Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1. Генетический полиморфизм и способы его оценки 10
1.1. Генный (аллельный) полиморфизм 10
1.2. Картирование генов и повторяющихся последовательностей с использованием флуоресцентной гибридизации in situ 11
1.3. Хромосомный полиморфизм
1.3.1. Структурные изменения хромосомного набора 13
1.3.2. Добавочные В-хромосомы 15
1.3.3. Полиморфизм рисунков дифференциального окрашивания хромосом 16
1.4. Геномный полиморфизм 18
2. Полиморфизм льна посевного 20
2.1. Происхождение и классификация 20
2.2. Генетическое разнообразие льна посевного
2.2.1. Полиморфизм по морфологическим признакам 21
2.2.2. Полиморфизм по биохимическим признакам 22
2.2.3. Полиморфизм по молекулярным маркерам 22
2.2.4. Полиморфизм по хромосомным маркерам 24
3. Особенности анализа мелкохромосомных объектов 25
3.1. Актуальность увеличения разрешающей способности цитогенетических методов 25
3.2. Использование подходов, приводящих к увеличению длины метафазных хромосом 27
3.3. Химические особенности строения ДНК-интеркаляторов 28
3.4. Особенности применения наиболее распространенных в
цитогенетике интеркаляторов 29
ГЛАВА II. Материалы и методы 33
1. Материалы для исследования
2. Методы исследования 35
2.1. Проращивание семян 35
2.2. Предобработка корневой меристемы 35
2.3. Фиксация корневой меристемы 36
2.4. Приготовление хромосомных препаратов растений 36
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ с различными зондами 37
2.5.1. Предобработка хромосомных препаратов перед FISH 37
2.5.2. Флуоресцентная гибридизация in situ 37
2.5.2.1. Мечение зондов 37
2.5.2.1.1. Рибосомные гены 37
2.5.2.1.2. CesA гены 38
2.5.2.1.3. Теломерный повтор 38
2.5.2.2. Гибридизация in situ 39
2.5.2.2.1. Денатурация хромосомных препаратов 39
2.5.2.2.2. Денатурация зондов 39
2.5.2.3. Отмывка препаратов и детекция сайтов гибридизации 40
2.6. Окрашивание хромосом 41
2.7. Анализ хромосомных препаратов 41
2.8. Статистическая обработка результатов измерений линейных параметров хромосом 42
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 43
1. Усовершенствование методики приготовления хромосомных препаратов льна 43
1.1. Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2-абензимидазолов 43
1.2. Усовершенствование метода приготовления давленных хромосомных препаратов 50
1.3. Тестирование воспроизводимости результатов маркирования хромосом льна с помощью метода DAPI-бэндинга и FISH с зондами 5S и 26S рДНК 53
2. Полиморфизм генома льна посевного 57
2.1. Идентификация хромосом льна посевного по рисункам DAPI-бэндинга и локализации сайтов рибосомных генов 57
2.2. Хромосомный полиморфизм льна посевного
2.2.1. Внутривидовой хромосомный полиморфизм 60
2.2.2. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного
2.2.2.1. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по морфологии спутничной хромосомы 67
2.2.2.2. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по локализации генов рРНК на спутничной хромосоме 68
2.2.2.3. Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по локализации рибосомных генов на хромосомах 3, 8,13 71
3. Разработка дополнительных молекулярно-цитогенетических маркеров для хромосом льна 75
3.1. Локализация последовательности теломерного повтора (TTTAGGG) на хромосомах льна 79
3.2. Локализация консервативного фрагмента генов
целлюлозосинтетазы CesA на хромосомах льна 79
Заключение 85
Выводы 86
Список литературы
- Полиморфизм рисунков дифференциального окрашивания хромосом
- Предобработка корневой меристемы
- Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2-абензимидазолов
- Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по локализации генов рРНК на спутничной хромосоме
Полиморфизм рисунков дифференциального окрашивания хромосом
Как уже было отмечено ранее, существуют разные способы оценки генетического разнообразия систематических групп организмов, основанные на использовании различных морфологических, биохимических и молекулярных маркерах. В той или иной мере для изучения льна использовались различные типы маркеров, хотя полных комплексных подходов по изучению внутри и межсортового полиморфизма в нормальных условиях и стабильности сортов при воздействии стрессовых факторов не производилось.
Несмотря на то, что морфологические признаки носят качественный характер и зависят от условий окружающей среды, в некоторых случаях их оценка имеет большое значение и производится наравне с другими методами (Diederichsen, Hammer, 1995; Diederichsen, 2001; Diederichsen, Raney, 2006; Diederichsen, et al., 2006; Saeidi et al., 2008). У льна-долгунца для оценки сортовой принадлежности в первую очередь используют такие морфологические признаки, как форма соцветия, окраска и размер частей цветка и семян, форма лепестков, высота растения, техническая длина, диаметр стебля, количество ветвей I порядка, число коробочек на растении и др. (Методические указания по проведению полевых опытов со льном-долгунцом). Высота и общая масса растения, техническая длинна и масса технической части стебля, количество междоузлий, коробочек и семян - признаки, позволившие произвести оценку растений льна 22 долгунца при анализе способности роста льна на почвах с разным уровнем кислотности (Кишлян, 2011). Оценка полиморфизма сортов льна проводилась и на основе анализа изоферментов и по спектрам запасных белков зерна.
Так с помощью горизонтального электрофореза было выявлено высокое генетическое разнообразие по трем ферментативным системам (PGD, GPI и MDH), как между сортами различной селекционной направленности (долгунцы, масличные и ландрасы), так и внутри каждого образца (Mansby et al., 2000).
Что касается запасных белков, то у льна они представлены двумя типами: 2S альбуминами, или конлининами, которые кодируются двумя независимыми локусами Cnll и Cnl2 (Truksa et al., 2003), а также 1 IS глобулинами (Venglat et al., 2011). Сравнение спектров запасных белков зерна сортов отечественной (Кутузова и др., 1999; Лях и др., 2006) и зарубежной (Sammour, 1994) селекции, полученных с использованием разных методов экстракции белков и электрофореза, выявило лишь незначительные отличия между сортами.
Молекулярные исследования льна проводились неоднократно с целью выявления разнообразия внутри этого вида и для определения эволюционных взаимоотношений с дикорастущими видами (Campbell et al., 1995; Everaert et al., 2001; Fu, 2005; Vromans, 2006; Cloutier et al., 2009; Fu, Allaby, 2010).
Использование ДНК маркеров для оценки разнообразия льна впервые было описано в работе Ох с соавторами, (Oh et al., 2000). Они сравнили результаты, полученные с помощью RAPD- и RFLP-методов, и создали первоначальную геномную карту, основанную на этих результатах. В работах Фу с соавторами (Fu et al., 2002b) был использован RAPD-метод для изучения полиморфизма канадских образцов льна и ландрас, который выявил низкое генетическое разнообразие. Позднее те же авторы (Fu et al., 2003) применили RAPD для анализа генетического полиморфизма и родства сортов льна Северной Америки, а в 2006 году Дидерихсен и Фу (Diederichsen, Fu, 2006) провели исследование фенотипов и RAPD- анализ для выявления внутри- и межсортового полиморфизма. Эти работы, а также ряд других, выявили четкое разделение сортов льна на группы в зависимости от места их происхождения и произрастания, но в основном продемонстрировали низкий геномный полиморфизм внутри этих групп (Spielmeyer et al., 1998; Лемеш и др., 2001; Everaert et al., 2001; Vromans, 2006). Было обнаружено, что RAPD-маркеры дают возможность достоверно дифференцировать дикорастущие виды (Лемеш и др., 2001, 2005, 2006; Fu et al., 2003) и масличные сорта (Fu, 2005; Vromans, 2006; Гузенко и др., 2008), однако возникали трудности с идентификацией сортов льна-долгунца.
Метод ISSR для получения фингерпринтинга льна был усовершенствован Wiesner и Wiesnerova (Wiesner, Wiesnerova, 2004) с использованием метода ре-амплификации и с помощью статистического соотношения свободной энергии диссоциации ISSR праймеров. ISSR анализ льна производился неоднократно разными авторами, что помогло выявить некоторые дополнительные особенности геномов ряда масличных и долгунцовых сортов льна (Roose-Amsaleg, 2006; Cloutier et al., 2009; Uysel et al, 2010).
ДНК-маркеры, основанные на ретротранспозонах, были также использованы для изучения внутри- и межвидового разнообразия, оценки селекционного материала и сортовой идентификации льна. IRAP анализ показал более широкую геномную изменчивость стародавних сортов льна в сравнении с сортами современной селекции, причем самый высокий уровень полиморфизма (86,4%) был выявлен с помощью метода REMAP при сочетании праймеров F-Frodo-02 и P-F/ax-2, но возможности различить популяции льна были ниже, чем при использовании праймеров, полученных из Tstl ретротранспозонов (Ziarovska et al., 2009, 2012).
Значительный интерес представляет работа авторов (Smy kal et al. 2011), которые провели исследование встречающихся во всех растительных геномах ретротранспозонов, а также попытались оценить их значение в процессе дивергенции геномов видов льна. Наибольшее генетическое разнообразие обнаружено среди видов дикого льна Ыпит (100% IRAP полиморфизм и 0,57 сходство по Джакарту), тогда как разнообразие среди семян льна посевного снижалось от ландрас (58%, 0,63) к гибридам (48%, 0,85) и сортам (50%, 0,81). Но для IRAP фингерпринтинга подходят не все ретротранспозоны.
Предобработка корневой меристемы
На хромосомных препаратах L. grandiflorum, приготовленных из меристемы корешков проростков, предобработанных ледяной водой (контроль) либо ледяными водными растворами 9-АМА или одного из пиридо[1,2-а]бензимидазолов: 7-CF3-9-NH2-PBI, 7-CF3-PBI, 7-NH2-PBI были локализованы 26S и 5S рДНК-пробы с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и проведено DAPI-дифференциальное окрашивание хромосом (Рис. 3).
Установлено, что сайт 26S рДНК расположен вместе с 5S рДНК в области вторичной перетяжки ядрышкообразующей хромосомы 1. Другой сайт 5S рДНК локализуется в проксимальном районе длинного плеча хромосомы 3. Этот сайт был использован как молекулярно-цитогенетический маркер для быстрой и точной идентификации хромосомы 3 в хромосомных пластинках различной степени конденсации (Рис. 3).
Проведено морфометрическое измерение общей длины, длины короткого плеча и размеров прицентромерного DAPI-бэнда хромосомы 3, а также подсчитано число DAPI-бэндов. Результаты измерений представлены в таблице 2. Влияние обработки пиридо[1,2-а]бензимидазолами клеток корневой меристемы льна на длину хромосомы 3 в хромосомных препаратах оценивали не только в сравнении с контролем, но и также в сравнении с действием ранее изученного и широко используемого ДНК-интеркалятора 9-АМА. Таблица 2. Действие перидобензимидазолов и 9-аминоакридина на длину хромосомы 3 Linum grandiflorum.
Обозначения: W- длина хромосомы, S- длина короткого плеча хромосомы, Cht- длина прицентромерного гетерохроматинового блока, N-число хромосом в выборке, Wmax- максимальная длина, Wmin- минимальная длина, Х- среднее значение длины, SD- стандартное отклонение. В литературе обсуждаются основные структурные характеристики, которые придают ДНК-интеркалирующую активность химическим соединениям, и их особенности, способствующие этому эффекту (Brana et al., 1994; Weinkauf et al., 1994; Siro et al., 1998; Deady et al., 2000). Имеются сведения о том, что некоторые интеркалирующие агенты оказывают цитотоксическое действие, как на нормальные, так и на раковые клетки (Зеленин, 1971; Brana et al., 1994). Из этого следует, что при использовании интеркаляторов ДНК для целей повышения разрешения хромосомного анализа необходимо учитывать возможность их питотоксического действия.
При воздействии 9-АМА и всех исследованных PBI на клетки корневой меристемы льна средняя длина хромосомы 3 на хромосомных препаратах значительно увеличивается по сравнению с контролем (Таблица 2). При этом обработка делящихся клеток любым из PBI приводит к замедлению компактизации хромосом по сравнению с 9-АМА. Средняя длина хромосомы 3 достигает максимального значения на хромосомных препаратах, полученных после обработки 7-NH2-PBI: 224% по сравнению с контролем и 140% по сравнению с 9-АМА. Обработка клеток меристемы двумя другими агентами 9-NH2-7-CF3-PBI и 7-CF3-PBI приводит почти к одинаковому увеличению средней длины хромосомы 3 на препаратах: 184% и 192% соответственно по сравнению с контролем, и 115% и 120% соответственно по сравнению с 9-АМА. Распределение длин хромосом 3 на препаратах, полученных после обработки делящихся клеток 9-АМА и новыми
Обработка корневой меристемы 7-CF3-PBI меньше двух других PBI влияет на компактизацию прицентромерного гетерохроматического района. После воздействия на делящиеся клетки этим интеркалирующим агентом, также как после воздействия 9-АМА и в контроле, на хромосомных препаратах средние линейные размеры прицентромерного DAPI-бэнда относительно всей длины хромосомы 3 составляют около 10%. Вместе с тем, после обработки меристемы 9-NH2-7-CF3-PBI на препаратах в хромосоме 3 размеры этого бэнда составляют более 14%, а после воздействия 7-NH2-PBI - 13%. Следовательно, на хромосомных препаратах, полученных после обработки корневой меристемы 9-АМА или 7-CF3-PBI, размеры прицентромерных DAPI-бэндов изменяются пропорционально изменению длины хромосомы в целом. 9-АМА имеет простую химическую структуру, низкую константу связывания с ДНК и отсутствие АТ/ГЦ-специфичности (Lerman, 1963; Sakore, 1977). Видимо, поэтому его действие равномерно тормозит процесс сокращения эу- и гетерохроматических районов хромосом, не изменяя размеров прицентромерных гетерохроматических районов относительно общей длины хромосомы. Сходным образом действует и 7-CF3-PBI.
После воздействия на клетки меристемы 9-NH2-7-CF3-PBI или 7-NH2-PBI на хромосомных препаратах выявлено возрастание линейных размеров прицентромерного гетерохроматина относительно длины всей хромосомы. Вероятно, 9-NH2-7-CF3-PBI и 7-NH2-PBI имеют некоторую степень АТ-специфичности. Преимущественное связывание с АТ-богатой ДНК гетерохроматических районов может быть особенно полезно при выявлении в метафазных хромосомах с помощью дифференциального окрашивания мелких бэндов и особенно бэндов, размеры которых находятся на границе разрешения светового микроскопа. Возможно, именно по этой причине, обработка 9-NH2-7-CF3-PBI или 7-NH2-PBI позволяет на препаратах в хромосомах выявлять почти в 2 раза больше интеркалярных DAPI-бэндов, чем применение 7-CF3-PBI. Способность более эффективно тормозить конденсацию гетерохроматических районов хромосом может быть полезной при решении задач, связанных с определением последовательности расположения разных семейств тандемных повторов в гетерохроматических районах не только мелких, но и крупных хромосом растений, например, таких как теломерные районы хромосом ржи (Vershinin et al., 1995).
Повышение разрешающей способности хромосомного анализа с помощью пиридо[1,2-абензимидазолов
Ранее у L. usitatissimum была выявлена одна пара хромосом, несущая функционально активный ЯОР (Scweizer, 1980). Предполагалось, что последовательности 26S рДНК расположены на одной хромосоме льна, a 5S рДНК - на нескольких хромосомах (Schneeberger et al. 1989). Позже с помощью методов RFLP- и RAPD - анализа было установлено совместное расположение рибосомной ДНК (26S рДНК) и 5S рДНК, на одной хромосоме льна посевного (Oh et al., 2000). В дальнейшем, только с помощью FISH-анализа было установлено, что у льна посевного гены 5S и 26S рРНК ко-локализованы на спутничной хромосоме 1 , а три отдельных сайта 5S рДНК на хромосомах 3, 8 и 13 (Муравенко и др., 2004). На льне посевном и родственных ему видах основной сайт 26S рДНК нами был картирован с помощью метода FISH как в Ag-позитивном районе вторичной перетяжки спутничной хромосомы, так и в прилегающих участках хромосом или спутника.
Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по локализации рибосомных генов на хромосомах 3, 8,13
В нашей работе также было подтверждено наличие на хромосомах 3, 8 и 13 одиночных сигналов генов 5S рРНК разного уровня интенсивности. Однако в ряде случаев на этих трех парах хромосом отмечалась ко-локализация сигналов 5S рДНК с минорными сайтами 26S рДНК. Было отмечено, что сигналы 26S рибосомных генов по яркости значительно уступают сигналам 5S рДНК. Частота встречаемости ко-локализации на хромосомах, несущих сигналы, всех изученных образцов льна представлена в таблице 3.
Как видно из приведенной таблицы, ко-локализация 26S и 5S рибосомных генов чаще обнаруживается на третьей паре хромосом и реже - на других двух парах или на 3, 8 и 13 хромосомах вместе. Кроме того, полиморфными по наличию ко-локализации могут оказаться хромосомы не только внутри одного сорта, но даже внутри одного растения. Таблица 3. Частота встречаемости ко-локализации генов 26S и 5S рДНК на хромосомах льна посевного
Кроме того, обнаружены различия по размерам гетерохроматических участков хромосом, локализации 26S и 5S рДНК. У ряда сортов впервые выявлен гетероморфизм гомологов пары спутничных хромосом. При этом, сходные типы полиморфных хромосом можно найти как у разных сортов льна, так и в пределах одного сорта.
Ранее для нескольких других сортов и форм L. usitatissimum были описаны рисунки распределения на хромосомах сайтов рибосомных генов и DAPI-бэндов и отмечено наличие полиморфизма по этим хромосомным маркерам (Муравенко и др., 2003, Muravenko et al., 2009), но сравнительного изучения внутри- и межсортового хромосомного полиморфизма проведено не было. Усовершенствование методических подходов по приготовлению хромосомных препаратов мелких хромосом льна посевного позволило нам провести такое уникальное исследование. В результате изучения кариотипов 18 сортов и одной гибридной формы выявлен невысокий уровень внутривидового хромосомного полиморфизма по молекулярно-цитогенетическим маркерам. Вместе с тем, обнаружено наличие у этого вида относительно высокого внутрисортового полиморфизма по молекулярно-цитогенетическим маркерам хромосом по сравнению с межсортовым.
Невысокий уровень внутривидового геномного полиморфизма льна посевного выявлен и с помощью других генетических маркеров (Fu et al., 2003, Diederichsen, Fu, 2006, Гузенко и др., 2008). Ранее, при оценке географического разнообразия льна с помощью SSR-анализа выделено 4 группы сортов, различающихся между собой: из Индии, Африки, Западной и Центральной Азии. Сорта из стран Западной и Восточной Европы, России, Северной и Центральной Америки по геномному полиморфизму достоверно не различались и, как полагает автор, были близкородственными (Fu, 2005). Именно к этой группе можно отнести все изученные нами сорта льна, что, видимо, и объясняет невысокий уровень межсортового хромосомного полиморфизма.
По С-гетерохроматическим районам хромосом ранее были выявлены некоторые различия между масличными и долгунцовыми сортами (Муравенко и др., 2000, 2007). Микросателлитный анализ также позволил идентифицировать индивидуальные сорта долгунцовой и масличной селекционной направленности (Roose-Amsaleg et al., 2006). Вместе с тем, RAPD-анализ геномов долгунцовых и масличных сортов льна посевного не показал их четкой кластеризации (Fu и др., 2003). Однако позднее RAPD-анализ обнаружил, что у сортов льна-долгунца доля закрепленных рецессивных локусов в среднем была в два раза выше (40,9%), чем у сортов льна масличного типа (21,1%) (Лемеш, 2007; Гузенко и др., 2008). Показано, что сорта льна-долгунца весьма сходны по генетическим маркерам и составляют гомогенную группу, в то время как масличный лен образует несколько групп и отличается более выраженным генетическим разнообразием (Vromans, 2006; Lemesh, 2009). Кластерный анализ, проведенный на основании анализа геномов AFLP-методом показал, что льны-долгунцы более ранней селекции по дендрограмме ближе к масличным, чем сорта более поздней селекции, и это позволило предположить, что долгунцовые сорта произошли от масличных (Vromans, 2006). В данной работе сравнительное исследование рисунков DAPI-дифференциального окрашивания хромосом и локализации рибосомных генов не выявило значительных отличий между группами сортов различной селекционной направленности.
Внутрисортовой полиморфизм льна посевного по локализации генов рРНК на спутничной хромосоме
Для выявления новых молекулярных маркеров, специфичных к хромосомам льна посевного, мы использовали подход, который заключается в локализации на хромосомах методом FISH уникальных или малокопийных генов или семейств генов. До настоящего времени на хромосомах L. usitatissimum не было картировано других генов и, в том числе, мультикопийных, кроме рибосомных. Известно, что локализация последовательностей различных генов на хромосомах с использованием FISH-метода не только позволяет осуществлять физическое картирование хромосом, но и достоверно идентифицировать хромосомы, хромосомные плечи и устанавливать соответствие цитологической классификации и генетической номенклатуры хромосом. Гены «домашнего хозяйства» клетки, обеспечивающие ее жизнедеятельность, достаточно консервативны у разных видов. Сохранение консервативной кодирующей последовательности гена в процессе эволюции практически без изменений, позволяет использовать его в качестве зонда для локализации этого гена на хромосомах других видов, родов или семейств. К таким генам у растений можно отнести гены целлюлозосинтетазы (CesA).
Мультигенное семейство CesA генов у растений кодирует фермент гликозилтрансферазу, играющую основную роль в процессе синтеза целлюлозы (Brown et al., 1997; Kawagoe, Delmer, 1997; Delmer, 1999). Например, у хлопчатника было отмечено увеличение экспрессии генов GhCesA-І и GhCesA-2 при стократном увеличении скорости синтеза целлюлозы in vivo (Pear et al., 1996). Также было показано, что мутации в гене AtCesA-І у арабидопсиса приводят к значительному снижению накопления целлюлозы в клетках молодых растений (Arioli et al., 1998), а мутации в гене AtCesA-7 приводят к разрушению сосудов ксилемы и снижению содержания целлюлозы в побегах растений (Turner, Somerville, 1997; Taylor et al., 1999). Кроме того, поликлональные антитела к центральному домену белка CesA у хлопчатника взаимодействуют с некоторыми структурами плазмолеммы, которые, предположительно, представляют собой целлюлозосинтетазные комплексы (Kimura et al., 1999). Высокий уровень экспрессии генов целлюлозосинтетазы CesA в активно растущих частях растений льна свидетельствует о том, что гены этого семейства являются особенно важными для такой лубяной культуры, как L. usitatissimum (Горшкова и др., 2003). Совсем недавно были выявлены 16 предсказанных CesA генов и их классификация приведена в соответствие с хорошо охарактеризованными CesA генами арабидопсиса и тополя (Mokshina et al., 2014).
Для формирования функционально активного целлюлозосинтетазного комплекса необходимо участие, по меньшей мере, трех различных белков целлюлозосинтетазы. Все белки CesA имеют сходную доменную структуру и обладают двумя N-терминальными и шестью С-терминальными доменами. В N-терминальной области располагается первая гипервариабельная область HVRI, вторая гипервариабельная область HVRII ограничена двумя консервативными доменами А и В и является классоспецифичной областью (Doplin et al., 2002).
На основании сравнения шести нуклеотидных последовательностей EST субъединиц CesA льна, зарегистрированных в GenBank (EF409998 - EF410000, EF214742 - EF214744) были сконструированы праймеры, амплифицирующие фрагмент кДНК субъединицы CesA-б размером 301 п.н. (Грушецкая и др., 2010), депонированный в GeneBank под номером KFO 11584.1 (Grushetskaya, Lemesh, 2013). Сравнение нуклеотиднои последовательности амплифицированного фрагмента CesA-б гена с известными последовательностями CesA генов арабидопсиса, тополя и эвкалипта (Liang, Joshi, 2004; Ranik, Myburg, 2005, Richmond, 2000) показало, что полученный ПЦР-фрагмент локализован в области консервативного домена В CesA генов (Грушецкая и др., 2010). Вследствие того, что различные гены семейства CesA содержат эту консервативную последовательность домена В (Грушецкая и др., 2010), то ее использование в качестве зонда для FISH открывает возможность выявить локализации на хромосомах семейства CesA генов. С этой целью консервативная последовательность KF011584.1 нами была вставлена в плазмиду pGEM Easy Vector (Promega) и клонирована в Esherichia coli, а затем использована в качестве зонда для гибридизации.
В результате исследования метафазных пластинок всех изученных сортов на хромосомах было выявлено 4 сигнала гибридизации зонда консервативного В домена гена CesA-б. Обнаружено, что основные сайты гибридизации локализуются в проксимальных районах длинных плеч двух пар хромосом 3 и 9 L. usitatissimum (Рис. 16). На хромосоме 3 гибридизационные сигналы располагались на длинном плече в районе 3L1.2, между центромерой и сайтом генов 5S рРНК. На хромосоме 9 гибридизационный сигнал наблюдали в проксимальном районе 9L1.2 длинного плеча. Сравнительное исследование локализации сигналов гибридизации нуклеотиднои последовательности KF011584.1 в кариотипах долгунцовых и масличных сортов, а также у межеумка и кряжей различий не обнаружило (Рис. 17).
С помощью генетического картирования выявлено наличие генов CesA на пяти парах хромосом у ячменя, на трех парах хромосом у арабидопсиса и на пяти парах хромосом у кукурузы (Burtonetal., 2004; Holland et al., 2000). При этом, CesA гены могут располагаться в одном (кукуруза, Holland et al., 2000) или обоих плечах хромосом (ячмень, Burton 2004). Ранее установлено, что близкородственные CesA гены часто расположены на разных хромосомах, а гены семейства целлюлозосинтетаз с различной нуклеотидной последовательностью, например в 3-UTRs, могут быть локализованы совместно (Holland et al., 2000).
Рис. 17. Хромосомные пластинки сортов Славный (А), Велижский кряж (Б), ЛМ-98 (В), с локализацией генов CesA на хромосомах (зеленый) и 5S рДНК (красный); хромосомы окрашены DAPI (синий). Стрелками обозначены хромосомы 9 пары, головками стрелок — хромосомы 3 пары. Ваг=5 мкм.
Учитывая разрешающую способность FISH, размер зонда, а также высокую степень гомологии этого района в разных CesA генах, можно предположить, что каждый гибридизационный сигнал выявляет расположение как минимум около десяти одинаковых или различных CesA генов. Обнаруженная нами локализация генов из семейства целлюлосинтаз в виде двух основных кластеров на хромосомах у L. usitatissimum может быть особенностью, характерной для этой лубяной культуры. При этом, оба кластера генов могут включать гены, ответственные за синтез как первичной, так и вторичной клеточной стенки. Возможно, что подобное расположение является проявлением исходной полиплоидной природы генома льна посевного (Wangetal., 2012).
Не исключено, что имеются минорные сайты или одиночные локусы CesA генов, которые не выявляются использованным методом. Так, по одной копии нуклеотидной последовательности KF011584.1 обнаружено в двух достаточно протяженных (16-23 т.п.н.) контигах ДНК, полученных в ходе выполнения проекта полногеномного секвенирования сорта льна CDS Betune TUFGEN (Total Utilization Flax GENomics) и депонированных в базе данных NCBI под номерами AFSQ01001622.1, AFSQ01024179.1.
Тем не менее, наличие основных сайтов локализации нуклеотидной последовательности KF011584.1 на двух парах хромосом у всех исследованных сортов льна демонстрирует возможность их использования в качестве дополнительных константных молекулярных маркеров хромосом 3 и 9 льна посевного.
