Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Cтруктура хроматина и модификации гистонов 10
1.1.1. Ацетилирование гистонов 12
1.1.2. Метилирование гистонов 14
1.1.3. Распознавание модификаций гистонов 15
1.1.4. Гистоновый код 16
1.1.5. АТФ-зависимое ремоделирование хроматина 18
1.2. SWI/SNF комплексы, ремоделирующие хроматин 21
1.2.1. Состав SWI/SNF комплексов 21
1.2.2. Структура и механизм действия SWI/SNF комплексов 24
1.2.3. Функции SWI/SNF
1.2.3.1. Участие SWI/SNF в регуляции транскрипции на промоторах генов 26
1.2.3.2. Участие SWI/SNF в регуляции работы транскрипционных энхансеров 30
1.2.3.3. Участие SWI/SNF в репарации 34
1.2.3.4. Комплексы SWI/SNF и раковые заболевания 35
1.2.3.5. Роль SWI/SNF в развитии организма 36
1.2.4. Альтернативные субъединицы SWI/SNF комплексов 40
1.3. PHF10 и его гомологи 47
1.3.1. SAYP – гомолог PHF10 в D. melanogater 47
1.3.2. PHF10/BAF45a – субъединица комплекса SWI/SNF комплекса 48
2. Материалы и методы 51
2.1. Материалы, использованные в работе 51
2.1.1. Штаммы Escherichia coli и векторы, использованные в работе 51
2.1.2. Бактериальные среды 51
2.1.3. Клеточные линии 52
2.1.4. Ферменты и реактивы 52
2.1.5. Антитела 52
2.1.6. Хроматографическая система 53
2.1.7. Праймеры 53
2.2. Методы, использованные в работе 57
2.2.1. Работа с клетками 57
2.2.1.1. Трансфекция клеток линии HEK293 57
2.2.1.2. Получение стабильных линий 57
2.2.1.3. РНК-интерференция 57
2.2.1.4. Измерение пролиферативной емкости клеток. 58
2.2.1.5. Иммуноокрашивание клеток 58
2.2.2. Работа с нуклеиновыми кислотами 59
2.2.2.1. Приготовление компетентных клеток 59
2.2.2.2. Трансформация бактерий 59
2.2.2.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 59
2.2.2.4. Обработка ферментами рестрикции 60
2.2.2.5. Лигирование 60
2.2.2.6. Гель-электрофорез ДНК 60
2.2.2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.2.2.8. Клонирование 61
2.2.2.9. Мутирование последовательности PHF10-S 62
2.2.2.10. Секвенирование ДНК 62
2.2.2.11. Выделение РНК 63
2.2.2.12. Получение кДНК 63
2.2.3. Работа с белками 63
2.2.3.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 63
2.2.3.2. Получение антител и их очистка 64
2.2.3.3. Получение белковых экстрактов из клеток 64
2.2.3.4. Осаждение белков антителами (иммунопреципитация) 65
2.2.3.5. Осаждение сумоилированных белков за His-тэг 65
2.2.3.6. Белковый гель-электрофорез 66
2.2.3.7. Вестерн-блот анализ 66
2.2.3.8. Гель-фильтрация белкового экстракта 66
2.2.3.9. Обработка ингибиторами протеасом, фосфатаз и фосфатазой фага Лямбда 67
2.2.3.10. Хроматиниммунопреципитация (ChIP) 67
3. Результаты 69
3.1. В клетках HEK293 PHF10 присутствует в виде многочисленных белковых изоформ 69
3.2. Открыты три новых мРНК гена PHF10 70
3.3. Четыре изоформы белка PHF10 71
3.4. Новые изоформы белка PHF10, не содержащие PHD домены, являются эволюционно консервативными 72
3.5. Изоформы PHF10 являются убиквитарными 74
3.6. Эндогенный белок PHF10 подвергается фосфорилированию 75
3.7. Белок PHF10 подвергается присоединению SUMO1 по PDSM мотиву 76
3.8. PHF10 является субъединицей комплексов PBAF и влияет на стабильность PBAF-специфичного модуля 78
3.9. PHF10-S и PHF10-P изоформы существуют на белковом уровне и входят в состав SWI/SNF комплекса на взаимоисключающей основе 80
3.10. Изоформы PHF10 включаются в состав SWI/SNF комплексов в фосфорилированном состоянии 82
3.11. PHF10-P изоформы, но не PHF10-S, контролируют пролиферацию клеток 84
3.12. Влияние PHF10-P- и PHF10-S-содержащих SWI/SNF комплексов на транскрипцию PHF10-зависимых генов 85
4. Обсуждение результатов 88
Заключение 91
Выводы 93
Список использованной литературы 94
Список использованных сокращений
- Распознавание модификаций гистонов
- SAYP – гомолог PHF10 в D. melanogater
- Трансформация бактерий
- PHF10-S и PHF10-P изоформы существуют на белковом уровне и входят в состав SWI/SNF комплекса на взаимоисключающей основе
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Судьба клетки зависит от реализации генетической информации, которая
хранится в последовательности ДНК. Процессы, происходящие с участием
геномной ДНК, в клетке осложнены тем, что ДНК должна быть сильно
компактизована. Определенный участок ДНК может быть доступен лишь
в конкретный момент времени. Изменение степени упакованности участков,
содержащих функциональные элементы генома, является важным механизмом
регуляции клеточных процессов. Такую локальную перестройку хроматина
осуществляют белки, названные ремоделерами хроматина. SWI/SNF – семейство
белковых комплексов, осуществляющих АТФ-зависимое ремоделирование
хроматина, играющих важную роль в процессах регуляции транскрипции, а также репарации ДНК и других биологических процессах.
SWI/SNF комплексы ремоделирующие хроматин представляют собой эволюционно-консервативные белковые комплексы, состоящие и порядка 10 полипептидов. Многочисленные работы показали, что многие субъединицы SWI/SNF имеют паралоги, которые альтернативно включаются в состав комплексов, что влияет на работу комплекса в целом. Разнообразие субъединиц обеспечивает специфичность в отношении определенных генов, типов клеток, тканей или стадий развития. В свою очередь, нарушение функций отдельных субъединиц приводит к развитию раковых заболеваний. Кроме того, специфичность SWI/SNF комплексов может регулироваться изоформами, образующимися в результате альтернативного сплайсинга и/или посттрансляционными модификациями субъединиц.
Белок PHF10/BAF45a является компонентом комплексов SWI/SNF, этот белок
эволюционно консервативен и имеет гомологи во всех многоклеточных животных.
Было показано, что PHF10 является субъединицей, специфичной для нейрональных
стволовых клеток, и необходим для их пролиферации. Однако другие исследования
показывают, что PHF10 экспрессируется убиквитарно, в том числе и в тканях
взрослого организма. В частности, PHF10 экспрессируется в органах кроветворения
во взрослом организме. Кроме того, было показано, что PHF10 влияет
на пролиферативную активность клеточных линий. Однако это влияние
неоднозначно, потому что как повышенная экспрессия, так и нокдаун PHF10 стимулирует пролиферативную активность клеток. Эти эффекты могут быть обусловлены тем, что PHF10 подвергается дополнительной регуляции на уровне сплайсинга транскриптов и посттрансляционных модификаций. Исследованию этой темы посвящена данная работа.
Цели и задачи
Целью данной работы являлось исследование изоформ коактиватора транскрипции PHF10, их доменной структуры, посттрансляционных модификаций и
сравнение влияния изоформ на транскрипцию генов, регулируемых комплексами SWI/SNF.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Исследовать структуру мРНК и белка PHF10, сравнить структурные особенности изформ PHF10;
-
Исследовать посттрансляционные модификации белка PHF10 и их влияние на ассоциацию PHF10 с комплексами SWI/SNF;
-
Исследовать влияние найденных изоформ PHF10 на скорость деления клеток;
-
Исследовать влияние изоформ PHF10 на транскрипцию генов, регулируемых комплексами SWI/SNF.
Научная новизна
В данной работе нами был открыт новый механизм регуляции работы
комплексов SWI/SNF. В частности, нами были обнаружены новые изоформы белка
PHF10, различающиеся между собой доменной структурой и способностью нести
на себе посттрансляционные модификации. Нами было показано, что все изоформы
включаются в состав комплексов SWI/SNF подсемейства PBAF на
взаимоисключающей основе и оказывают различное влияние на транскрипционную активность регулируемых генов.
Таким образом, мы показали, что альтернативные субъединицы SWI/SNF, которые являются продуктами одного гена, но несут разные домены и посттрансляционные модификации, могут оказывать влияние на работу всего комплекса.
Теоретическая и практическая значимость работы
В этой работе на примере белка PHF10 нами был открыт новый механизм регуляции работы комплексов SWI/SNF. Схожий механизм регуляции характерен и для другой субъединицы SWI/SNF комплекса – белка DPF3/BAF45b. Таким образом, открытый нами механизм замены функциональных белковых доменов (в частности, PHD доменов) на регуляторные последовательности, которые содержат сайты для посттрансляционных модификаций, является универсальным. Возможно, в ближайшие годы тот же механизм регуляции будет обнаружен и у двух других PHD-содержащих субъединиц SWI/SNF – DPF1 и DPF2.
Эти исследования имеют важное практическое значение, т.к. нарушения работы комплексов SWI/SNF часто являются причиной развития раковых заболеваний. При этом нарушения работы отдельных субъединиц связано с развитием рака определенного типа.
Наши исследования показывают, что работа SWI/SNF комплексов имеет
дополнительные уровни регуляции, в частности, альтернативный сплайсинг приводит к образованию изоформ различной доменной структуры. Таким образом, специфичность субъединиц SWI/SNF в отношении раковых заболеваний может проявляться на уровне альтернативных изоформ, что требует дополнительного изучения.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и биохимии.
Положения, выносимые на защиту
-
Ген PHF10 кодирует четыре зрелых мРНК, которые образуются в результате альтернативного старта транскрипции и альтернативного сплайсинга. мРНК PHF10 кодируют четыре изоформы белка, две из которых (PHF10-S) не содержат PHD домены;
-
Изоформы PHF10-S в клетках подвергаются присоединению полипептида SUMO1 по механизму, зависимому от фосфорилирования;
-
Все изоформы PHF10 подвергаются фосфорилированию и включаются в состав SWI/SNF комплексов подсемейства PBAF на взаимоисключающей основе;
-
Повышенная экспрессия изоформ PHF10-P, в отличие от изоформ PHF10-S, увеличивает скорость клеточного деления;
-
Посадка SWI/SNF комплексов, содержащих изоформы PHF10-P на промоторы SWI/SNF-зависимых генов способствует привлечению РНК-полимеразы II и активации транскрипции.
Степень достоверности и апробация результатов
Основные результаты диссертационной работы были представлены
на нескольких международных конференциях, в том числе, на конференции “Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids” (Вильнюс, 2010) конференции “Control of gene expression and cancer” (Москва, 2010) и на 22-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов и 37-м конгрессе Федерации европейских биохимических обществ FEBS (Севилья, 2012 г.) и на конференции «Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации
По результатам данной работы было опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 6 тезисов конференций.
Личный вклад соискателя
Автор внес существенный личный вклад в получение изложенных в диссертации научных данных. Все эксперименты, представленные в работе, выполнены соискателем лично, либо при его непосредственном участии. Кроме эксперимента по измерению скорости клеточного деления, который был выполнен сотрудницей Института Биологии Гена Сошниковой Наталией
Структура и объем диссертации
Распознавание модификаций гистонов
Последнее десятилетие исследований и накопленные знания о модификациях хроматина показали, что «гистоновый код», если и существует, то является сложным и не столь однозначным (в сравнении с генетическим кодом). Это значительно снизило оптимизм по его «взлому». В последнее время для обработки больших объемов данных о распределении по геному модифицированных гистонов и белков, связанных с хроматином, полученные методом иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием нового поколения (ChIP-seq), используют системы машинного обучения, такие как, скрытые Марковские модели или нейронные сети. Эти системы используются для предсказания состояний хроматина и поиска регуляторных элементов (Ernst и Kellis, 2010; Filion и др., 2010).
В частности, в одной из первых работ (Filion и др., 2010) на основании присутствия различных белков хроматина весь геном Drosophila melanogaster был разделен на 5 состояний, три из которых являются транскрипционно неактивными – «черное», «зеленое» и «синее», которые соответствуют хроматину, с отсутствующими метками, конститутивному гетерохроматину, отмеченному белком HP1, и факультативному гетерохроматину, отмеченному белками группы поликомб. Активный хроматин в D. melanogaster включал два состояния – «красный» и «желтый» хроматин. При этом «желтый» хроматин был обогащен генами домашнего хозяйства, экспрессирующимися повсеместно, а «красный» - генами, специфичными для различных клеточных линий.
Наиболее значимые попытки «взломать гистоновый код» человеческого генома были осуществлены в двух работах Эрнста (Ernst и Kellis, 2010; Ernst и др., 2011). В первой (Ernst and Kellis, 2010) – человеческий геном был разделен на 51 состояние, во второй работе было выделено 15 состояний хроматина, но эти состояния были размечены для девяти клеточных линий различного происхождения (Ernst и др., 2011). Состояния хроматина, выявленные в этих работах, включали в себя промоторы и транскрипционные энхансеры генов с различной активностью, области репрессированного хроматина и различные участки кодирующих областей генов. Эти работы позволили выявить корреляции между различными модификациями гистонов и регуляторными участками генома.
По сути, эти работы являются попытками «взломать гистоновый код». Полученные результаты указывают на то, что гистоновый код существует в некотором виде. Модификации гистонов являются, своего рода, дорожными знаками генома, размечающими определенные его участки и регулирующими работу молекулярных машин. Но в то же время, динамический характер гистоновых модификаций, говорит о том, что метки хроматина являются более сложным механизмом регуляции, чем это предполагается концепцией гистонового кода.
Хроматин является способом компактизации (плотной упаковки) ДНК, что может в итоге затруднять осуществление связанных с ДНК процессов, протекающих в клетке. Осуществление репликации, репарации, рекомбинации и транскрипции требует хотя бы частичного освобождения ДНК от нуклеосом, поэтому все упомянутые процессы протекают с участием АТФ-зависимых ферментов, ремоделирующих хроматин (ATP-dependent chromatin remodelers), или кратко – ремоделеров (Langst и Manelyte, 2015). Ферменты, ремоделирующие хроматин, осуществляют: перемещение (скольжение) нуклеосом относительно ДНК; элиминацию (удаление) нуклеосом; реструктурирование (замену гистонов) и замену нуклеосом (Langst и Manelyte, 2015). На молекулярном уровне каждое из этих действий требует нарушения контактов между ДНК и гистонами нуклеосомы, на что требуется затрата некоторого количества энергии, эта энергия высвобождается при расщеплении АТФ. Определенные типы ремоделеров отвечают за распределение нуклеосом по всему геному, в том числе и за их позиционирование в области промоторов (Tang и др., 2010).
Класс АТФ-зависимых ферментов, ремоделирующих хроматин, составляют белковые комплексы, состоящие из нескольких полипептидов (от 2 до 17 субъединиц), для которых характерна высокая эволюционная консервативность (от дрожжей до млекопитающих) и наличие АТФазной субъединицы в составе. Эта АТФаза относится к суперсемейству II хеликаз-подобных белков, а ее АТФазный домен состоит из двух частей: DExx и HELICc участков, соединенных между собой линкером. В зависимости от АТФазной субъединицы, все ремоделирующие хроматин комплексы принято делить на 4 семейства: ISWI, NURD/Mi-2/CHD, INO80 и SWI/SNF-содержащие (Langst и Manelyte, 2015). ISWI (Imitation SWItch) – семейство ремоделеров, содержащих от 2 до 4 субъединиц в своем составе. Комплексы dNURF, dCHRAC и dACF впервые были почищены из D. melanogaster, человеческие гомологи hWICH или hNoRC были открыты позднее. Большинство эукариот имеют несколько комплексов этого семейства, содержащих одну или две каталитические субъединицы и дополнительные белки (Langst и Manelyte, 2015).
Каталитические субъединицы семейства ISWI помимо АТФазного домена содержат на С-конце SANT-домен (ySWI3, yADA2, hNCoR, hTFIIIB), сопряженный со SLIDE-доменом (SANT-Like ISWI Domain), которые вместе образуют модуль для распознавания нуклеосомы, связывающий немодифицированные хвосты гистонов и ДНК (Boyer и др., 2004). Вспомогательные белки, входящие в состав комплекса несут в себе домены, распознающие модифицированные хвосты гистонов PHD цинковые пальцы и бромодомены в составе hBPTF и hACF1, дополнительные ДНК-связывающие мотивы (например, HMGI(Y) в составе dNURF301) и мотив, связывающий нуклеосому (hCHRAC 15-17).
Комплексы ISWI способны перемещать нуклеосомы вдоль ДНК, таким образом, изменяя структуру хроматина (Krasnov и др., 2016). Большинство комплексов ISWI (ACF1, CHRAC, RCF, WICH) участвуют в процессах репликации и репарации ДНК. В то время, как комплекс NoRC осуществляет репрессию транскрипции генов, а комплекс NURF участвует в активации транскрипции РНК-полимеразой II (там же).
CHD (Chromodomain Helicase DNA-binding) семейство, к которому относятся комплексы CHD и комплексы Mi-2, представители которого содержат от 1 до 10 субъединиц, было впервые выделено из Xenopus laevis. Характерной особенностью каталитических субъединиц этого семейства является наличие двух хромодоменов в N-концевой части белка. Несмотря на то, что у низших эукариот каталитическая субъединица действует в виде мономера, у позвоночных она входит в состав большого комплекса. Вспомогательные белки содержат различные домены, среди которых ДНК-связывающие, PHD, BRK, CR1-3 и SANT домены. Эти ремоделеры делятся на три семейства: CHD1 – содержит ДНК-связывающий домен на C-конце АТФазной субъединицы, CHD3-5 (также называются Mi-2) не содержат ДНК-связывающего домена, но имеют PHD цинковые пальцы, и CHD6-9, АТФазные субъединицы которых содержат либо SANT, либо BRK домены. Некоторые из ремоделеров семейства CHD осуществляют перемещение или удаление нуклеосом для облегчения транскрипции. Однако комплекс Mi-2/NuRD (Nucleosome Remodeling and Deacetylase) позвоночных, содержащий гистондеацетилазу (HDAC1/2) и MBD-белки (Methyl-CpG-Binding Domain), выполняет репрессионную функцию (Krasnov и др., 2016; Langst и Manelyte, 2015).
INO80 (INOsitol requiring 80) – семейство ремоделеров, которое состоит из более, чем 10 субъединиц, и включает SWR1-содержащие комплексы, представители которого впервые были очищены из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Это семейство включает ремоделеры человека hINO80, hSRCAP (SNF2-related CREB-activator protein) и p400 (который также обладает гистондеацетилазной активностью). Характерной особенностью каталитических субъединиц этого семейства является наличие длинной вставки в средней части АТФазного домена, которая связывается с хеликаза-подобными белками Rvb1/2 и ARP (Actin-related proteins – актин-подобные белки) белками. Комплексы дрожжей yINO80 и ySWR1 также содержат актин и Arp4. INO80 выполняет в клетке различные функции от сопровождения транскрипции до ДНК репарации. Хотя родственный INO80, SWR1 обладает уникальной способностью реструктурировать нуклеосомы, заменяя канонический димер H2A-H2B на димер H2A.Z-H2B осуществляя, таким образом, включение варианта гистона H2A.Z, который маркирует промотрные области активнотранскрибирующихся генов (там же). SWI/SNF (SWItching defective/Sucrose NonFermenting) семейство АТФ-зависимых ремоделеров хроматина, которое было впервые обнаружено в S. cerevisiae. Комплексы этого семейства содержат обычно от 8 до 14 субъединиц. АТФазы этого семейства содержат HSA (helicase-SANT) домен на N-конце белка, АТФазный домен в средней части и бромодомен на C-конце. В состав комплексов этого семейства также входят актин-подобные белки: ARPs у дрожжей, hBAF53a/b – у человека (там же). Это семейство ремоделеров далее будет рассмотрено подробнее.
SAYP – гомолог PHF10 в D. melanogater
Выделение РНК проводили с помощью TRI-reagent (Sigma-Aldrich) по следующему протоколу. 10 млн. клеток суспендировали пипетированием в 1 мл TRI-reagent до гомогенного состояния. Затем добавляли к этому раствору 100 мкл 1-бром-2хлорпропан и перемешивали. После центрифугировали 5 минут на скорости 12000 об./мин. Отбирали водную фазу, из которой РНК осаждали добавлением равного объема изопропанола. После осаждения РНК промывали 75% этанолом и высушивали при комнатной температуре.
Для получения кДНК брали 1 мкг тотальной РНК и 0,3 мкл 100 мкМ олиго-dT праймера (5 TTTTTTTTTTTTTTTTTVN), либо случайного праймера длиной 6 оснований, добавляли воду до 5 мкл, нагревали до 65С, помещали в лед на несколько минут. Добавляли 2 мкл 5х RT буфера и RiboLock производства ThermoFisherScientific 200 ед. Затем добавляли обратную транскриптазу RevertAid (ThermoFisherScientific) и инкубировали 2 ч. при 42С. Реакцию останавливали нагреванием до 70С в течение 10 минут.
Для экспрессии рекомбинантных белков соответствующими конструкциями трансформировали клетки Е. coli BL21. Выросшими колониями инокулировали среду 2YT (ампицилин 50 мг/мл) и растили клетки до оптической плотности ОБбоо=0,6 с покачиванием при температуре 30С. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением в среду нерасщепляемого аналога лактозы (IPTG) до концентрации 0,1-1 мМ. Экспрессию проводили в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием, осадок хранили при -20С.
Из клеточных лизатов при помощи MNTA агарозы (GE Healthcare) выделяли рекомбинатные белки с гистидиновым тэгом. Сначала клеточный осадок, полученный из 500 мл среды, ресуспен-дировали в 25 мл LB (50 мМ NaPi рН=8,0; 300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол). Затем добавляли лизо-цим до 0,4 мг/мл, инкубировали 30 мин. во льду, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали 30 мин. на 12000 об./мин., супернатант наносили на колонку с 1 мл NiNTA агарозы, инкубировали 1 ч. при 4С. Отмывали смолу от несвязавшихся белков 10 мл буфера для промывки (50 мМ NaР; рН=8,0; 300 мМ NaCl; 20 мМ имидазол). Элюировали связавшиеся с NiNTA агарозой белки в подходящем объеме буфера для элюции (50 мМ NaРi рН=8,0; 300 мМ NaCl; 250 мМ имидазол). Фракции, содержащие белок, диализовали против ФСБ+ 20 % глицерин. В случае нерастворимого белка осадок после лизиса клеток промывали, растворяли в денатурирующем буфере (8М мочевина; 100 мМ NaH2P04; 10 мМ Трис; рН=8,0; 10 мМ имидазол), далее очищали по той же процедуре с использованием денатурирующего буфера с добавлением имидазола.
Для получения поликлональных антител кроликов, животных иммунизировали каждые две недели внутрикожной инъекцией смеси 1:1 адъюванта Фрейнда (Sigma) и 500 мкг рекомбинантно-го белка. После 6-8 месяцев иммунизации проводили забор крови. Сыворотку крови осветляли методом центрифугирования в течение 10 минут при 4 000 об./мин. Наличие иммунного ответа проверяли методом Вестерн-блот анализа (см. пункт 2.2.3.2.) экстракта клеток НЕК293, сравнивая сыворотку крови, полученную до начала иммунизации, с сывороткой, после иммунизации.
Антитела из сыворотки очищали аффинно. Для этого с BrCN-активированной сефарозой (Pharmacia) ковалентно сшивали антиген по методике производителя. Далее 1 мл сефарозы с ковалентно-пришитыми 10 мкг антигена инкубировали с 10 мл сыворотки в течение 12 часов при температуре +4С. Затем сефарозу промывали 20 мл раствора ФСБ, антитела элюировали раствором 0,1 М глицин, рН=2,7, фракциями по 1 мл. Сразу после элюции глицин был нейтрализован добавлением 60 мкл раствора 1М Трис-HCl рН=9,0 в каждую фракцию. Фракции, содержащие высокую концентрацию белка объединяли и диализовали против ФСБ с 20 % глицерина. Полученный раствор антител аликвотили, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре - 70 С. Специфичность антител проверяли методом Вестерн-блот анализа и иммуноосаждения белков из экстракта клеток НЕК293.
Эукариотические клетки выращивали до конфлюэнтности -100%, затем удаляли питательную среду и смывали клетки с чашек буфером ФСБ. Полученную суспензию клеток осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 2 500 об./мин. После удаления супернатанта клетки лизировали в буфере, содержащем 10 мМ HEPES-KOH (рН=7,9); 5 мМ MgCh; 0,5% NP-40; 0,45 М NaCl; 1 мM ДTT и коктейль ингибиторов протеаз (PIC) (Roche). После получасового лизиса на льду экстракт центрифугировали на 12 тыс. об./мин. 15 минут при температуре +4С. Затем супер-натант разбавляли тремя объемами буфера для разбавления, содержащего 10 мM HEPES-KOH (pH=7,9); 5 мM MgCl2; 1 мM ДTT и коктейль ингибиторов протеаз (PIC) и ДНКазу I (Thermo Fischer Scientific). Разбавленный экстракт снова центрифугировали на 12 тыс. об./мин 15 минут при температуре +4С. Полученный осветленный раствор использовали для проведения иммунопреци-питации и вестерн-блот анализов.
Для проведения иммунопреципитации предварительно проводили посадку антител на ProeinA сефарозу. С этой целью антитела к целевому белку инкубировали с ProteinA сефарозой в буфере для посадки (ФСБ + 0,1% NP-40) в течение 2 часов при 4С. Затем от несвязавшихся антител сефарозу трижды отмывали буфером для посадки.
Далее к ProteinA сефарозе добавляли тотальный белковый экстракт, полученный по методике, описанной выше (см. пункт 2.2.3.3.), и инкубировали в течение ночи при +4С при постоянном перемешивании. После этого сефарозу два раза промывали буфером IP500 (25 мМ Трис-HCl; pH=7,9; 5 мМ MgCl2; 10% глицерин; 100 мМ NaCl; 0,1% NP-40) и один раз буфером IP100 (25 мМ Трис-HCl; pH=7,9; 5 мМ MgCl2; 10% глицерин; 100 мМ NaCl; 0,1% NP-40). Белки, специфически связавшиеся с антителами элюировали нагреванием до 99С в течение 10 минут в SDS-содержащем буфере для нанесения на белковый электрофорез (см.пункт 2.2.3.6.).
Для проверки сумоилирования PHF10 мы провели трансфекцию клеток линии HEK293 конструкцией на основе плазмиды pcDNA для экспрессии полипептида SUMO1, слитого с гистидино-вым тэгом. Через два дня после трансфекции, из клеток был получен белковый экстракт по протоколу, описанному выше (см. пункт 2.2.3.3.). Далее проводили связывание белкового экстракта, полученного из 1 млн. клеток, с 15 мкл NiNTA агарозы в течение 1 часа при температуре +4С при перемешивании. Затем агарозу трижды промывали буфером IP500 с добавлением имидазола (25 мМ Трис-HCl; pH=7,9; 5 мМ MgCl2; 10% глицерин; 100 мМ NaCl; 0,1% NP-40; 10мМ имида-зол). Белки, связавшиеся с NiNTA агарозой элюировали буфером с 250 мМ имидазола (25 мМ Трис-HCl; pH=7,9; 5 мМ MgCl2; 10% глицерин; 100 мМ NaCl; 0,1% NP-40; 10мМ имидазол). Из
Трансформация бактерий
Для изучения белков, содержащих PHD цинковые пальцы нами были получены и аффинно очищены поликлональные кроличьи антитела против эпитопа, состоящего из двух PHD доменов белка PHF10 (Рисунок 2Б). В экспериментах по иммуноосаждению из клеточного экстракта, обработанного фосфатазой фага Лямбда анти-PHD антитела осаждали только две полоски из четырех (Рисунок 8А). Таким образом они позволяют разделить между собой PHF10-P и PHF10-S изофор-мы. PHF10-P изоформы также были детектированы при анализе исходного (необработанного фос-фатазой) белкового экстракта (Рисунок 8Б).
Так как стехиометрия SWI/SNF комплекса до сих пор неизвестна, но в то же время имеются данные о том, что некоторые субъединицы (например, BAF155 и BAF170) могут входить в состав комплекса в виде гомо- или гетеродимеров, то мы решили проверить, находятся ли PHF10-P и PHF10-S изоформы в составе PBAF комплекса одновременно, либо они включаются в различные комплексы. Для этого комплексы, содержащие PHF10-P изоформу были истощены из экстракта клеток линии HEK293 с помощью иммуноосаждения антителами против PHD доменов PHF10 (Рисунок 8В и 8Г). При этом PHF10-S изоформа практически полностью осталась в истощенном экстракте (дорожка №5 на Рисунке 8Г). PHF10-S изоформа также не была детектирована во фракциях, осажденных анти-PHD антителами (дорожка №3 на Рисунке 8Г). Это указывает на то, что комплексы SWI/SNF, содержащие PHF10-P изоформу, не содержат PHF10-S изоформу, т. е. они являются взаимоисключающими.
Подтверждение существования PHF10-S и PHF10-P изоформ с помощью антител, специфичных против PHD-доменов PHF10. (А) – Результаты вестерн-блот анализа анти-PHF10 антителами фракций, осажденных антителами анти-PHD из экстракта клеток HEK293, обработанного фосфатазой фага Лямбда. Справа обозначен уровень, на котором наблюдаются изоформы PHF10 в дефосфорилированном экстракте. (Б) – Результаты вестерн-блот анализа анти-PHD и анти-PHF10 антителами белкового экстракта клеток линии HEK293. (В) – Схема эксперимента по раздельному осаждению PHF10-S и PHF10-P изоформ антителами против BAF200. На первой стадии был получен экстракт, из которого антителами анти-PHD были истощены изоформы PHF10-P (5 на рисунке) и контрольный экстракт, истощенный неспецифическими антителами IgG (4 на рисунке). На втором этапе из этих экстрактов провели иммуноосаждение (ИП) антителами против BAF200 (фракции 7 и 9 на рисунке) и неспецифическими антителами IgG (фракции 6 и 8 на рисунке). (Г) – Результаты вестерн-блот анализа фракций, полученных в эксперименте по раздельному осаждению PHF10-S и PHF10-P изоформ антителами против BAF200. Номера фракций обо 82 значены на рисунке 7Г. Окраска производилась антителами анти-PHF10. На узких панелях приведена окраска антителами против BAF200.
Из полученного истощенного экстракта (дорожка №5 на Рисунке 8Г), а также из контрольного экстракта (дорожка №4 на Рисунке 8Г), затем было проведено иммуносоосаждение антителами против субъединицы BAF200. При этом и изоформа PHF10-P, и изоформа PHF10-S были обогащены во фракциях, осажденных BAF200 (дорожки №7 и №9 на Рисунке 8Г). Этот результат говорит о том, что обе изоформы включаются в состав комплексов SWI/SNF, при этом комплексы, содержащие изоформы PHF10-P, не содержат изоформы PHF10-S и наоборот. Т.е. эти изоформы в составе комплекса являются альтернативами друг другу.
Эти эксперименты показывают, что PHF10-S и PHF10-P изоформы включаются в состав SWI/SNF комплексов подсемейства PBAF на взаимоисключающей основе.
В экспериментах по иммуносоосаждению изоформ PHF10-P и PHF10-S антителами против других субъединиц комплекса SWI/SNF нами было замечено, что осажденные фракции содержат изоформы PHF10, обладающие низкой подвижностью в ПААГ, в то время, как белки, оставшиеся в истощенном экстракте и невзаимодействующие с BAF200 практически не несут на себе фосфори-лирования и обладают повышенной подвижностью в ПААГ (Рисунки 7Г и 8А).
Важно отметить, что при иммуноосаждении антителами против PHF10 осаждались все формы белка (Рисунок 9А). Те же эффекты мы наблюдали и при иммуносоосаждении PHF10-S и PHF10-P изоформ, меченных FLAG-тэгом: изоформы, осажденные за субъединицы PBAF комплекса обогащены модифицированным белком, в то время, как истощенный экстракт содержит преимущественно немодифицированные изоформы белка (Рисунок 10Б).
Мы также провели хроматографическое разделение белкового экстракта из клеток HEK293 на гель-фильтрационной колонке Superose6. Полученные фракции были проанализированы методом вестерн-блот анализа (Рисунок 9Б). В этом эксперименте было обнаружено, что модифицированные формы PHF10 концентрируются во фракциях, содержащих крупные белковые комплексы, имеющие размеры от 1 до 2 МДа. В этих фракциях также были обнаружены другие компоненты комплекса SWI/SNF (BAF200 на Рисунке 9Б). В то же время, немодифицированные формы PHF10 обнаруживаются в более поздних фракциях. Это указывает на то, что немодифицированные формы PHF10 не включаются в состав SWI/SNF комплексов и находятся в экстракте в свободном состоянии.
Рисунок 9. Изоформы PHF10 включаются в состав SWI/SNF комплексов в фосфорилирован-ном состоянии. (А) – Результаты вестерн-блот анализа анти-PHF10 антителами фракций, осажденных антителами против субъединиц SWI/SNF комплексов. (Б) – Результаты вестерн-блот анализа анти-PHF10 и анти-BAF200 антителами фракций, полученных при разделении белкового клеточного экстракта на колонке Superose6. Внизу приведена оценка массы белковых комплексов, полученная при калибровке. Справа обозначен подвижность белкового маркера. 3.11. PHF10-P изоформы, но не PHF10-S, контролируют пролиферацию клеток
Далее мы попытались оценить функциональные различия PHF10-P и PHF10-S изоформ. Ранее было показано влияние PHD-содержащей изоформы PHF10 на пролиферативную способность клеток (Banga и др., 2009). В то же время PHF10-S изоформа может оказывать влияние на активность всего SWI/SNF комплекса и выполнять в клетке другие функции. В связи с этим мы попытались проверить, какое влияние оказывают обе изоформы PHF10 на пролиферативную активность клеток. С этой целью нами были получены две линии клеток HEK293, одна из которых стабильно несла конструкцию для экспрессии PHF10-P изоформы, а другая – PHF10-S изоформы. В обеих стабильных линиях уровень экспрессии изоформ, меченных FLAG-тэгом, был на одинаковом уровне, при этом меченный FLAG-тэгом PHF10, составлял примерно 3/4 всего PHF10 клетки. Мы установили, что в обеих клеточных линиях белок, меченный FLAG-тэгом, локализован преимущественно в ядре (Рисунок 10А) и включен в состав комплекса SWI/SNF (Рисунок 10Б).
PHF10-S и PHF10-P изоформы существуют на белковом уровне и входят в состав SWI/SNF комплекса на взаимоисключающей основе
Регуляция экспрессии генов ZMIZ1 и NOV изоформами PHF10. (А) – Результаты иммунопреципитации хроматина антителами против субъединиц PBAF комплекса – BRG1, BAF200, BAF180, против РНК-полимеразы II, и анти-FLAG-агарозой, для преципитации изоформ PHF10-P и PHF10-S. Показано обогащение осажденной фракции фрагментами промоторов генов ZMIZ1 и NOV и удаленного геномного участка. Результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК в образце. (Б) – относительное изменение уровня транскрипции генов ZMIZ1 и NOV в линиях клеток, экспрессирующих PHF10-P и PHF10-S изоформы. Указано стандартное отклонение. Мы также провели иммунопреципитацию хроматина антителами против РНК-полимеразы II и обнаружили повышенный уровень РНК-полимеразы II на промоторах изучаемых генов в линии клеток, экспрессирующих PHF10-P изоформу, в то время, как в линии PHF10-S – уровень РНК-полимеразы II был практически неизменным в сравнении с исходной линией клеток (Рисунок 11А).
Мы также измерили уровень транскрипции генов NOV и ZMIZ1 в исходной клеточной линии и в клеточных линиях, экспрессирующих изоформы PHF10-P и PHF10-S (Рисунок 11Б). Оказалось, что в клеточной линии, в которой проводилась экспрессия изоформы PHF10-P, гены NOV и ZMIZ1 имели повышенный уровень экспрессии (Рисунок 11Б).
Таким образом, несмотря на присутствие на промоторах генов PBAF комплексов, содержащих и PHF10-P, и PHF10-S изоформы, именно наличие PHF10-P изоформ обеспечивает эффективную посадку РНК-полимеразы II и последующую транскрипцию.
В этой работе были открыты и описаны три новых изоформы белка млекопитающих PHF10/BAF45a – субъединицы PBAF комплекса, ремоделирующего хроматин. Одна из открытых нами изоформ, как и ранее известный белок, содержит PHD домены (изоформы PHF10-P). Две другие изоформы (изоформы PHF10-S) содержат на C-конце мотив для фосфат-зависимого присоединения SUMO1. Изоформы PHF10-S являются эволюционно консервативными, что свидетельствует об их функциональной значимости. Изоформы обоих типов (PHF10-P и PHF10-S) убикви-тарны, экспрессируются в различных тканях человека и клеточных линиях различного происхождения и являются компонентами PBAF комплексов, ремоделирующих хроматин. В то же время, значительные различия в доменной структуре этих белков определяют разницу в экспрессии подконтрольных генов. PHF10-P изоформа стимулирует прогрессию клеточного цикла и повышает уровень РНК-полимеразы II, связанной с промотором, благодаря чему действует в качестве ко-активатора транскрипции (Рисунок 12). Функциональное различие двух изоформ возникает вследствие различного действия содержащих их PBAF комплексов.
Все изоформы PHF10 подвержены посттрансляционному фосфорилированию, что является доказательством тонкой регуляции их функций. Кроме того, изоформы PHF10-S подвергаются присоединению полипептида SUMO1 по механизму, зависимому от фосфорилирования. В фосфо-рилированном виде все изоформы PHF10 плотно ассоциированы с другими компонентами PBAF комплекса (hPolybromo, BAF180 и BRD7), и организованы в стабильный модуль. Оба типа изо-форм содержат в своем составе консервативный SAY-домен, ответственный за включение белка в состав комплекса, как это было показано для белка SAYP – гомолога PHF10 в D. melanogaster (Vorobyeva и др., 2009a). Нокдаун белка PHF10 ведет к снижению количества других PBAF-специфичных субъединиц, вследствие нарушения целостности маркирующего модуля. Эти результаты также подтверждают ранее полученные данные (Vorobyeva и др., 2009a) о том, что белок D. melanogaster SAYP является компонентом, необходимым для сборки PBAP-специфичного модуля.
Белки, содержащие PHD цинковые пальцы, образуют крупное семейство ко-активаторов, способных узнавать посттрансляционные модификации N-концевых доменов гистонов. Наши результаты указывают на то, что PHD домены белка PHF10 стимулируют транскрипцию, вследствие того, что изоформа PHF10-P выступает в роли ко-активатора транскрипции, привлекая РНК 89 полимеразу II на промоторы генов и усиливая транскрипцию соответствующих генов. Ранее было показано (Vorobyeva и др., 2009a), что удаление PHD доменов гомологичного белка SAYP приводит к снижению уровня транскрипции SAYP-зависимых генов.
Наши данные говорят о том, что комплексы PBAF, содержащие PHF10-S и PHF10-P изофор-мы, практически в равной степени представлены в клетках человека. При этом замена PHF10-P изоформы на PHF10-S не приводит к изменению субъединичного состава и не меняет промотор-ную специфичность всего комплекса. Однако, PHF10-S изоформа играет противоположную роль в регуляции генов, т. к. она, в отличие от PHF10-P изоформы, не усиливает транскрипцию и не повышает уровень РНК-полимеразы II на промоторе.
Наши данные говорят о том, что комплексы PBAF, содержащие PHF10-S и PHF10-P изофор-мы, практически в равной степени представлены в клетках человека. При этом замена PHF10-P изоформы на PHF10-S не приводит к изменению субъединичного состава и не меняет промотор-ную специфичность всего комплекса. Однако, PHF10-S изоформа играет противоположную роль в регуляции генов, т. к. она, в отличие от PHF10-P изоформы, не усиливает транскрипцию и не повышает уровень РНК-полимеразы II на промоторе.
Тот факт, что и сумоилированная и несумоилированная изоформы PHF10-S ассоциированы с другими компонентами SWI/SNF указывает на то, что сумоилирование PHF10-S происходит в составе комплекса. Хотя функция этой модификации остается неясна. Мотив для фосфат-зависимого сумоилирования, обнаруженный нами в новой изоформе PHF10, ранее был исследован в других регуляторных белках, сумоилирование которых либо усиливало, либо подавляло их функцию активации транскрипции (Hietakangas и др., 2006).
Интересно и то, что для PBAF комплекса до сих пор не было показано альтернативных субъединиц, в то время, как для комплексов BAF обнаружены две разновидности специфичной субъединицы BAF250a и BAF250b, а также несколько альтернативных паралогов BAF45b, BAF45c и BAF45d.
В этой работе мы открыли новый механизм регуляции работы комплексов SWI/SNF. Все четыре изоформы PHF10 являются продуктами одного гена, но вследствие альтернативного сплайсинга, две из них потеряли PHD-домены в своем составе, но приобрели способность нести дополнительные посттрансляционные модификации. Данный механизм регуляции является универсальным и позже был обнаружен у другой субъединицы SWI/SNF комплекса – BAF45b известной также, как DPF3 (Cui и др., 2016). Как и в случае PHF10, каноническая изоформа DPF3b содержит тандем из двух PHD доменов, а альтернативная изоформа DPF3a имеет альтернативный С-конец белка, который нарушает структуру PHD доменов. PHF10 – включается в состав комплексов подсемейства PBAF, а DPF3 является субъединицей комплексов подсемейства BAF. Несмотря на то, что о существовании изоформ DPF3a и DPF3b было известно достаточно давно, лишь недавно было показано функциональное различие этих изоформ. В частности, альтернативная изоформа DPF3a подвергается фосфорилированию посредством казеиновой киназы типа 2 (CK2) именно в области альтернативного C-конца, после чего приобретает сродство к транскрипционным репрес-сорам семейства HEY (Cui и др., 2016).