Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Общая характеристика рода Rotavirus 12
1.1.1 Морфология ротавирусного вириона 17
1.1.2 Жизненный цикл и патогенные свойства ротавирусов 20
1.2 Особенности организации ротавирусного генома 35
1.2.1 Структура генома ротавирусов .36
1.2.2 Особенности экспрессии генов ротавирусов .38
1.2.3 Генетическая изменчивость ротавирусов .40
1.2.4 Механизмы изменчивости ротавирусов
1.3 Эпидемиология и вакцинопрофилактика ротавирусных заболеваний 48
1.4 Методы исследований генетического рпазнообразия ротавирусов
1.4.1 Эмпипрические методы.. 59
1.4.2 Аналитические методы 66
1.5 Заключение к обзору литературы 71
Глава 2. Материалы и методы исследования. 74
2.1 Материалы 74
2.1.1 Лабораторная коллекция первично-охарактеризованных, материалов диких ротавирусных штаммов 74
2.1.2 Реактивы 74
2.1.3 Данные из внешних источников.. 75
2.2 Методы .76
2.2.1 Анализ нуклеотидных последовательностей 76
2.2.2 Конструирование специфических праймеров и зондов 77
2.2.3 Пробопоготовка (приготовление копроэкстрактов, выделение вирусных РНК).. 81
2.2.4 Реакция обратной транскрипции (ОТ) 83
2.2.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 83
2.2.6 Моноспецифическая ПЦР в режиме реального времени (ПЦР – РВ) 84
2.2.7 Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией (МП – ПЦР – РВ) .86
2.2.8 Подготовка продуктов ПЦР в препаративных количествах 86
2.2.9 Электрофоретический анализ ДНК
2.2.10 Секвенирование элементов генома ротавирусов .89
2.2.11 Исследование эмпирически полученных данных аналитическими методами .89
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Оценка эпидемиологической ситуации по ротавирусной инфекции в Московском регионе 93
3.2 Формирование коллекции вируссодержащих материалов .98
3.3 Отработка методической базы и критериев генотипирования ротавирусов на основе вариантов метода ПЦР .100
3.3.1 Выбор критериев, наиболее полно отражающих генетические характеристики штаммов ротавирусов 100
3.3.2 Определение специфических локусов, подбор праймеров и зондов для дифференциального выявления аллелей генов ротавирусов методом ПЦР 101
3.3.3 Конструирование праймеров и ДНК зондов системы генотипирования .107
3.4 Оптимизация методов и условий натурных, генетических исследований ротавирусов вариантами ПЦР и секвенированием 111
3.4.1 Оптимизация выделения ротавирусной РНК 111
3.4.2 Оптимизация условий обратной транскрипции .112
3.4.3 Оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ (МП–ПЦР–РВ) для
одновременного выявления нескольких вариантов генов ротавирусов .114
3.4.4 Оптимизация получения и анализа нуклеотидных последовательностей геномов диких штаммов ротавирусов 121
3.5 Разработка внутренних, лабораторных контролей и эталонов .125
3.6 Определение генетической структуры ротавирусов группы А Московского региона 2009-2014г.г 133
Глава 4 Обсуждение результатов исследования .140
Заключение .154
Выводы 158
Список сокращений 159
Список литературы
- Морфология ротавирусного вириона
- Лабораторная коллекция первично-охарактеризованных, материалов диких ротавирусных штаммов
- Формирование коллекции вируссодержащих материалов
- Оптимизация методов и условий натурных, генетических исследований ротавирусов вариантами ПЦР и секвенированием
Морфология ротавирусного вириона
Белок VP3 является частью ядра вириона и представляет фермент гуанилилтрансферазу, который катализирует посттрансляционную модификацию мРНК (образование 5 - «кэпа») [63]. Эта модификация служит для стабилизации вирусной мРНК защищая её от деградации рибонуклеазами. Также он играет важную роль в процессах упаковки вирусной РНК и сборки капсида. Подтверждением этого является тот факт, что наличие мутации в этом белке (G527 D) не влияет на его функцию, но приводит к образованию «пустых» вирионов [113, 147, 124, 151].
Белок VP4 образует «шипы» на поверхности вириона и служит для прикрепления к рецепторам чувствительных клеток, играет главную роль в проникновении вируса в клетку, определяет диапазон «хозяев» и вирулетность штамма. VP4 несет вируснейтрализующие антигенные детерминанты и участвует в формировании адаптивного иммунитета. По антигенным свойствам белка VP4 ротавирусы классифицируют на серотипы по критерию P. Для проявления вирулентности необходимо взаимодействие с трипсином, который расщепляет VP4 на два белка VP5 и VP 8 , при этом значительно возрастает инфекционность.
Белок VP5 формирует тело и нижнюю часть «шипа». Он обуславливает высвобождение вирусной частицы из эндосомальных образований в цитоплазму клетки.
Белок VP6 образует среднюю часть белковой оболочки вириона. Несет антигенные эпитопы, которые позволяют дифференцировать ротавирусы на серогруппы по взаимодействию со специфическими моноклональными антителами. VP6 птичьих ротавирусов имеет существенные отличия от ротавирусов млекопитающих. Противовирусные антитела активно вырабатываются против VP6. Поэтому, в качестве антигена для ИФА часто используется рекомбинантный VP6.
Белок VP7 совместно с VP4 образует внешний слой капсида вириона и активно участвует в процессах проникновения в клетку. В процессе проникновения в клетку VP7 необходимо избавиться от свободных ионов Ca2+, при этом его тримерные блоки диссоциируют, что запускает конформационные изменения VP4, необходимые для инфицирования клетки. VP7 также как и VP4, имеет сайты связывания с вируснейтрализующими антителами. Fab-фрагменты нейтрализующих антител блокируют диссоциацию тримеров VP7, тем самым предотвращая изменения VP4 и инфекционность вируса. По антигенным свойствам белка VP7 ротавирусы классифицируют на 16 G-серотипов. Белок VP8 находится на вершине шипа, является вирусным гемагглютинином и главной мишенью для вируснейтрализующих антител, обеспечивает взаимодействие вириона с поверхностными рецепторами клетки [49].
Неструктурные белки по определению отсутствуют в составе вириона. Они образуются во время вирусной репродукции в зараженной клетке и обеспечивают репликацию вирусной РНК, синтез белков.
Белок NSP1 играет важную роль в репликации вируса. Основные функции – это блокирование апоптоза и механизмов врожденной иммунной защиты клеток. При вирусной инфекции в клетках вырабатывается интерферон-регулирующий фактор 3 (IFN3), который дает сигнал для синтеза интерферонов I типа ( и ). Выработанные интерфероны индуцируют синтез вируснейтрализующих белков в окружающих клетках, тем самым ограничивая распространение вируса. Для предотвращения противовирусного ответа NSP1 деградирует интерферон-регулирующие факторы [95]. Кроме защиты репликации вируса от иммунной системы необходимо поддерживать клетку в живом состоянии. Одним из клеточных механизмов защиты организма, для ограничения распространения вирусов является апоптоз. NSP1 активирует PI3K (фосфотидилинозитол-3 киназа) и NF-kB (фактор ядра kB), тем самым блокируя клеточные механизмы апоптоза.
Белок NSP2 участвует в репликации генома вируса и упаковке капсида. Играет решающую роль, совместно с NSP5, в формировании вироплазм, которые представляют собой большие включения в цитоплазме, в которых происходит репликация РНК и сборка промежуточных продуктов репликации. Проявляет свойства НТФазы, РНК-трифосфатазы, обладает АТФ-независимой хеликазной активностью, которая может подготавливать и организовывать цепь РНК для репликации и упаковки путем удаления интерферирующих вторичных структур. В отличие от типичных хеликаз, NSP2 необходим бивалентный катион или другой источник энергии для дестабилизации спирали [89].
Белок NSP3 участвует в ингибировании синтеза белков хозяина. Его функция и конкурирует и аналогична клеточному поли(А)-связывающему белку PABPC1. Взаимодействуя с эукариотическим фактором инициации трансляции elF4G в том же месте, который использует PABPC1, NSP3 заменяет его, ингибируя трансляцию клеточных поли (А)-мРНК [89].
Белок NSP4 является энтеротоксином и участвует в морфогенезе вириона. Функционирует как рецептор для незрелой двухслойной вирусной частицы при почковании в просвет эндоплазматического ретикулума. NSP4 вызывает С-зависимое фосфолипазное увеличение концентрации кальция в клетках слизистой оболочки кишечника. Это ведет к нарушению цитоскелета и увеличивает внеклеточную проницаемость. При этом увеличивается секреция хлорид-ионов по кальций-ионзависимому пути, что проявляется в виде диареи. Также возможно, что NSP4 выходит из энтероцитов в растворимой форме в просвет кишечника и взаимодействует с соседними эпителиальными клетками [48]. Индуцирует митохондриальный путь апоптоза клетки [62, 122].
Белок NSP5 участвует в репликации вирусного генома. Проявляет АТФазную и аутокиназную активность [166].
Природа патогенности ротавирусов, транскрипция и репликация их геномов, морфогенез, взаимодействие вириона и клетки в значительной мере определены их структурой и морфологией, биохимическими и структурными свойствами ротавирусных частиц. Экспрессией генов и коэкспрессией специфических структурных белков была показана спонтанная самоорганизация вирусоподобных частиц и функциональных комплексов [73, 85, 88, 147, 219, 220].
Трехмерная структура вириона
Методами крио-электронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии, было определено взаимное расположение структурных белков и атомные структуры нескольких структурных и неструктурных белков ротавируса [91, 158, 185]. Зрелый ротавирусный вирион представляет собой многослойный капсид образованный шестью структурными белками и геномной РНК в центральной его части (рисунок 3 a, b, c) [185]. Ядро вириона состоит из структур звездообразной формы, c пятью вершинами, (рисунок 3a красный) образованных белками VP1 и VP3 «транскрипционного комплекса» и окруженных слоем Р Н К ( рисунок 3a желтый). С внешней стороны объединение комплексов РНК и VP1 – VP3, закрыто слоем белка VP2 состоящим из 60 димеров (рисунок 3 b, c зеленый). На рисунке 3b показаны субъединицы VP2, темно-красным и фиолетовым цветами, указаны их ориентация и связи друг с другом.
Лабораторная коллекция первично-охарактеризованных, материалов диких ротавирусных штаммов
Наиболее часто ротавирусами заражаются дети раннего возраста, при этом ведущими симптомами ротавирусной инфекции являются интоксикация, диарея и рвота, сопровождающиеся болями в животе [88, 105].
Типичные клинические проявления ротавирусной инфекции. Инкубационный период длится от 15 ч до 7 дней (чаще 1-2 дня). Начало заболевания острое, для него характерны симптомы: диарея, лихорадка, рвота. Чаще рвота предшествует диарее или появляется одновременно с ней, являясь ведущим признаком ротавирусной инфекции. Продолжительность рвоты — 1— 3 дня, часто носит повторный, реже — многократный характер. Диарея протекает по типу гастроэнтерита или энтерита и характеризуется острым началом; повышением температуры тела до субфебрильных значений, сохраняющейся в течение 1–2 дней, кашицеобразным но чаще водянистым стулом, желтого цвета без патологических примесей. Частота стула во многом зависит от тяжести течения болезни, обычно составляет 2–5 раз в сутки при легкой форме, при тяжелой частота стула достигает 20 раз/сут, и более. Обычно диарейный синдром имеет продолжительнось 3– 6 дней. При ротавирусной инфекции кишечная дисфункция может сопровождаться болями в начальном периоде. При пальпации живота выявляется его вздутие и урчание. Повышение температуры тела, отмечается с самого начала заболевания, не превышает 39С и сохраняется в течение 2– 4 дней, на протяжении которых у больных отмечаются слабость, снижение аппетита (вплоть до анорексии), у д ет ей вя л ость и в некоторых случаях — адинамичность [8, 9].
Своевременно начатое лечение позволяет сократить продолжительность водянистого стула до 2–3 дней. Уменьшение количества жидкости в испражнениях, появление каловых комков свидетельствует о реконвалесценции, ремиссия обычно наступает к 8–10-му дню болезни [8, 9].
О действии механизмов, при которых отмечается четкая возрастная зависимость данного заболевания, существует несколько гипотез. Возникновение диареи при ротавирусной инфекции у детей может быть связано: 1. с патологическими изменениями в микроворсинках тонкого кишечника и одновременным снижением абсорбции жидкости на фоне неразвитой функции всасывания толстого кишечника у маленьких детей; 2. со специфической осмотической проходимостью слизистой оболочки у детей раннего возраста; 3. с возрастными особенностями секреции электролитов и жидкости. Четко установлено, что в эпителиальных клетках существуют сложные скоординированные механизмы взаимодействия ионных насосов, мембранных каналов и белков переносчиков, в результате комбинированного влияния которых возникает электрический потенциал клетки.
Экспериментальные данные показывают, что поляризованные монослои культуральных эпителиоцитов не в состоянии давать цитолиз при заражении ротавирусами, в отличие от неполяризованных. Наличие осмотического и клеточно-опосредованного секреторного компонентов ротавирусной диареи выдвигает на первый план два клеточных механизма, активных при ротавирусной инфекции: ротавирусная диарея инициируется вирусным воздействием (передачей сигнала) в пределах организма «хозяина» для запуска механизма «выживания» вируса (репродукция и распространение); ротавирусная диарея является следствием ответа защитных систем макроорганизма и представляет собой активацию эндогенных механизмов, элиминирующих ротавирус [60]. Воспалительные процессы. Одним из главных механизмов развития диареи, являются изменения в сосудистом русле и развитие апикальной ишемии ворсинки. Важную роль в развитии диареи в результате ишемии, естественно, играют вазоактивные вещества (особенно простогландины). Установлено, что применение нестероидных противовоспалительных средств, способствует сокращению продолжительности диареи. Также определено, что одним из главных регуляторных факторов при развитии диареи является вазоактивный кишечный пептид (VIP), вырабатываемый эндокринной системой кишечника. VIP уменьшает абсорбцию в слизистой оболочке, что играет важную роль и при других патологических состояниях (в том числе при реакции гиперчувствительности). Возникает реактивное воспаление и нарушение гидробаланса слизистой оболочки. Этот врожденный механизм защиты характерен и при ротавирусной инфекции, что свидетельствует о «стереотипии местных рефлексов». В связи с чем, возможно, развитие второй энтеронейрогенной стадии диареи без развития выраженного воспалительного процесса в слизистой оболочке [90, 193].
Как показано множеством групп исследователей, ротавирусная инфекция является причиной высвобождения внутриклеточного кальция и развития синдрома цитолиза. Однако, в отличие от влияния бактериальных токсинов на мобилизацию кальция с последующим развитием выраженного воспалительного ответа, при ротавирусной инфекции такого не происходит. Причем, в экспериментах на мышах, обнаружено, что воспалительный ответ в слизистой оболочке кишечника ограничен мононуклеарной инфильтрацией lamina propria (субэпителиальный слой соединительной ткани), а при гистологическом исследовании обнаруживается вакуолизация цитоплазмы клеток в небольшом проценте случаев. Учитывая, что эксперименты проводились на разных животных моделях, их результаты также несколько разнятся [54, 94, 122, 167, 169].
Не менее важным остается вопрос о возможности развития воспалительных процессов при внекишечной локализации ротавируса – на слизистых оболочках верхних дыхательных путей [142]. Все попытки с помощью электронного микроскопа обнаружить ротавирусы в носоглоточных смывах закончились неудачей. Некоторые авторы предполагают занос ротавирусов на слизистую оболочку верхних дыхательных путей во время еды. Но в то же время нельзя исключить и возможность развития внекишечной ротавирусной инфекции у детей с измененной реактивностью [105, 112].
В некоторых клинических наблюдениях обнаружена внекишечная локализация ротавируса: печень, почки, сердце, головной мозг [132, 152]. Описаны случаи летальных исходов при внекишечной локализации с развитием патологического процесса в сердце, печени, почках. Имеются работы об этиологической роли ротавируса в развитии вирусных энцефалитов (когда ротавирус определялся в ликворе), и энцефаломиелитов. Доказана ассоциативная связь между ротавирусной инфекцией и риском возникновения сахарного диабета 1 типа. [9, 50, 65, 78, 79, 112]. Механизм распространения ротавирусов по организму хозяина до конца не ясен, но имеются отдельные наблюдения, показывающие, что один из возможных механизмов вирусемии может реализовываться через клетки лимфатической системы. Установлено, что NSP3 является одним из основных детерминирующих белков в этом процессе. Возможность генерализации инфекции диктует необходимость поиска основных механизмов, ведущих к распространению ротавирусов по организму «хозяина», предотвращению развития этого процесса, что может осуществиться с добавлением в стандарты лечения специфической противоротавирусной терапии [47, 170].
Таким образом, воспалительные изменения в слизистой оболочке кишечника не играют первостепенной роли в развитии диареи, т.к. диарея возникает уже при низких уровнях вирусной нагрузки до развития цитопатологических изменений. В моделях на животных превентивное лечение цитопротективными факторами предотвращает гистологические изменения и приводит к невозможности развития диареи.
Способность ротавирусов проявлять тропность к клеткам различных органов и тканей и вызывать нетипичные для этого возбудителя, формы заболеваний свидетельствует об их высоком генетическом потенциале и широком спектре адаптивных реакций [132]. Учитывая сходство характерных симптомов, патоморфологических изменений, эпидемиологических особенностей и генетическую изменчивость, присущих диарейным заболеваниям вирусной природы, корректная, дифференциальная диагностика является одним из ключевых элементов эффективной терапии и профилактики ротавирусных заболеваний.
Формирование коллекции вируссодержащих материалов
Для сравнительного анализа и оценки эпидемиологической ситуации в регионе были использованы данные эпидемиологического надзора за РВИ представленные в документах государственного статистического учета заболеваемости в РФ за 2009-2013 гг. «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» (форма №2).
Для работ в автономном режиме с использованием прикладных компьютерных программ при планировании экспериментальной части исследований и интерпретации результатов создавались собственные, проблемно-ориентированные и интегрированные информационные базы данных на основе информации, представленной в публикациях и общедоступных, международных базах данных, таких как: – GenBank NCBI – (National Center for Biotechnological Information). - Национальный центр биотехнологической информации США; –EMBL – (European Molecular Biology Laboratory, EMBL) - Европейская молекулярно-биологическая лаборатория; – DDBJ – (DNA Data Bank of Japan) - База данных ДНК Японии; – VCD – (Virus Sequence Database) - База данных последовательностей вирусных геномов Республики Корея. Для работ с внешними базами данных, при аналитической обработке собственных результатов, были использованы программные и вычислительные мощности свободного доступа, любезно предоставляемые через сеть интернет перечисленными организациями входящими в INSDC (International Nucleotide Sequence Database Collaboration — международная система баз данных ДНК). Также были использованы специализированные базы знаний и программные инструменты, доступные на сайте «Международной рабочей группы по таксономии ротавирусов» (англ. RCWG - Rotavirus Classification Working Group) Лёвенского университета Бельгия, «RotaC automated genotyping tool for Group A rotaviruses» (сайт доступа: http://rotac.regatools.be).
Поиск диагностически ценных локусов проводился на основе выборки из более чем 1600 доступных нуклеотидных последовательностей геномов ротавирусов, из различных информационных источников в последовательности: – кластеризация подмножеств геномных последовательностей ротавирусных РНК осуществлялась по критерию преимущественной гомологии определяемых групп; – выбор сайтов посадки праймеров и зондов проводился анализом вариабельности и консервативности участков первичных консенсусных последовательностей таксономических групп ротавирусов, методом двумерной дискретизации с постоянными значениями интервалов по вертикали (равномерная дискретизация по шкале вариабельности) и переменным шагом по горизонтали (вдоль последовательности нуклеотидов) [24]; при выборе типоспецифических локусов учитывались последовательности праймеров и их мишеней для типоспецифической мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией, представленные в рекомендациях ВОЗ по генетической характеристике ротавирусов [154].
Ранжирование участков последовательностей РНК проводили по соответствию критериям: – принадлежность геномной РНК ротавирусов группе А. - принадлежность геномной РНК соответствующему генотипу (серотипу) ротавирусов группы А. Диагностически ценные таксон-специфические локусы, выбранные в качестве мишеней для праймеров и зондов, должны соответствовать требованиям: - содержать потенциальный участок связывания размером 20-32 н.п. и иметь прилегающие области обеспечивающие возможность маневра при проектировании праймеров и зондов. - оптимальными считаются локусы, значения вариабельности которых на всем протяжении не превышают 3 н.п. в границах участков связывания: - соотношение GC пар к AT анализируемого участка должно обеспечивать близкие (± 2,5С от средней для пары или группы праймеров) значения температуры плавления. Решение о выборе локусов нуклеотидных последовательностей в качестве целевых, осуществлялось на основе результатов анализа методом «ветвей и границ» (алгоритм Литтла или «исключения подциклов»), по суммарной согласованности собственных расчетов первичных геномных последовательностей определяемых таксонов и определяемых с помощью онлайн-программы «RotaC», а также с учетом данных рекомендованных международной рабочей группой по таксономии ротавирусов (RCWG).
Проектирование пар праймеров и зондов, детектирующих группу А ротавирусов и специфичных вариантам генов, выполнялось с учетом следующих требований (правил). 1. Высокая гомологичность локусам сегментов генома ротавирусов, отвечающим условиям уникальности по критериям «вид» и «вариант гена», а также минимальной гомологии с вероятными контаминантами. В качестве вероятных контаминантов учитывались нуклеотидные последовательности геномов человека, кишечной микробиоты, возбудителей заболеваний, дающих сходную с ротавирусной инфекцией клиническую картину, а также типичные пищевые продукты, употребляемые населением обследуемого региона. Определение отсутствия близких гомологов в последовательностях известных геномов других таксонов и таксономических групп (проводилось в программе Nucleotide BLAST ресурса NCBI). 2. Оптимальный размер праймеров должен быть в пределах 20-24 н.п., зондов -20-30 н.п. 3. Праймеры и зонды не должны образовывать стабильных шпилечных структур с высокой температурой плавления (Тm). 4. Температура плавления праймеров должна находиться в пределах 55-60С. 5. Температура плавления зондов, должна быть приблизительно на 5-10С выше температуры плавления соответствующих пар праймеров (65-67C) (выполнение этого требования необходимо для опережающего связывания ДНК зонда с сайтом ДНК матрицы, до начала синтеза полимеразой комплементарной цепи ДНК). 6. Размер ампликонов, получаемых в результате ПЦР, должен составлять 100-300 н.п., для предназначенных к секвенированию 500-1000 н.п.; 7. Доля G/C пар оснований области связывания локуса - мишени, с праймером или зондом, должна находиться в пределах 40-60%; 8. Последовательности праймеров и зондов, входящих в состав одной реакционной смеси, должны исключать возможность образования конкатемеров, не иметь нецелевых сайтов связывания, включая комплементарную нить, а также не образовывать конкурентных условий протекания реакции.
Поиск локусов, содержащих сайты, пригодные для посадки дифференцирующих зондов и пар праймеров, проводился на основе выравниваний выборок доступных нуклеотидных последовательностей, геномных сегментов ротавирусов с известными свойствами и таксономической принадлежностью, сгруппированных по искомым признакам (рисунок 28).
Оптимизация методов и условий натурных, генетических исследований ротавирусов вариантами ПЦР и секвенированием
В условиях отсутствия доступных, коммерческих, сертифицированных наборов реагентов генотипирования ротавирусов, а также стандартов и положительных контролей для определения генотипов ротавирусов, одной из задач исследования стала разработка собственной (внутренней) лабораторной системы контроля результатов генотипирования образцов из лабораторной коллекции диких штаммов ротавирусов. Основным предъявляемым требованием к разрабатываемой системе контроля была согласованность между собой данных: – общего анамнеза больного-источника пробы биоматериала; – результатов определения принадлежности штамма группе А серологическими методами; – подтверждения группы и генотипа методами на основе ПЦР; – однозначность интерпретации секвенированной последовательности штамма принимаемого в качестве эталонного, значительная гомология штаммам баз данных с установленным таксономическим положением; – наличие исходного биоматериала в достаточном количестве в тематической коллекции для использования на протяжении всего исследования; – высокие титры ротавирусов в первичной пробе биоматериала, минимальное количество посторонних примесей и достаточный для целей всего исследования объем;
Для решения задач этой части работ, наряду с локус сиквенс-типированием, было проведено посегментное секвенирование, выборки «штаммов кандидатов» в референсные. Для установления точного таксономического положения секвенированных последовательностей исследуемых штаммов, проводили их множественные сравнения с последовательностями штаммов с установленными свойствами из международной базы данных, в программе BLAST и с помощью веб-ресурса «RotaC». Были определены величины гомологии и принадлежность «штаммов кандидатов» известным таксонам, последовательности секвенированных генов – известным их аллелям. Опираясь на данные из опубликованных и международных баз данных, дополнительно был проведен анализ реконструкцией филогенетических отношений аллелей генов, секвенированных в ходе исследования штаммов.
Приведены примеры кладограмм, на основе которых осуществлялся сравнительный анализ и определение таксономического положения штаммов ротавирусов тематической коллекции (обозначены цифровой индикацией), последовательности которых установлены в ходе исследований. Буквенно-цифровые индексы принадлежат штаммам сравнения из удаленных (внешних) баз данных сети INSDC. Красными кружками выделены секвенированные в ходе работ штаммы принятые кандидатами в референсные, и используемые по отдельным аллелям в качестве положительных контролей при постановке вариантов ПЦР.
Реконструкция филогенетических отношений выполнена методом «ближайших соседей», реализованном в программе Vector NTI Advance V9.0 («InforMax Inc.», США) (рисунок 44). Анализ филогении секвенированных аллелей генов ротавирусов, позволил установить таксономическую принадлежность ряда штаммов и использовать их в дальнейшем в качестве стандартов.
Для оценки достоверности результатов проведенного в работе генотипирования методом МП–ПЦР–РВ, определения соответствия секвенированных образцов к использованию в качестве внутрилабораторных эталонов сравнения, был проведен сравнительный анализ, сопоставлением данных полученных разными методическими подходами (таблица 10). В качестве дополнительного референс-метода была принята методика из «Руководства по детекции и характеризации ротавирусов» (ВОЗ 2009г.), с детекцией в агарозном геле [154]. омплексных испытаний, отвечающей предъявляемым требованиям, была выбрана и ранжирована по качественным и количественным признакам группа штаммов, принятых в качестве эталонных в рамках исследования. Для аллелей генов P6 и I2, среди диких штаммов и внешних эталонов, материалов с необходимыми исходными качествами найдено не было. Поэтому положительные ПЦР контроли для аллелей P6 и I2 изготовлены прямым синтезом ДНК матриц с последовательностями нуклеотидов, близкими гомологами генам референсных штаммов базы INSDC, с соответствующими вариантами генов рекомендованных RCWG.
Основная задача этой части исследования состояла в проверке корректности данных, полученных МП–ПЦР–РВ генотипированием, выборочным локус сиквес-типированием используемым в качестве референсного метода. Посредством определения таксономического положения последовательностей секвенированных локусов выборки штаммов, установлена принадлежность вариантов их генов, известным таксонам существующей номенклатуры по генотипам и фенотипам (серогруппам). Анализ реконструкцией филогенетических отношений был также необходим для определения соответствия секвенированных образцов, к использованию в качестве внутрилабораторных эталонов сравнения, принадлежности группам исследованных штаммов с установленным таксономическим положением, и не преследовал цели установления таксономических рангов по построениям эволюционной модели.
Для решения этой задачи необходимо было выбрать алгоритм реконструкции филогенетического древа, соответствующий условиям решаемой задачи, среди которых как особенности самого объекта исследований, так и круг вопросов решаемых в исследовании. В качестве основных особенностей ротавирусов необходимо учитывать: гаплоидный набор генов, близкородственность рассматриваемых таксонов и их принадлежность к одной группе (группа А ротавирусов), высокие показатели интенсивности горизонтального переноса генов (реассортации), значительно превышающие скорости мутационных и рекомбинационных процессов и др. С учетом особенностей ротавирусов и круга вопросов задачи решаемой реконструкцией филогенетических отношений, где важны данные кладограмм, в то время как дендрографические данные (такие как эволюционные дистанции и выделение предкового вида) не имеют первостепенного значения, реконструкция филогенетических связей была проведена с использованием двух независимых методов. Алгоритм «связывания ближайших соседей» (Neighbour-joining (NJ)), главными достоинствами этого метода являются: то что этот полиноминальный алгоритм пригоден для больших массивов данных изначальной загрузки, имеет приемлемую точность результатов, по сравнению с другими алгоритмами (напр. UPGMA) не приравнивает все сравниваемые последовательности к единому значению скорости эволюции (молекулярным часам) и др. Суть алгоритма заключается в том что выровненные последовательности (сиквенсы) последовательно сравниваются друг с другом, каждой паре присваивается численный коэффициент, отображающий их различия. Создается числовая матрица, преобразуемая в графическую модель эволюционного древа (филограмму) построенную по принципам кластерного анализа. В методе максимального правдоподобия (Test Maximum Likelihood Tree (ML)) используются более сложные статистические подходы, позволяющие строить филогенетические древа и отражать вероятные эволюционные изменения с большей точностью, что требет большего количества вычислений и налагает ограничения на объем исходных данных. Однако учитывая размеры генома ротавирусов, принимаемые к анализу генетические детерминанты их размеры и величину выборок, этот метод применим в условиях настоящего исследования. Построениями кладограмм обоими методами получены древа с одинаковой топологией, бутстреп 70% которых, указывает на корректность полученных результатов.
В работу отобирались секвенированные образцы из тематической коллекции лаборатории, охарактеризованные на предыдущих этапах по G/P генотипам. Множественные выравнивания последовательностей генов, принимаемые в настоящем исследовании в качестве референсных, проводились по сиквенсам геномов ротавирусов, с достоверно установленными генетическими и фенотипическими признаками по G, P, I критериям, из внешних (удаленных) баз данных сети INSDC. Далее по результатам реконструкции филогенетических древ определялось соответствие данных полученных в эмпирической части исследования, данным штаммов сравнения принимаемых в качестве референсных. Одновременно с этим было проведено сопоставление результатов полученных построениями, и определение таксономического положения исследуемых штаммов с помощью веб-ресурса «RotaC».