Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика ящура ведется с применением препаратов, приготовленных на основе инактивированного вируса. Промышленное производство вакцин связано с наработкой больших объемов вирулентного вируса, сохранение структуры и свойств которого имеет первостепенное значение при получении высококачественных вакцин нового поколения.
Создание вакцин нового поколения базируется на получении инак-тивированных антигенов вируса яшура в концентрированном виде, что вызывает необходимость определения условий сохранения устойчивости вируса на различных технологических этапах, связанных с репродукцией вируса в суспензии клеток ВНК-21, с очисткой вируссодержащих суспензий от балластных белков и сопутствующих веществ, с концентрированием вируса, его инактивацией, хранением, высушиванием и др.
Несмотря на то, что проблема инактивации вируса ящура принципиально решена на уровне ее практического применения при изготовлении противоящурных вакцин, имеет место целый ряд вопросов, касающихся расшифровки механизмов инактивации вируса ящура в различных условиях. Рассматривая условия существования вирусов in vivo и vitro можно заключить, что среди факторов влияющих на сохраняемость вируса первоочередную роль играют температура и рН среды ( В.В.Макаров, И.А. Бакулов, 1974).
По данным Бахраха (1957) термоинактивация вируса объясняется двумя механизмами реакции без раскрытия их сущности. Кроме того, указанные подходы не оказались продуктивными в плане сохранения устойчивости вируса ящура в зоне температур 15-55С. Это подтверждается тем, что гипотеза о существовании двух различных механизмов термоинактивации - "нуклеинового" и "протеинового" не позволяет объяснить сохранение устойчивости антигенов вируса ящура, получаемых, например, методами сублимационной и распылительной сушки (Кравченко В.М. и соавт.,1983).
Литературные^ сведения по инактивации вируса ящура в кислой и щелочной среде чаще всего ограничены констатацией фактического материала без теоретического объяснения феномена разрушения вирусных структур. Следует также отметить, что известные из литературы сведения о механизмах инактивации
вируса ящура при воздействии внешних факторов различной природы нельзя считать убедительными, так как отсутствует единая теория этого явления. По-видимому, задачу поддержания активной и специфичной структуры вируса, то есть сохранение его устойчивости на этапах наработки вирусного сырья, очистки, концентрирования, хранения, инактивации, а также в составе противоящурных вакцин нельзя решить без феноменологического описания взаимосвязи между физико-химическими свойствами вирусных частиц и микроокружением внешней среды. При этом следует учитывать важнейшую особенность строения вирусных частиц как функционирующих биосистем, в структуре которых целесообразно различать структурный и функциональный аспекты организации вирусных частиц (Энгельгардт В.А., 1981). Иными словами, проблема сводится к определению коррелирующей взаимосвязи структуры вирионов с их функциональностью, основой которой является принцип накопления, хранения, реализации и утраты энергии вирусными частицами, как биосистем обладающих свойством живого только в потенциале (Bandea, 1983).
Перечисленные выше нерешенные вопросы указывают на актуальность намеченных исследований, направленных на изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура, что является важной задачей при разработке и получении высококачественных вакцин и диагностических препаратов.
-
Цель работы. Основной целью работы являлось изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура на этапах культивирования, очистки и концентрирования, хранении при различных температурах, воздействии внешних факторов различной природы, высушивании, изготовлении вакцин, а также изучение признаков симметрии - асимметрии в структуре 146S частиц вируса ящура.
-
Основные задачи исследований. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие вопросы:
-отработать оптимальные условия получения высококонцентрированных препаратов вируса ящура и на их основе получить препаративные количества 146S частиц для изучения строения, физико-химических и биологических свойств вируса ящура различных типов;
-установить возможные причины повреждения вирусных структур в динамике их накопления при культивировании вируса ящура в суспезии клеток ВНК-21 и изучить влияние рН на репродукцию вируса ящура и некоторых других вирусов животных;
-изучить влияние на структуру и свойства вируса ящура рН среды
суспендирования, солевых и буферных растворов, высушивания вирусных
препаратов, действия ферментов, специфических антител, химических инактивантов, электрического и магнитного полей;
-определить электрофизическую характеристику структурных полипептидов и целых вирионов вируса ящура различных типов;
-изучить признаки симметрии и асимметрии в строении 146S частиц вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и вируса везикулярной экзантемы свиней;
-обосновать механизм стабилизации и инактивации вируса при воздействии физико-химических факторов.
1.4. Научная новизна. Впервые разработан метод очистки, концентрирования, стабилизации и вьщеления 146S частиц вируса ящура с получением их в препаративных количествах в виде обезвоженных концентрат -порошков (авторское свидетельство СССР №1102272), что позволило стандартизировать исходные условия опытов при проведении молекулярно-биологических, вирусологических и иммунобиологических исследований (авторские свидетельства СССР №1489177, №15650221 и №1615917).
Определены условия повышения чувствительности клеток ВНК-21 к вирусу ящура, вирусу диареи КРС и аденовирусу КРС, свидетельством чему является ускорение темпа поражения клеток вирусом, что позволяет уменьшить вероятность модификации указанных выше вирусов в процессе их репродукции в суспензии клеток ВНК-21.
Впервые установлен режим стабилизации структуры и свойств вируса ящура различных типов при замораживании очищенных и концентрированных суспензий. Показано, что оптимальные условия сохранения вируса определяются выбором буферного раствора и рН суспензии, замораживаемой при температуре минус 10-40С.
Установлено, что регулирование процесса удаления влаги из концентрированных препаратов вируса, достигаемое совмещением процесса концентрирования и обезвоживания вируссодержащей суспензии методом ультрафильтрации с последующим активным вентилированием мембраны с концентратом вируса и вакуумированием концентрат-порошка, позволяет получать препараты с остаточной влажностью менее 1% при сохранении биологических свойств вируса ящура.
Показана возможность использования метода электронной микроскопии для количественной экспресс-оценки нативных и инактивированных антигенов вируса ящура, предназначенных для изготовления противоящурных вакцин. Разработаны различные способы получения поляризованных пленок-подложек для изучения строения вирусных частиц и их электрофизических свойств (авторские свидетельства СССР №445961, №469913 и №481639).
1.5. Теоретическое значение работы. На основании электронно-микроскопических исследований морфологии вируса ящура с использованием поляризованных пленок-подложек показано, что под воздействием электрического потенциала поверхности пленки-подложки в структуре белкового капсида вирионов происходят конформационные изменения. В зависимости от величины положительного электрического потенциала пленок-подложек (авторское свидетельство СССР №469913) конформационная перестройка может вызывать смещение изозлектрической точки с pi 5,7 в объеме в сторону больших значений (ориентировочно pi 7,0-7,4) в монослое на поверхности пленок-подложек. Контрастирование вирусных частиц в их изозлектрической точке, характеризующейся равенством противоионов раствора ФВК в адсорбционном слое заряженным группам на поверхности вирионов, позволило выявить признаки смешанного контраста в виде негативно и позитивно окрашенных участков белкового капсида. Наличие положительно и отрицательно заряженных участков поверхности 146S частиц отражает асимметричность их строения. При более высоких электрических потенциалах как положительной, так и отрицательной полярности пленок-подложек конформационная перестройка белкового капсида сопровождается разрушением структуры вирионов на отдельные структурные компоненты.
В опытах по изоэлектрическому фокусированию белков вируса ящура установлено, что структурный полипептид VP1 заряжен положительно, а полипептиды VP2 и VP3 - отрицательно, ассоциация которых в структуру протомера приводит к образованию асимметричного диполя. С учетом электрофизических параметров структурньк полипептидов показано, что целые вирионы вируса ящура обладают суммарным электроотрицательным зарядом, величина которого существенно различается у отдельных типов вируса и обуславливает их различную устойчивость в идентичных условиях внешней среды.
Результаты исследований показали, что устойчивость вируса ящура зависит от сохранения природного базового свойства вирусных частиц - их
электрического заряда. Определяющим фактором механизма инактивации вируса ящура является сообщение системе вириона дополнительной энергии, вызывающей изменение энергетического состояния вируса, а следовательно и его функции. В частности это следует из того, что от состояния ионизации карбоксильных групп белковой оболочки вирионов или величины их электроотрицательного заряда, определяемого величиной рН среды, зависит устойчивость вируса при замораживании очищенных и концентрированных суспензий.
1.6. Практическое значение работы. На основании проведенных исследований разработан комплексный метод получения из суспензий нативного и инактивированного вируса ящура концентрированных препаратов в обезвоженном порошкообразном состоянии, в составе которых вирус сохраняет свои биологические свойства в течение нескольких лет.
Выполненные разработки вошли в технологические разделы нормативно-технической документации: "Временная инструкция по изготовлению и контролю универсальной и поливалентной вакцины против ящура типов А, О, С и Азия-1", утвержденная ГУВ 19 июня 1991 года; ТУ "Вакцина против ящура бивалентная типа А,О (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) инактивированная", утвержденные директором института и согласованные с департаментом ветеринарии МСХиП Российской Федерации в 1995 году.
Показана возможность сокращения в среднем в два раза времени репродукции вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21, что имеет важное практическое значение в плане снижения производственных и энергетических затрат при наработке вируссодержащего материала для изготовления биопрепаратов. Кроме того, ускорение темпа поражения клеток вирусом значительно уменьшает опасность развития контаминации, причиной которой могут быть материалы и условия культивирования.
В процессе работы по получению очищенных и концентрированных препаратов вируса разработаны и утверждены следующие методики, которые прошли комиссионные испытания и используются при молекулярно-биологических исследованиях и получении биопрепаратов:
-"Методика получения высокоочищенных суспензий вируса ящура". Утверждена директором института 01. 06. 83 года;
-"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизированного вируса ящура А22". Утверждена директором института 24. 05. 86 года.
-"Методика получения высококонцентрированного вируса ящура". Утверждена директором института 19. 01. 88 года;
-"Методика препаративного выделения 146S частиц вируса ящура и их количественная оценка. Утверждена директором института 19. 01. 88 года;
-"Методика подготовки посевного очищенного и концентрированного вируса ящура для культивирования в суспензии". Утверждена директором института 28. 12. 93 года.
По результатам исследований морфологического и молекулярно-биологического строения вируса ящура разработаны следующие методики:
-"Методика оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощью электронной микроскопии". Утверждена директором института 25. 12. 87 года;
-"Методика изоэлектрического фокусирования белков вируса ящура в полиакриламидном геле". Утверждена директором института 31. 01. 89 года. Методики внедрены в лабораторную практику института и используются также при исследовании других вирусов животных.
1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1.7.1. Результаты определения оптимальных условий очистки,
концентрирования, стабилизации и выделения 146S частиц вируса ящура с
переводом последних в обезвоженное порошкообразное состояние.
1.7.2. Исследования по репродукции вируса ящура и некоторых других
вирусов животных в зависимости от рН суспензии клеток ВНК-21, а также
результаты проверки рН-зависимой устойчивости вируса ящура в составе
очищенных суспензий, замороженных при температуре минус 10+2С.
1.7.3. Результаты исследований механизмов инактивации вируса ящура под
воздействием внешних факторов в процессе культивирования в суспензии клеток
ВНК-21, влиянии на вирус различных температур, солевых и буферных растворов,
при образовании пены в суспензии, при высушивании вирусных препаратов,
воздействии ферментов, специфических антител, химических инактивантов,
электрического и магнитного полей.
1.7.4. Исследования морфологических и молекулярно - биологических
особенностей строения вируса ящура различных типов с выявлением признака
асимметрии в структуре вирусных частиц. Результаты исследований изменений в морфологии вирноно» при различных внешних воздействиях.
1.8. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета института в виде ежегодных
отчетов по темам государственных заданиіі 8.1.-3.81. 7.2.2.-84. 12. 08 и 02.04.М
(1980-1995); на симпозиумах специалистов стран-членов СЭВ (1981, г. Владимир;
1988, г. София); IV. V и VI Всесоюзных ветеринарных вирусологических
конференциях (1976, г. Владимир; 1980, г. Казань; 1990, г.Владпмпр); из
Всесоюзной конференции (1981, г. Москва): на восьми научных конференциях
ВНИЯИ (1974-1988): на Всесоюзной научно-технической конференции (1990, г.
Нижний Новгород); на республиканской конференции (І990, г. Харьков); на
республиканской научно-практической конференции (1993, г. Харьков); на
международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром"(1991, г.
Владимир): на Всероссийской научно-практической конференции (1995, г.
Владимир).
-
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ. Получено 7 авторских свидетельств.
-
Объем к структура диссертации. Диссертация изложена на 429 страницах машинописного текста, включает введение (6 стр.), обзор литературы (49 стр.), материалы и методы (7 стр.), результаты исследований, выводы и практические предложения (271стр.). Список использованной литературы включает 253 работы на русском языке и 182 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 38 таблицами и 82 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.