Введение к работе
1.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЬ)
Производство первичных культур клеток (ГШК) и поддержание перевиваемых линий клеток (ПЖ) предполагает использование различных диспергирующих растворов, к качеству и методам контроля которых, предъявляют чрезвычайно высокие требования. Для диспергирования тканей животных используют, в основном, трипсин и реже другие протеазы импортного производства (В.А.Сергеев, Ю.А.Собко, 1990), а в последние годы и отечественные препараты трипсина по ТУ 10.07.194-91 и ТУ ОКП 921 328 1500 PGT Латвии.
В вирусологической практике применяется жидкая форма трипсина (0,2-0,25%-ный раствор), нестабильная при положительных температурах ( при + 18-20С срок хранения ке более 10 суток; при +4-6С - не более 2 месяцев; в замороженном состоянии - 6 месяцев), вследствие автолиза фермента при рН 7,0-11,0 (В.К.Антонов, 1933; К.Н.Веремеекко, 1971). Кроме того, метод фильтрования не гарантирует получения больших объёмов качественного препарата (Я.Л.Сперанская, 1979).
С учетом изложенного, более предпочтительным было бы применение сухой стерильной формы трипсина, растворяемой на месте применения. За рубежом ("Novolebs", США) разработаны коммерческие препараты сухого стерильного трипсина, обладающие стандартными и стабильными свойствами, удобные в применении и транспортировке. В нашей стране возможность получения аналогичного препарата, пригодного для диспергирования тканей животных, показана И.Д.Сперанской (1979). Однако, выполненная работа имеет фрагментарный характер и не завершена. В связи этим задача получения отечественного термостабильного и стандартного по активности препарата -сухой стерильной формы трипсина квалификации "для культур клеток"
_ о _ (С
является актуальной и экономически обоснованной, так как стоимость сухих стерильных форм питательных сред и растворов составляет 1/40 от стоимости производства и транспортировки жидких форм препаратов (Hayfllk et al., 1964).
Решение указанной задачи позволит существенно повысить сроки сохранения протеолитической активности препарата, эффективность диспергирования тканей животных и, в конечном итоге, стандартизовать производство культур клеток и вирусных препаратов. 1.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
Целью исследований была разработка способа изготовления и методов контроля сухой стерильной формы трипсина (ТСС) квалификации "для культур клеток" и апробация препарата в вирусологической практике.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
определить общие требования к качеству исходных образцов трипсина и неорганических солей, пригодных для изготовления сухой стерильной формы препарата;
разработать технологию изготовления и методы контроля ТСС;
изучить физико-химические и диспергирующие свойства ТСС в отношении различных видов тканей,а также возможность использования препарата для серийного пассирования перевиваемых линий клеток;
изучить чувствительность и пригодность культур клеток, полученных с использованием ТСС, для репродукции вирусов;
оценить экономическую целесообразность производства и применения "Трипсина сухого стерильного" квалификации "для культур клеток" в вирусологической практике;
определить условия и сроки хранения препарата;
разработать нормативно-техническую документацию на изго-
товление, контроль и применение ТСС.
Впервые получены научно-обоснованные данные, положенные б основу опытно-промышленного производства трипсина сухого стерильного (ТСС), отвечающего требованиям квалификации "для культур клеток".
Впервые для стерилизации трипсина предложены ускоренные электроны в дозе 25 кГр.
Определены тест-система, методы контроля и предельно-допустимые показатели качества препарата.
Доказаны пригодность препарата для получения широкого спектра первичных и серийного пассирования перевиваемых культур клеток и целесообразность дифференцированного выбора оптимальной концентрации ТСС при диспергировании тканей различного происхождения.
Установлена равноценная чувствительность культур клеток , полученных с использованием ТСС и коммерческого препарата трипсина, к РНК- и ДНК-содержащим вирусам. Показана пригодность и перспективность ТСС для получения противовирусных препаратов.
Изучены оптимальные условия и сроки хранения ТСС. Показана возможность использования метода пошаговой регрессии для прогнозирования длительности хранения препарата при различных температурах.
1.4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Для вирусологической практики предложен новый термостабильный, активный коммерческий препарат "Трипсин сухой стерильный для культур клеток".
Предложена культуральная модель - почка крольчонка месячного возраста для оценки диспергирующей активности ТСС и определены
- 4 -оптимальные условия дезагрегации ткани.
Показана целесообразность и необходимость замены коммерческого раствора трипсина на ТСС для получения первичных, пассирования перевиваемых культур клеток и изготовления противовирусных препаратов .
Экономически обосновано применение препарата ТСС в вирусологической практике.
Основные положения исследований доложены и получили положительную оценку на совещаниях "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992); IV-ом Путинском совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1994); Ученом совете ВГНКИ ветпрепаратов (Москва, 1992-1995); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 14.11.1995).
1.6. ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано и сдано в печать 8 статей. 1.7. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 5-ю рисунками. Библиографический список включает 215 наименований.