка, подобного TagRFP.
Принципиальная разница между белками mKate и TagRFP заключается в том, что во флуоресцентном состоянии хромофор белка mKate имеет цис-конформацию, а белок TagRFP - транс. При этом белок TagRFP характеризуется высокой рН-стабильностью и самой высокой яркостью флуоресцентного сигнала из всех известных мономерных и слабо димерных красных флуоресцентных белков.
В то же время, мутагенез по перечисленным выше внутренним (то есть ориентированным внутрь бета-бочонка белка) аминокислотным позициям, отличающим mKate2.5 от белка TagRFP, не должен был привести к изменению олигомерных свойств mKate2.5. Используя специально дизайнированные праймеры (см. раздел 2.2.14.3), мы провели несколько раундов сайт-специфичного мутагенеза. Были получены библиотеки, содержащие различные комбинации аминокислотных замен в выбранных нами положениях. Яркость полученных вариантов анализировали с помощью флуоресцентного бинокуляра SZX-12 (Olympus, фильтр возбуждающего света 545-580 нм, фильтр эмиссии 610LP), спектрофотометра SMS2VIS и программы smsCalc для измерения спектров флуоресценции с отдельных колоний и штрихов Е. coli. Самые яркие варианты были объединены и подверглись нескольким раундам случайного мутагенеза (см. раздел 2.2.2). На каждом раунде случайного мутагенеза отбиралось от 20 до 40 вариантов. После секвенирования отобранных вариантов мы объединяли накопленные аминокислотные замены, за исключением потенциально димеризующих согласно результатам анализа трехмерной структуры белка mKate. Замены объединялись в различных комбинациях с использованием метода вырожденного сайт-направленного мутагенеза, и полученный таким образом набор вариантов подвергали следующему раунду случайного мутагенеза. Такой цикл повторяли в общей сложности 7 раз.
Ряд замен, найденных в ходе случайного мутагенеза, такие как пара T75P+Q76P, значительно увеличили скорость и эффективность созревания белка. Этот дуплет пролинов находится между а-спиралью, несущей хромофор, и четвертым (В-слоем, и по всей вероятности обеспечивает необходимый угол поворота при переходе между этими структурными элементами.
Окончательный вариант, названный FusionRed (от fusion- белок слияния) имеет яркость при экспрессии в бактериях сопоставимую и даже превосходящую яркость белка-предшественника mKate2 (см. рис. 7). Рисунок 7. Бактерии, экспрессирующие белки FusionRed и mKate2.
Анализ олигомерного статуса белков mKate2, mKate2.5 и FusionRed проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC на носителе Superdex 200, при концентрации 10 мг/мл (см. рис. 8).
Было показано, что белки mKate2.5 и FusionRed сохраняют мономерную природу (молекулярная масса около 22 kDa) даже при этой высокой концентрации, сопоставимой с максимально достижимой в физиологических условиях. В то же время, белок mKate2 был представлен на HPLC двумя перекрывающимися пиками, что свидетельствует о наличии димерной составляющей при концентрации 10 мг/мл.
Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки
Многие белки слияния и большинство биосенсоров на основе ФБ чрезвычайно чувствительны к олигомеризации и неспецифическим внутриклеточным взаимодействиям. За последнее десятилетие ряд красных димерных и тетрамерных белков подвергался искусственной мономеризации, которая в большинстве случаев приводила к потере яркости, уменьшению скорости созревания и снижению стабильности флуоресценции. И, тем не менее, лучшие образцы красных мономерных белков уступают природным зеленым мономерным белкам в составе белков слияния. Эта проблема объясняется их остаточной слабой димеризацией, токсичностью, склонностью к формированию агрегатов в живых клетках. В настоящей работе нас мотивировала задача получения красного флуоресцентного белка, качество работы которого в составе белков слияния не уступало бы лучшим естественно мономерным зеленым флуоресцентным белкам, таким как mEmerald или mEGFP.
На основании таких характеристик как высокая яркость флуоресцентного сигнала, высокая скорость созревания хромофора, и низкая токсичность, белок mKate2 был выбран нами в качестве основы для разработки красного мономерного белка, для которого не будет характерна проблема слабой димеризации. На основании анализа трехмерной структуры белка mKate [115] мы выбрали ряд положений аминокислотных остатков, которые способны влиять на олигомерные свойства белка mKate2. С помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза (см. раздел 2.2.3) мы внесли следующие замены в микроокружение хромофора: R164A, К182Е, Y200N. Кроме того, мы заменили гидрофобный С-концевой участок, стабилизирующий, согласно данным о структуре белка mKate, формирование димера, на Gly-богатый участок (см. рис. 6).
Аминокислотные остатки, ответственные за димеризацию, показаны красным. Две субъединицы mKate окрашены в желтый (полупрозрачный) и синий цвета. Модель основана на данных кристаллографического анализа белка mKate. Полученный на этом этапе белок был назван mKate2.5. Его мономерность при концентрации до 10 мг/мл была подтверждена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC. Однако, следствием введения мономеризующих замен стало ухудшение ряда характеристик белка. В частности, недостатками mKate2.5 являются относительно невысокая яркость флуоресценции, а также низкая рН-стабильность (кажущееся значение рКа = 7.0, тогда как для исходного белка mKate2 рКа = 5.0). Наша дальнейшая работа была направлена на оптимизацию спектральных и биохимических характеристик белка mKate2.5, которая, однако, не должна была произойти за счет потери его мономерных свойств.
Основываясь на нашем предыдущем опыте работы с белками этого семейства (потомками белка дикого типа eqFP578), а также на данных о трехмерной структуре белка mKate, мы предположили, что аминокислотные замены в окружении хромофора, такие как K69R, S148N, С165Т, L181F и R203H приведут к созданию флуоресцентного белка, подобного TagRFP.
Принципиальная разница между белками mKate и TagRFP заключается в том, что во флуоресцентном состоянии хромофор белка mKate имеет цис-конформацию, а белок TagRFP - транс. При этом белок TagRFP характеризуется высокой рН-стабильностью и самой высокой яркостью флуоресцентного сигнала из всех известных мономерных и слабо димерных красных флуоресцентных белков.
В то же время, мутагенез по перечисленным выше внутренним (то есть ориентированным внутрь бета-бочонка белка) аминокислотным позициям, отличающим mKate2.5 от белка TagRFP, не должен был привести к изменению олигомерных свойств mKate2.5. Используя специально дизайнированные праймеры (см. раздел 2.2.14.3), мы провели несколько раундов сайт-специфичного мутагенеза. Были получены библиотеки, содержащие различные комбинации аминокислотных замен в выбранных нами положениях. Яркость полученных вариантов анализировали с помощью флуоресцентного бинокуляра SZX-12 (Olympus, фильтр возбуждающего света 545-580 нм, фильтр эмиссии 610LP), спектрофотометра SMS2VIS и программы smsCalc для измерения спектров флуоресценции с отдельных колоний и штрихов Е. coli. Самые яркие варианты были объединены и подверглись нескольким раундам случайного мутагенеза (см. раздел 2.2.2). На каждом раунде случайного мутагенеза отбиралось от 20 до 40 вариантов. После секвенирования отобранных вариантов мы объединяли накопленные аминокислотные замены, за исключением потенциально димеризующих согласно результатам анализа трехмерной структуры белка mKate. Замены объединялись в различных комбинациях с использованием метода вырожденного сайт-направленного мутагенеза, и полученный таким образом набор вариантов подвергали следующему раунду случайного мутагенеза. Такой цикл повторяли в общей сложности 7 раз.
Ряд замен, найденных в ходе случайного мутагенеза, такие как пара T75P+Q76P, значительно увеличили скорость и эффективность созревания белка. Этот дуплет пролинов находится между а-спиралью, несущей хромофор, и четвертым (В-слоем, и по всей вероятности обеспечивает необходимый угол поворота при переходе между этими структурными элементами.
Окончательный вариант, названный FusionRed (от fusion- белок слияния) имеет яркость при экспрессии в бактериях сопоставимую и даже превосходящую яркость белка-предшественника mKate2 (см. рис. 7). Рисунок 7. Бактерии, экспрессирующие белки FusionRed и mKate2.
Анализ олигомерного статуса белков mKate2, mKate2.5 и FusionRed проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC на носителе Superdex 200, при концентрации 10 мг/мл (см. рис. 8).
Было показано, что белки mKate2.5 и FusionRed сохраняют мономерную природу (молекулярная масса около 22 kDa) даже при этой высокой концентрации, сопоставимой с максимально достижимой в физиологических условиях. В то же время, белок mKate2 был представлен на HPLC двумя перекрывающимися пиками, что свидетельствует о наличии димерной составляющей при концентрации 10 мг/мл.