Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1. Функции белков CTDSP1, CTDSP2, CTDSPL в клетках человека 13
1.1.1. Аминокислотные последовательности фосфатаз CTDSPL/1/2 13
1.1.2. Механизм действия SCP фосфатаз 14
1.1.3. Фосфорилирование C-концевого домена РНК-полимеразы II 16
1.1.4. Регуляция транскрипции нейронных генов 18
1.1.5. Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами 19
1.2. Функции SCP фосфатаз в различных опухолях 22
1.2.1. Механизмы нарушения экспрессии генов-супрессоров при НМРЛ 22
1.2.2. Белок pRb в регуляции клеточного цикла 24
1.2.3. Роль pRb в образовании различных опухолей 31
1.2.4. Влияние CTDSPL/1/2 на эпителиально-мезенхимальный переход 35
1.2.5. CTDSPL/1/2 и их интронные микроРНК 36
1.2.6. Онкосупрессорная активность SCP фосфатаз в различных опухолях 38
2 Материалы и методы 46
2.1. Образцы тканей 46
2.2. Клеточные культуры 47
2.3. Трансфекция клеток и плазмиды 47
2.4. Анализ образования колоний 49
2.5. Определение скорости роста отдельных клонов 50
2.6. Определение скорости роста «зеленых» клеток 50
2.7. Иммуноферментный анализ 50
2.8. Выделение РНК и количественная ПЦР 51
2.9. Биоинформатический анализ 53
2.10. Статистический анализ 53
3 Результаты и обсуждение 55
3.1. Биоинформатический анализ экспрессии CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ 55
3.2. Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и транскрипционных факторов при НМРЛ 56
3.3. Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ 58
3.4. Способность CTDSPL/1/2 подавлять рост опухолевых клеток in vitro 60
3.5. Морфологические изменения клеток A549 после трансформации 63
3.6. Cтатус фосфорилирования pRb в сайтах Ser-807/811, Ser-780 и Ser-795 65
3.7.1. Поиск регуляторных микроРНК для CTDSPL/1/2 67
3.7.2. Сравнение профилей экспрессии CTDSPL/1/2 и miR-183-96-182 68
3.8. Коэкспрессия генов CTDSPL/1/2 и их интронных микроРНК miR-26a/b 70
Заключение 72
Выводы 76
Список литературы: 77
- Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами
- Онкосупрессорная активность SCP фосфатаз в различных опухолях
- Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ
- Коэкспрессия генов CTDSPL/1/2 и их интронных микроРНК miR-26a/b
Сигнальные пути, связанные с SCP фосфатазами
Малые сериновые фосфатазы CTDSPL/1/2, в отличие от фосфатазы FCP1, способны дефосфорилировать Smad2 и Smad3 в N-концах и линкерных областях, усиливая сигнальный путь трансформирующего ростового фактора бета (TGF-beta) [40]. Этот фактор контролирует многие функции в клетке, включая пролиферацию и дифференцировку. Белки Smad являются преобразователями сигналов и транскрипционными модуляторами, которые опосредуют множество сигнальных путей, в том числе сигнал TGF-beta.
Фосфатазы CTDSPL/1/2 также дефосфорилируют Smad1 в C-конце, тем самым отрицательно регулируя сигнальный путь костных морфологических белков BMP (Bone Morphogenetic Proteins) [41]. Smad1 является сигнальным белком пути TGF-/BMP, играющего фундаментальную роль в органогенезе костных тканей посредством активации рецепторов серин-треониновых киназ.
SCP фосфатазы также могут дефосфорилировать и стабилизировать белок Snail. Известно, что сверхэкспрессия этого белка приводит к рецидиву рака молочной железы, который сопровождается эпителиально-мезенхимальным переходом. Белок Snail является важным регулятором нескольких сигнальных путей, которые приводят к эпителиально-мезенхимальному переходу и миграции клеток [42].
Известна способность фосфатазы CTDSP1 дефосфорилировать белок, участвующий в подавлении экспрессии E-кадгерина – Twist1. Фосфорилирование серина в 68 положении N-конца этого белка способствует его деградации [43]. E-кадгерин регулирует клеточную адгезию и подвижность клеток. Его дерегуляция приводит к ингибированию инвазии и метастазирования опухолевых клеток.
Показано, что экспрессия CTDSCPL/1/2 повышена в сердечной ткани, а интронные микроРНК – miR-26b, miR-26a-2 и miR-26a-1, кодирующие последовательности которых содержатся в интронах этих генов, выполняют определенную функцию в сердце [44]. Для выяснения роли CTDSP1 и его miR-26b в кардиомиоцитах проведено исследование, результаты которого показали, что CTDSP1 может вызвать гипертрофию сердца, а оверэкспрессия CTDSP1 приводит к значительному увеличению площади поверхности клеток кардиомиоцитов и к повышению уровней экспрессии соответствующих генов [45]. Экспрессия CTDSP1 индуцирует сердечный гипертрофический фенотип, а экспрессия его интронной miR-26b имеет противоположный эффект по сравнению с эффектом оверэкспрессии CTDSP1 in vitro. Эти данные свидетельствуют о том, что CTDSP1 потенциально индуцирует сердечную гипертрофию, которая отрицательно регулируется его интронной miR-26b.
Таким образом, многофункциональные фосфатазы семейства SCP участвуют в регуляции сигнальных путей, а также транскрипции генов, и выполняют ряд жизненно важных функций в различных биологических процессах.
Онкосупрессорная активность SCP фосфатаз в различных опухолях
В последнее время появляется всё больше данных о способности некоторых SCP фосфатаз подавлять рост различных опухолевых клеток человека. Среди них супрессорная активность впервые была показана для гена CTDSPL [15]. В ходе изучения генетических и эпигенетических изменений хромосомы 3 человека обнаружен локус (3p12-p2), богатый генами-супрессорами, вовлеченными в патогенез рака лёгкого и других типов опухолей [15, 124]. Выявлены частые делеции этого локуса при различных типах опухолей, включая опухоли лёгкого [125, 126]. Позже на представительной выборке первичных образцов НМРЛ показано, что для CTDSPL характерно частое снижение уровня мРНК [16]. Обнаружено значительное ( 2 раза) и частое (85%) снижение относительного уровня экспрессии CTDSPL в опухолях по сравнению с нормой, более выраженное в образцах с ПКРЛ, чем в образцах с АК. Методом трансфекции клеточной линии светлоклеточного рака почки KRC_Y и мелкоклеточного рака легкого ACC-LC5 показана способность CTDSPL подавлять рост опухолевых клеток in vitro [15]. В этом же исследовании для CTDSPL наблюдали эффект подавления роста опухолевых клеток на мышах, которым вводили клоны клеток KRC/Y и ACC-LC5. В другой работе показано, что усиленная экспрессия miR-100 в клетках лейкемии человека HL60 может ингибировать CTDSPL и в то же время приводить к повышению способности фосфорилированной формы активировать pRb и к высвобождению E2F1 [127]. В этой же работе эксперимент с нокдауном микроРНК выявил ингибирование miR-100, приводящее к противоположному эффекту.
С помощью GST-пулдаун анализа показано, что CTDSPL может напрямую связываться с pRb и подтверждена возможность взаимодействия между pRb и CTDSPL методом поверхностного плазмонного резонанса [128]. Однако все ещё остаются открытыми некоторые вопросы: какие именно сериновые остатки pRb кроме Ser-807/811 дефосфорилируются CTDSPL? Могут ли высокогомологичные паралоги CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2 выполнять схожие функции?
Для клеток базально-парабазального слоя в опухоли шейки матки показана корреляция снижения экспрессии генов P16 и CTDSPL с увеличением фосфорилированной формы pRb (для сайтов фосфорилирования Ser-807/811 и Ser-567) [129]. С помощью иммуногистохимического анализа выявлен высокий уровень pRb (по остаткам Ser-807/811 и Ser-567) и низкая экспрессия CTDSPL в базальном и парабазальном слоях большинства нормальных пролиферирующих клеток цервикального эпителия. Метилирование CTDSPL в базально-парабазальном слое шейки матки в норме этого заболевания (62%) коррелирует со сниженным уровнем экспрессии в базально-парабазальном слое. Кроме того, наблюдали высокую частоту делеций CTDSPL при дисплазии шейки матки и в ходе прогрессии рака шейки матки. Изменение экспрессии P16 и CTDSPL оказалось синергичным и связанным с увеличением фосфорилированного pRb в опухолях, а также коррелировало с неблагоприятным прогнозом у пациентов [129].
С помощью высокопроизводительного секвенирования гены CTDSPL и CTDSPL2, наряду с известными ранее MYC, MYB, Mir-155 и TERT, идентифицированы в качестве распространенных сайтов интеграции в ALV-индуцированных В-клеточных лимфомах [130].
В клетках фибробластов куриного эмбриона интеграция вируса ALV в геном приводит к повышенной экспрессии (в 100 раз выше по сравнению с клетками дикого типа) генов CTDSPL и CTDSPL2 [131], при этом CTDSPL и CTDSPL2 обладают онкогенными свойствами и способствуют миграции клеток. В этой же работе выявлена роль CTDSPL2 в защите клеток от апоптоза, вызванного окислительным стрессом.
В клеточных линиях рака почки 786-O и A-498 экспрессия CTDSP1 подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию опухолевых клеток in vitro. При подкожной инъекции трансфицированных клеток 786-O голым мышам с последующей активацией экспрессии CTDSP1 доксициклином наблюдали подавление роста опухолей in vivo [12]. Методом иммуноблота с pS518-специфическим антителом показано, что CTDSPL/1/2 значительно снижают уровень фосфорилированного в Ser-518 PML. Однако каталитически неактивные мутанты CTDSPL/1/2 не влияли на фосфорилирование белка промиелоцитарного лейкоза PML в Ser-518. В дальнейшем на 36 парных образцах светлоклеточного рака почки обнаружено снижение экспрессии CTDSP1, CTDSPL и PML, в то время как уровень PML, фосфорилированного в Ser-518, увеличен в опухолях светлоклеточного рака почки относительно нормы. Причем снижение уровней экспрессии фосфатаз и повышение фосфорилированной в Ser-518 формы PML чаще встречается в образцах с III-V стадиями, чем с I-II стадиями. Белок PML, но не мРНК, часто подавляется в широком спектре опухолевых заболеваний человека [132]. Известно, что pPML задействован в путях регуляции ряда опухолевых супрессоров, включая p53 [133], PTEN/Akt [134] и mTOR [135]. Также показано, что pPML может образовывать стабильный комплекс с дефосфорилированным pRb [136]. Фосфатаза CTDSP1 изначально идентифицирована как ядерная и дефосфорилирующая РНК-полимеразу II [19, 31]. Обнаружено, что CTDSP1 в основном локализован на плазматической мембране в разных типах клеток, где CTDSP1 негативно регулирует активность белков семейства протеинкиназ В (AKT) с последующим нарушением ангиогенеза и онкогенеза [137]. Такой новый фенотип, наблюдаемый у CTDSP1, вызывает большой интерес, потому что только несколько серин/треониновых фосфатаз локализованы в плазматических мембранах, хотя всего обнаружено приблизительно 30 серин/треониновых и 107 тирозиновых протеинфосфатаз [138, 139]. Важно отметить, что все эти локализованные на мембранах фосфатазы играют решающую роль в различных биологических процессах [140]. На животных моделях in vitro и in vivo обнаружено, что CTDSP1 подвергается пальмитоилированию по двум цистеинам на N-конце [137]. S-пальмитоилирование представляет собой липидную посттрансляционную модификацию, при которой происходит ковалентное присоединение жирной кислоты пальмитата к остаткам цистеина через тиоэфирную связь. Это единственная на данный момент идентифицированная обратимая модификация липидов [141]. Согласно этим данным, ингибирование пальмитоилирования индуцирует ядерную локализацию CTDSP1, что указывает на то, что CTDSP1 может перемещаться между плазматической мембраной и ядром.
Новые кровеносные сосуды возникают из уже существующих в процессе, называемом ангиогенезом. В эндотелиальных клетках сигнальный белок АКТ стимулирует ангиогенез, перемещаясь к клеточной мембране, где он активируется и запускает дальнейшие сигнальные события. Активация АКТ происходит через фосфатную группу, присоединенную к конкретному сайту в белке. В опытах in vivo показано, что у мышей с инактивированным CTDSP1 повышен уровень фосфорилированного АКТ в их эндотелиальных клетках, происходит рост новых кровеносных сосудов и обнаружены более быстро растущие опухоли [137]. Показано также, что CTDSP1 дефосфорилирует транскрипционный фактор c-Myc в Ser-62, что влияет на стабильность c-Myc в клетках рака печени [13]. Эта фосфатаза способна напрямую связываться С-концевым доменом с основной структурой спираль-петля-спираль c-Myc и приводить к подавлению пролиферации опухолевых клеток печени.
Коэкспрессия CTDSPL/1/2 и RB1 при НМРЛ
Нарушение регуляции экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста является одним из существенных признаков онкогенеза. Проведен анализ уровней экспрессии генов трех малых сериновых фосфатаз CTDSPL/1/2 и гена RB1 в образцах НМРЛ (Рис. 8). Исследуемая выборка включает в себя два его основных гистологических типа – ПКРЛ (33 образца, Рис. 8А) и АК (13 образцов, Рис. 8Б). Анализ экспрессии генов выявил заметное (в среднем 3,5-7 раз) и частое (60-90%) снижение уровней мРНК для генов CTDSPL/1/2. При этом в образцах АК снижение экспрессии всех трех генов более выражено для образцов с метастазами в регионарные лимфатические узлы, чем в образцах без метастазов (P 0,05 для CTDSPL и CTDSP1, для CTDSP2 P 0,06, Табл. 4). Такого отличия в снижении экспрессии генов фосфатаз не наблюдали в случае ПКРЛ (Рис. 1А).
Уровень мРНК RB1 снижен (до 19 раз) в 57% образцов НМРЛ (Р 0,01). Значительное снижение экспрессии выявлено как в АК, так и в ПКРЛ (в среднем в 5 раз). Для АК, но не для ПКРЛ обнаружены значимые отличия в уровнях мРНК CTDSP1, CTDSPL и RB1 в образцах с метастазами в регионарные лимфатические узлы (в 7,9 раза) и образцами без метастазов (в 1,7 раза). Эти различия между АК и ПКРЛ, вероятно, объясняются отличиями в путях метастазирования (аденокарцинома расположена ближе к периферии) [158] и в профилях экспрессии белков [159].
Кроме того, для экспрессии генов CTDSPL/1/2 и RB1 обнаружены высокие коэффициенты ранговой корреляции Спирмена в образцах ПКРЛ (rs = 0,50-0,73, P 0,05), но для CTDSP1 и RB1 такой сильной корреляции не обнаружено (rs = 0,31, P = 0,07). При этом для АК значимую положительную корреляцию наблюдали только для генов CTDSPL и CTDSP1/Rb1 (rs=0,67, P 0,05, Табл. 4).
Таким образом, выявлено значительное (в среднем в 5 раз) и одновременное снижение уровней мРНК генов CTDSPL/1/2 в большинстве образцов НМРЛ (84%, 39/46). Такое однонаправленное изменение экспрессии и сильная положительная корреляция между уровнями экспрессий этих генов (rs = 0,5-0,73, P 0,01, Табл. 3) позволили предположить общий механизм их инактивации.
Количественный анализ экспрессии генов проводили в 46 образцах первичных опухолей НМРЛ (13 АК и 33 ПКРЛ) и смежных неопухолевых тканях с помощью количественной ПЦР. Данные были нормированы на экспрессию контрольного гена RPN1. Горизонтальной линией внутри прямоугольника отмечено медианное значение (50-й процентиль). Прямоугольные области соответствуют диапазонам, содержащим 50% значений (между 25 и 75 процентилями), а вертикальные линии указывают максимальное и минимальное значения R. - P 0,05; - P 0,01.
Коэкспрессия генов CTDSPL/1/2 и их интронных микроРНК miR-26a/b
Литературные данные о свойствах miR-26a/b в клетках рака легкого противоречивы. Оверэкспрессия miR-26a (интронная микроРНК CTDSPL и CTDSP2) в клеточной линии рака легкого человека A549 значительно подавляет клеточную пролиферацию, блокирует фазовый переход G1/S, индуцирует апоптоз и ингибирует метастазирование и инвазию опухолевых клеток in vitro [120]. В другом исследовании показано, что повышение экспрессии miR-26a приводит к усилению способности клеток рака легкого A549 к инвазии [170]. Эти микроРНК кооперируют с CTDSPL/1/2 для блокирования перехода G1/S при гепатоцеллюлярной карциноме (HCC): miR-26a/b непосредственно подавляет экспрессию CDK6 и циклина E1, что приводит к снижению уровня фосфорилирования pRb [14].
Недавние исследования показали, что нарушения экспрессии микроРНК может играть роль не только в онкогенезе, но и в метастазировании. В частности обнаружено, что повышение экспрессии miR-26a-5p усиливает метастазирующий потенциал клеток опухоли легкого (А549, H1299, H661) [171].
В данной работе показана коэкспрессия генов CTDSP1, CTDSP2 и CTDSPL и их интронных микроРНК. В большинстве образцов НМРЛ экспрессия всех трех генов фосфатаз одновременно снижена. Более того, анализ с помощью количественной ПЦР показал, что действительно в образцах с пониженным уровнем мРНК CTDSP1 также уменьшалась экспрессия miR-26b. То же самое верно и для генов CTDSPL и CTDSP2 и их интронной микроРНК miR-26a (Рис. Рис. 13. Анализ экспрессии miR-26a/b и CTDSPL, CTDSP1 и CTDSP2 в НМРЛ. А. Коэкспрессия генов CTDSP1, CTDSP2 и CTDSPL и их интронных микроРНК. Б. Антикорреляция экспрессии miR-26b и RB1. Прямоугольником представлен межквартильный диапазон (25-75-й квартиль).
Однако степень уменьшения экспрессии микроРНК и гена-хозяина различна, что предполагает различную регуляцию на посттранскрипционном уровне.
Выявлена статистически значимая обратная корреляция между экспрессией miR-26b и RB1 при НМРЛ (rs = -0,4, P 0,05) (Рис. 13Б). Это также может означать наличие общей функции miR-26b и её гена-хозяина, CTDSP1, в инактивации pRb при НМРЛ. По-видимому, интронные микроРНК miR-26a/b помогают фосфатазам в блокировании фазового перехода G1/S клеточного цикла, а не являются антагонистами друг другу в нормальных клетках.