Морфофункциональные аспекты патогенеза филовирусных геморрагических лихорадок Рябчикова, Елена Ивановна

Введение к работе

Актуальность исследования. Геморрагические лихорадки Царбург и .Эбола - особо опасные вирусные инфекции, требующие постоянной эпидемиологической настороженности. В последние годы опасность новых вспышек повышается, о чей свидетельствуют данные БОВ за 1995-1995 гг. Случаи филовирусных геморрагических лихорадок локализованы главным образом в Африке, однако их "завоз" с обезьянами в Европу и США показывает, что ни одна страна не гарантирована от "импорта" этих инфекций [Buchmeler M.J., 1984; Gelsbert T.W. et al., 1992; Georges A.J. et al., 19961. Высокая опасность филовирусных инфекции требует создания надежных и эффективных средств специфической профилактики и лечения, разработка которых невозможна без знания механизмов патогенеза заболевания. Сведения о развертывании патогенетического процесса в организме на органном, тканевом и клеточном уровне необходимы для поиска и разработки эффективных лечебных и профилактических препаратов. Необходимость исследования патологических процессов на этих уровнях, диктуется прежде всего самим характером взаимодействия вирус-организм, -характером облигатного генетического паразитизма. Для выздоровления необходимо уничтожить зараженные клетки, соответственно, нудно правильно их идентифицировать. Тканевой и клеточный уровень исследования позволяют не только идентифицировать зараженные клетки, но. и дифференцировать первичные изменения, вызываемые инфицированием клеток вирусами от вторичных, развивающихся вследствие интоксикации организма и нарушений регуляции. Субмикроскопические размеры вирусов, в свою очередь, диктуют необходимость широкого применения методов электронной микроскопии. Электронная микроскопия - единственный метод, позволяющий визуализировать ви-русны и точно идентифицировать зараженные клетки.

Цель исследования: изучение патогенеза экспериментальных инфекций у морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Марбург и Эбола.

Задачи исследования:

1. Изучение морфогенеза вирусов марбург и Эбола.

2. Изучение репродукции вируса Эбола и патологических изменений внутренних органов у зараженных неадаптированным штаммом морских свинок.

3. Анализ механизмов изменения вирулентности вируса Эбола для морских свинок в ходе последовательных пассажей.

- 4 -'

4. Изучение особенностей поражения внутренних органов и репродукции вируса Ыарбург у морских свинок при различных способах заражения.

5. Изучение патологических изменений внутренних органов в динамике фшювирускых инфекций у морских свинок и обезьян.

6. Идентификация клеток-мишеней, поддерживающих репродукцию вирусов Ыарбург и Збода у морских свинок и обезьян.

7. Изучение динамики вовлечения органов и клеточных систем в репродукцию вирусов Ыарбург и Эбола у зараженных морских свинок и обезьян.

8. Изучение патологических изменений кроветворения, крови и кровоснабжения при экспериментальных филовирусных инфекциях.

9. Изучение изменений органов и клеток лимфоидной системы у зараженных вирусами Ыарбург и Эбола морских свинок и обезьян.

Научная новизна исследования.

6 данной работе впервые применены методы световой и электронной микроскопии для системного изучения динамики инфекционного процесса In vivo. Диссертация является первым исследованием структурных аспектов патогенеза геморрагических лихорадок Ыарбург и Эбола, проведенным на различных экспериментальных моделях. Впервые дана комплексная оценка деструктивных изменений органов н репродукции вирусов, выявлена роль различных клеточных систем организма в развитии инфекционного процесса.

Впервые установлено, что:

рецептивный эндощтоз является основным путем проникновения вируса Ыарбург в клетки, тогда как вирус Эбола проникает в клетки посредством слияния с плазмалеммой; вироплазма имеет разную структурную организацию у вирусов Ыарбург и Эбола;

у морских свинок, зараженных неадаптированным штаммом вируса Эбола, развивается острое гранулемоподобное воспаление печени, повреждения других внутренних органов незначительны. Репродукция вируса ограничена клетками системы мононуклеарных фагоцитов (CMS);

существует гетерогенность неадаптированного к морским свинкам вируса Эбола по характеру взаимодействия с клетками CMS этих животных;

в ходе последовательных пассажей на морских свинках в репродукцию вируса Эбола, помимо клеток СЫФ, вовлекаются гепатоциты, клетки коры надпочечников, фибробласты и эндотелиоциты. Повышение

-5-. вирулентности вируса Эбола в ходе пассажей сопровождается нарас-таниеы степени патологических изменений внутренних органов и исчезновением воспалительной реакции'в печени;

при аэрозольном,заражении морских свинок вирусом Марбург, в отличие от внутрибртаинного, развивается реакция лейкоцитов на зараженные гепатрциты, однако не приводящая к их деструкции;

первыми клетками-мишенями, репродуцируюЕкми вирусы Марбург и Эбола, у морских свинок и обезьян являются клетки CM3J, независимо от способа заражения;

набор клеток, репродуцирующих филовирусы, и последовательность их вовлечения в размножение вирусов одинаковы у морских свинок и обезьян (1. клетки СУФ; 2. гепатоциты и клетки коры надпочечников; 3. эндотелиоциты и фиброблаеты);

до выявления вируса в крови наблюдаются патологические изменения в системе микроциркуляторного русла внутренних органов и в строении лимфоидных органов зараженных вирусами Марбург и Эбола обезьян и морских свинок;

существуют видовые различия в характере деструктивных изменений кровеносного русла у обезьян, зараженных вирусом Эбола: генерализованное выпадение фибрина в кровеносном русле происходит у зеленых мартышек и макак резус. Геморрагии развиваются у павианов гамадрилов. У циномольгусов эти явления не обнаружены;

при заражении вирусами Ыарбург и Эбола у всех исследованных видов животных развиваются выраженные повреждения системы микроциркуляторного русла, свидетельствующие о нарушении кровоснабжения внутренних органов;,

на терминальных стадиях филовирусных инфекций наблюдаются деструктивные, изменения в легких, указывающие на нарушение газообмена и не связанные с воспалительной реакцией;

у морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола, разрушается "строма красного костного мозга, отсутствуют признаки лимфо- и моноцитопозга, нет формирования структурно полноценных кровяных пластинок;

у экспериментальных животных, зараженных филовирусами, наблюдаются морфологические признаки нарушения функций иммунитета: нет реакции лейкоцитов на инфицированные клетки; во всех местах анатомической локализации лимфоиднои ткани отсутствуют митозы и признаки плаамацитогенеза; разрушаются клетки строыы Ой и, в том числе, дендритные (антиген-представляющие) клетки;

- заражение филовирусами приводит к генерализованному разрушению клеток <Ж> морских свинок и обезьян.

Теоретическая и практическая значимость.

Данная работа является первым исследованием динамики размножения вируса и патологических изменений у зараженных вирусами Марбург и Эбола разных видов экспериментальных животных. В работе идентифицированы клетки-мишени для филовирусов, дана детальная характеристика процесса размножения вирусов в организме и развития деструктивных изменений. Показана ведущая роль клеток ШВ в патогенезе филовирусных инфекций. Полученные сведения не только проясняют механизмы развития филовирусных геморрагических лихорадок, но и полезны для понимания механизмов патогенеза вирусных инфекций в целом. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах вирусологии и медицинской вирусологии в учебных ааведенкях; при составлении учебников и лабораторных методик. Установленные звенья патогенеза и видовые различия в характере поражения органов у животных, зараженных филовирусами, позволят адекватно выбирать экспериментальные модели, в зависимости от поставленных задач. Это дает возможность оптимизировать проведение экспериментов и снизить их стоимость. Полученные в работе сведения о наборе клеток-мишеней для филовирусов использованы при математическом моделировании инфекционного процесса у зараженных филовирусами животных для теоретической оценки эффективности противовирусных препаратов [Чермавенцев В.Н. и др., 1993].

Полученные данные о наборе клеток-мишеней и последовательности их вовлечения в репродукцию филовирусов могут быть применена при разработке лекарственных препаратов направленного действия, блокирующих размножение вирусов Марбург и Эбола. Данные о последовательности вовлечения внутренних органов в икфекционішй процесс и о характере их патологических изменений иогут быть использованы при проведении лечебных мероприятий в клинике.

Положения, выносимые на защиту.

1. При заражении экспериментальных животных вирусами Ыарбург и Эбола первичными клетками-мишенями являются клетки СШ. Вторым звеном, обеспечивающим наработку вирусных частиц, являются гепа-тоциты и паренхиматозные клетки коры надпочечников. Зараженные фибробласты и эндотелиоциты немногочисленны и не вносят заметного вклада в наработку вируса. Диссеминация вируса происходит посредством вирусных частиц и зараженных клеток СШ>, мигрирующих в

- 7 -паренхиму.и интерстиций внутренних органов.

2. У морских свинок, зараженных неадаптированным иташом вируса Эбола, раамножение вируса ограничено клетками СМФ и вызывает острое гранулемоподобное воспаление печени. Популяция неадаптированного к морским свинкам вируса Эбола гетерогенна по характеру взаимодействия с клетками QED этих, кивотных. Адаптация вируса Эбола к морским свинкам посредством последовательных пассадей сопровождается а), вовлечением в репродукции вируса гепатоцитов, клеток коры надпочечников, фибробластов и клеток эндотелия; б). нарастанием степени патологических изменений внутренних органов; в). исчезновением реакции лейкоцитов на зараженные клетки.

3. Повреждения микроциркуляторного русла внутренних органов, ведущие к нарушению кровоснабжения, являются опережающими по отношения к изменениям паренхиматозных клеток и стромы при летальной форме филовирусных инфекций. Деструктивные'изменения паренхиматозных клеток индуцируются главным образом гуморальными токсическими факторами, а не размножением вируса. Наиболее выраженные деструктивные изменения происходят в печени, селезенке, почках, надпочечниках, красном костном мозге и легких.

А. Филовирусы вызывают выраженные повреждения стромы красного костного ыозга, блокирование лимфо- и ионоцнтошзза, и каругге-ние формирования структурно полноценных кровяных пластинок.

5. У морских свинок и обезьяні заратанных вирусами Марбург и Збола, наблюдаются морфологические признаки генерализованного поражения иммунной системы: отсутствует реакция лейкоцитов на зараженные клетки, во всех местах анатомической локализации димфонд-ной ткани отсутствуют митозы лимфоидных клеток и плазмацитогевез, разрушаются клетки стромы и клетки QJD, в том числе дендритные.

6. Генерализованное заражение клеток СМФ вирусами Марбург и Збола играет ключевую роль в патогенезе экспериментальных филовирусных инфекций, обусловленную ведущей ролью этих клеток в регуляции различных физиологических, иммунных и патофизиологических реакций. По своей сути фидовирусные геморрагические лихорадки являются болезнью макрофагальной системы.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения проведенного исследования доложены и обсуждены на международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и проблемам ГЛВДа (Ленинград, 1991); на конференции "Микроскопические аспекты патогенеза вирусных инфекций"

- 8 -(Новосибирск, 1991); на Х1У конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1992 г); на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); на конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии" (Покров, 1992); на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" (Кольцово, 1993); на конференции "Проблемы экспериментальной и клинической лимфологии" (Новосибирск, 1994); на III съезде анатомов, гистологов, эмбриологов Российской федерации (Тюмень, 1994); на Ninth International Conference of Negative Strand Viruses (Estoril, Portugal; 1994).; на 7th International Conference of Comparative and Applied Virology (Montreal, Quebec, Canada; 1994); на I Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Medical Treatment (Splez, Switzerland, 1994); на ' Xth International Congress "Aerosols in Medicine" (Hamilton, Canada, 1995); на II Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Medical Treatment (Spies, Switzerland, 1996); на International Colloquium on Ebola virus research (Antwerp, Belgium; 1996); на Russian-German Colloquium on Fllovlruses: the Modern State of Problem (Koltsovo, 1997).

Публикации. Автором опубликовано по теме диссертации 39 научных работ, из них 13 статей и глава в сборнике "Current Topics in Microbiology and Immunology".

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из двух тоыов. Первый том содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, шесть глав результатов собственных исследований и обсуждений, десять таблиц, две схемы, заключение и вывода (171 страница), а также список использованной литературы, включающий 63 отечественных и 238 зарубежных источников. Второй том со-. держит иллюстрации (98 микрофотографий).