Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание в 50-х годах штаммов полновирусной вакцины опиралось на эмпирический, во многом интуитивный, подход. В последующие годы были получены обширные знания о строении и функщюнировашш вируса полиомиелита и родственных ему других пнкорнавирусов. Известно, что вирусные детерминанты хозяинспецифичности определяют круг хозяев, клеточный тропизм, вирулентность и ряд других свойств вирусов. Изучение этих детерминант является важной частью исследований молекулярного патогенеза вирусных заболеваний. Частные особенности взаимодействия вирусов с клетками отражают как различные способы реализации вирусных генетических программ, так и особенности физиологии клеток разных тканей и разных видов животных. Картирование вирусных детерминант хозяинспецифичности открывает возможность направленного изменения вирулентных свойств вирусов. Если локализовать в геноме пнкорнавирусов детерминанты, необходимые для репликации в тканях, поражение которых приводит к появлению симптомов заболевания, то можно сконструировать аттенуированные штаммы, у которых детерминанты вирулентности необратимо модифицированы или удалены. Такие штаммы способны служить безопасной живой вакциной. Стадии взаимодействия вируса с клеткой, характерные для конкретної! вирусной инфекции, могут быть мишенью лекарственных средств.
Одним из перспектігонмх кандидатов для поиска тканеспецифігчньїх детерминант является 5'-нетранслируемая область (5НТО) пикорнавнрусной РНК. Участвуя в контроле репликации и трансляции вирусных РНК, 5НТО взаимодействует с клеточными факторами, набор которых различается в клетках разных тканей. Известны аттецуируютцие мутацій вируса полиомиелита в регуляторном трансляционном элементе 5НТО - IRES (internal ribosome entry site). Участок 5HTO полиовнруса длиной около 150 нт, расположенный к З'-концу от IRES, является характерным для энтероЕирусов и может, как и IRES, нести детерминанты энтеровирусной нейроснсцифігчности.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было картирование нейроспецифических детерминант в сегменте 5НТО полиовируса, расположенного к З'-концу от сайта внутренней посадки рибосомы IRES. Ранее d нашей лаборатории были выделены мутантные штаммы полиовируса, содержащие протяженные делеции (~160 нт) в 5ЫТО (Pilipeako et al., 1992, Gmyl et al., 1993). Делеции захватывали весь расположенный к З'-концу от IRES сегмент 5НТО, состоящий из нескольких структурных элементов. В задачи исследования входило изучение способности делешюнных мутантов размножаться в нервных клетках in vivo. Для выполнения этой задачи была разработана модель тестирования иейровнрулептности полиовируса на лабораторных мелких грызунах, хлопковых крысах и мышах. После того, как было определено, что делеции обладают сильным аттснуирующим действием, следующей задачей было выяснение роли каждого из структурных элементов, отсутствуюнщх у делещюшшх мутантов, в проявлении вирулентного фенотипа полиовируса. Для этого были созданы штаммы с мутациями соответствующих цис-жепентов, изучена их нейровирулентность и охарактеризованы ревертанты, возникающие при репликации п ЦНС животных.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе показано, что делецня З'-концевой части 5НТО, в результате которой происходит сблпжепис IRES и инициаторного кодона AUG, приводит к аттснуации вируса полиомиелита. Установлено, что аттенуация мутантов с протяженными делениями не связана с отсутствием структурных элементов, образованных З'-концевой частью 5НТО. Впервые показано, что присутствие мотива, содержащего критический триплет AUG, поблизости от З'-грашщы IRES необходимо для эффективного размножения полиовируса в нервных клетках in vivo. Необходимость дополнительных сигналов в области 5НТО, осуществляющей контроль инициации трансляции вирусных матриц, в нервных клетках, в отличие от других, указывает на различия в трансляционном аппарате данных клеток. Выполненное картирование нейроспецифических детерминант может
послужить основой для создашія неревертируемых аттенунрованных штаммов вируса полиомиелита и других нейропатогенных энтеровирусов.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на IX международном вирусологическом конгрессе (Глазго, Великобриташія, 1993), на VIII конференции "Молекулярная биология пнкорнавирусов" (Коприлампн, Финляндия, 1994), на симпозиуме "РНК-решшкон" (Кобе, Япония, 1994), на IV международном симпозиуме "Позитивные РНК-вирусы" (Утрехт, Нидерланды, 1995), а также на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из традиционных разделов. Диссертация содержит 12 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 181 источник.
Использованные сокращения. БОЕ - блящкообразующая единица; КПЗМ - почки африканской зеленой мартышки (первичная культура); нт -нуклеотид(ы); 5НТО - 5'-петранслируемая область; ОПТ олигопнримидшговып тракт; ОРС - открытая рамка считывания; ЦНС -центральная нервная система; IRES - Internal Ribosome Entry Site, внутренний участок присоединения рибосомы; тп - mouse-neurovirulent, нейровирулентный для мышей (штамм полиовируса); PD50 -paralytogenic dose, доза вируса (в БОЕ), вызывающая параличи или шбель 50% зараженных животных; Tg-PVR - линия мышей, экспрессирующих человеческий рецептор полиовнруса, hPVR.