Введение к работе
Актуальность проблемы. На сегодняшний день в мире нет стран, в которых не обнаруживались бы случаи заражения ВИЧ-инфекцией. Таким образом, распространение ВИЧ-инфекции приобрело пандемический характер, поэтому актуальность проблемы ВИЧ-СПИДа в мире и России очевидна.
В России в 2010 году общее число ВИЧ-инфицированных, состоящих на диспансерном учете, составило 589581 человек, в том числе 5227 детей в возрасте до 15 лет. Ежегодно увеличивается как количество вновь выявленных случаев заражения (в 2010 году выявлено 58633 случая), так и количество смертей ВИЧ-инфицированных пациентов (в 2010 году умерло 10969 человек), что в целом заставляет рассматривать эпидемиологическую ситуацию по ВИЧ-инфекции как стабильно ухудшающуюся.
Для диагностики этой инфекции применяются самые передовые технологии лабораторного анализа, включая молекулярные методы. В 2005 году в рутинную лабораторную практику внедрен метод секвенирования гена рої ВИЧ-1 в целях слежения за возникновением мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ [MP № 5958-РХ от 07.08.2007 г.]. Однако, получив возможность использовать передовое оснащение и тест-систему зарубежного производства («ViroSeq HIV-1»), региональные клинические лаборатории столкнулись с прежде не виданными задачами, находящимися на грани клинической диагностики и науки. В частности, одна из проблем заключалась в том, что, в связи с тотальной распространенностью подтипа В ВИЧ-1 в странах Северной Америки и Западной Европы, весь зарубежный опыт опирался, в основном, на данные, полученные при изучении вируса иммунодефицита человека 1-го типа подтипа В, поэтому в качестве референтной нуклеотидной последовательности («дикого штамма») компьютерными программами (ViroSeq HIV-1, HIV db Program) была предложена последовательность известного штамма НХВ-2 (подтип В).
Однако многочисленными исследованиями было установлено, что на территории России, начиная с 1995 года, широко распространился вариант подтипа А ВИЧ-1 [Bobkov et al., 2004; Vazquez de Parga et al., 2005], который имеет ряд существенных особенностей в структуре практически всех областей генома [Суханова, 2005; Лаповок с соавт., 2009], при этом генетические дистанции между подтипами А и В ВИЧ-1 достигают 25% - 40% [Korber et al, 1998]. Мутации ЛУ, возникающие в составе ВИЧ-1 разных подтипов, также могут различаться, хотя эти различия выражены не столь существенно [Kantor et al., 2005]. Гораздо больше проблем возникает при анализе мутаций, уже возникших в геноме, поскольку характер феноти-пического проявления мутаций, а значит, и их интерпретация, в значительной степени зависит от генетического окружения. Это означает, что одни и те же мутации в составе геномов разных подтипов ВИЧ-1 могут фенотипически выражаться по-разному вплоть до того, что у определен-
ных генетических вариантов вируса эти мутации не будут вызывать лекарственной устойчивости. Ошибки в интерпретации мутаций, вызванные неадекватностью существующих алгоритмов, могут привести к массовой неэффективности лечения и, как следствие, распространению устойчивых штаммов вируса.
Таким образом, Россия оказалась в ситуации, когда при условии доминирования в стране варианта ВИЧ-1 подтипа А применяются зарубежные тест-системы, разработанные на основе анализа генома ВИЧ-1 подтипа В. Альтернативы этим системам на данный момент не существует, и освоение этих тест-систем в г. Ноябрьске, адаптацию их к условиям использования в региональной лаборатории и изучение способов анализа результатов гено-типирования пришлось начинать «с нуля». В ходе этой работы были проведены исследования, которые позволили анализировать наличие мутаций ЛУ не только у леченых пациентов с целью подбора оптимальной для них схемы терапии, но и у «наивных» пациентов, тем самым была заложена основа национальной базы данных о полиморфизме гена рої, генетического варианта ВИЧ-1, циркулирующего в России. Эти данные составили базу для характеристики генетической изменчивости вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в изученном регионе России - Ямало-Ненецком автономном округе.
Цель и задачи исследования. Основной целью работы было изучение разнообразия вариантов ВИЧ-1 (по гену рої), циркулирующих в Ямало-Ненецком автономном округе, оценка распространенности и анализ мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1, характеризующихся различными значениями уровней значимости («score»), а также исследование возможности применения современных молекулярных методов в практике эпидемиологического анализа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести ретроспективный анализ эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого АО (1995-2008 гг.).
-
Адаптировать существующее оборудование к выполнению анализа с применением тест-системы «Viroseq HIV-1».
-
Провести анализ нуклеотидных последовательностей областей гена рої, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, среди вариантов ВИЧ-1, распространенных в ЯНАО у «наивных» и леченых пациентов.
-
На основании анализа генома ВИЧ-1 охарактеризовать подтипы ВИЧ-1, выявленные на территории ЯНАО, и частоту встречаемости значимых мутаций гена рої у лиц, инфицированных разными вариантами вируса.
-
Оценить эффективность применения различных специализированных on-line программ для определения подтипа ВИЧ-1 по гену рої.
-
Оценить связь мутаций лекарственной устойчивости в составе подтипа А, характеризующихся разными уровнями значимости, с проявлениями лекарственной устойчивости ВИЧ-1.
-
Оценить способность вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена рої, к передаче от человека к человеку.
-
Исследовать возможность применения результатов сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена рої ВИЧ-1 в практике эпидемиологического расследования.
Положения, выносимые на защиту:
-
Установлен факт доминирования генетического подтипа А ВИЧ-1 в Ямало-Ненецком автономном округе.
-
Разработан подход к определению подтипа ВИЧ-1 на основе использования интернет-ресурсов с учетом особенностей молекулярно-эпиде-миологической ситуации в России; даны рекомендации по использованию наиболее надежных ресурсов.
-
Показано, что наряду со структурными генами ВИЧ-1 ген рої может быть использован в качестве мишени для анализа в ходе эпидемиологических расследований.
-
Установлено, что в составе генетического варианта ВИЧ-1 подтипа А, характерного для России, мутации «low score» не связаны с развитием лекарственной резистентности.
Научная новизна работы:
-
Показано быстрое распространение ВИЧ-инфекции среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера (ненцы, ханты, ямальцы); темпы его в 3,3 раза превышают аналогичный показатель среди прочего населения, что представляет серьезную угрозу для существования этой этнической группы.
-
В результате проведенной работы впервые охарактеризованы (по гену рої) генетические варианты ВИЧ-1, циркулирующие в Ямало-Ненецком автономном округе в различные периоды эпидемии, при этом исследуемая выборка составила 8,8% всей изучаемой популяции, что свидетельствует о ее репрезентативности. Установлено, что на сегодняшний день на Ямале, как и во всей стране, доминирует ВИЧ-1 подтипа А (90,8%).
-
Опробован алгоритм определения подтипов ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена рої с применением on-line программ. Впервые продемонстрирована неэффективность программы HIVdb Program: Sequence Analysis для определения подтипа А, доминирующего в России.
-
Впервые показано, что наличие мутаций с уровнем значимости «major score» и «intermedia score» является свидетельством лекарственной резистентности независимо от подтипа ВИЧ-1. Наличие «low єсоге»-мута-ций в штаммах ВИЧ-1 подтипа А не связано с развитием лекарственной резистентности, в то время как у подтипа В «low 5соге»-мутации ассоциированы с таковой.
-
Для достоверного изучения эпидемиологии У771-содержащих генотипов подтипа А ВИЧ-1 использованы данные уточненного ретроспективного эпиданамнеза. Существование устойчивого генотипа ВИЧ-1 с заменой V77I в протеазе (Muty^) подтверждено наличием V77I у «наивных» пациентов; сохранением V77I при назначении либо отмене противовирусных препаратов; сохранением замены V77I при передаче вируса от человека к человеку различными путями.
6. Показана возможность применения результатов секвенирования
гена рої ВИЧ-1 не только в клинической практике для определения резис
тентности, но и в процессе эпидемиологического анализа для осуществ
ления молекулярно-эпидемиологических расследований очагов ВИЧ-
инфекции.
Практическая значимость работы. В рамках данной работы предложены методы адаптации однокапиллярного секвенатора ABI prism-310 для проведения исследований в тест-системе «Viroseq». Опробован и внедрен алгоритм определения подтипов ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотид-ных последовательностей фрагментов гена рої с применением on-line программ, что поможет практикующим врачам-лаборантам достоверно определять подтип исследуемых штаммов ВИЧ-1. Также показана доступность методов филогенетического анализа для проведения реальных эпидемиологических расследований.
В целом, результаты работы могут служить научным подтверждением необходимости проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-инфекции на основании анализа нуклеотидной последовательности гена рої и возможности использования результатов секвенирования гена рої ВИЧ-1 не только в клинической практике, но и в процессе эпидемиологического анализа.
Апробация работы. Апробация работы состоялась 20 апреля 2011 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ, Отдела молекулярной вирусологии и Отдела общей вирусологии ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» МЗ и СР. Результаты исследований представлены в докладах на окружной научно-практической конференции «Актуальные вопросы противодействия эпидемии ВИЧ/СПИД в ЯНАО» (Ноябрьск, 2009 г.), научно-практической конферен-
ции «25 лет борьбы с ВИЧ-СПИД в России» (Суздаль, 2010 г.), на окружном семинаре «Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции. Диспансеризация и лечение ВИЧ-инфицированных в ЯНАО» (Ноябрьск, 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 статей - в реферируемых российских журналах, 3 статьи - в различных изданиях (сборниках специализированных конференций и бюллетеней).
Структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка, 26 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 197 ссылок.
