Введение к работе
Актуалыгость проблемы. Бешенство остается постоянной угрозой для человечества во многих частях света. Ежегодно регистрируется более 30000 случаев смерти от бешенства и 4 млн. человек требуется постэкспозиционное лечение более чем в 80 странах, где болезнь существует в наиболее опасном резервуаре инфекции среди собак (М.А. Селимов, 1965-1975; Vodopija Ivan, 1988; WHO, 1994).
По сводным данным ВОЗ в 1989 г. в мире отмечено 1670 вирусологически подтвержденных случаев бешенства у людей. За период с 1977 по 1990 г.г. в Европе зарегистрировано 108 случаев бешенства людей в 14 странах (Dtsch. Artebl., 1994). Заболеваемость этой инфекцией на 100 тыс. населения в России возросла с 1981 г. по 1991 г. в 2 раза. Ежегодно в стране прививается от бешенства около 200 тыс. человек (обращаемость составляет около 130 на 100 тыс. населения в год) (М.А.Величко, 1994).
Единственным методом предупреждения и лечения этого заболевания по-прежнему являются антирабическая вакцина и рабический иммуноглобулин. Поэтому необходимость усовершенствования и разработки новых эффективных и безопасных антирабических вакцин является наиболее реальным путем улучшения антирабической помощи.
Многочисленными исследованиями подтверждено, что в сравнении с мозговой вакциной и вакциной, приготовленной на куриных или утиных эмбрионах, культуральная вакцина на первичных клетках почек сирийского хомяка или диплоидных клетках человека является более безопасным препаратом (М.А.Селимов с соавт., 1965-1974; В.М.Морогова с соавт., 1980, 1981; P.Fenje, 1960; Y.Crick, F.Brown, 1970; S.Sehgal, 1992).
Культуральная вакцина на первичных клетках почек сирийского хомяка, впервые лицензированная в нашей стране для лечебной иммунизации человека, изготавливается с 1974 г. в ИПВЭ АМН СССР и с 1976 г. в НПО "Иммунопрепарат" (г.Уфа). Многолетними наблюдениями подтверждена ее высокая эффективность и хорошая переносимость при
профилактическом лечении многих тысяч людей, укушенных явно бешеными животными (М.А.Селимов, 1986).
Однако в свете последних практических достижений в области биотехнологии клеток животных, в качестве субстрата для изготовления противовирусных инактивированных вакцин приоритет отдается перевиваемым гетероплоидным клеткам. Их применение позволяет накапливать вируссодержащий материал с большим инфекционным титром и в больших количествах, а приготовленная вакцина, как правило, является более безопасной и имеет более низкую себестоимость (B.Y.Montagnon etal., 1981, 1983; R.E.Spier,1992; WHO, 1994).
Целью нашего исследования являлось изучение возможностей культивирования вируса бешенства штамма Внуково-32 в культуре перевиваемых клеток Vero для производства антирабической вакцины.
Задачи исследования:
1. Подбор субстрата перевиваемой клеточной линии для
успешной репродукции вируса бешенства штамма Внуково-32.
-
Адаптация штамма Внуково-32 к культуре гетероплоидных клеток зеленой африканской мартышки Vero.
-
Изучение репродукции штамма Внуково-32 при различных методах культивирования в культуре клеток Vero.
-
Поиск оптимальных условий суспензионного метода культивирования штамма Внуково-32 в культуре клеток на отечественных микроносителях.
-
Масштабирование процессов культивирования вируса бешенства, штамм Внуково-32, в культуре клеток Vero.
-
Получение экспериментальных серий антирабической вакцины в культуре клеток Vero на отечественных микроносителях.
Научная новизна и практическая значимость:
- впервые изучена репродуктивная активность штамма
Внуково-32 в перевиваемых клетках Vero, культивируемых
различными методами (стационарным, роллерным, псевдо-
суспензионным);
впервые определены оптимальные параметры
культивирования клеток Vero и вируса Внуково-32 на
отечественных микроносителях;
впервые определены оптимальные условия крупномасштабного культивирования вируса бешенства Внуково-32 в псевдосуспензионной культуре;
- разработана технология получения антирабической вакцины из штамма Внуково-32 на псевдосуспензиошюй культуре клеток Vero.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены в докладах на конференции "Культивирование клеток животных и человека" в г. Пущине Результаты. исследований были доложены на. международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа, 1995) и международной конференции "Настоящее и будущее вакцинологии" (Уфа, 1996).
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова. По материалам работы составлена и утверждена Инструкция по изготовлению и контролю препарата "Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая на перевиваемых клетках".
Дисссертация апробирована на заседании Ученого Совета Уфимского НИИ ВС им. И.И.Мечникова.
Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 9 публикациях. По способу получения вирусного материала подана заявка ГР № 94043360 и получено положительное решение о выдаче патента РФ от 22.01.96.
Объем и структура работы. Работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов (1 глава), раздела собственных исследований (4 главы), обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, цллюстрирована 20 таблицами, 5 рисунками и 14 фотографиями. Библиографический указатель содержит 77 отечественных и 100 иностранных литературных источников.