Введение к работе
актуальность проблемы^ В связи с появлением ?.
распространением СПИД начался активный поиск препаратов, ооладаших выраженным анта-ВИЧ действием, среди лекарственных средств, ингибкрущая активность которых была ранее установлена в отношении других вирусов, и разработка новых противовирусных препаратов, способных воздействовать на ВИЧ и приостанавливать пли предотвращать развитие икфекции. Так, была . выявлена знти-ВИЧ активность сурамина (Mltsuya Н., et . al.,. 1984), азидотнмидана (Mltsuya Н., et al.,19S5), р- глицирризиновой кислоты (Ito Ы.,1988), рибавирина (Williams I.G., 1939), аургштрикарбоЕовой кислоты (Balzarlnl J., et al.,1989) и многих других препаратов.
В настоящее время проводятся эксперименты с более че?л 80 Z3-.X4C сїегсі субстанция!,и-потеЕцкальЕК».и лекарственными средствами для лечения СЇЩ. Наиболее эффективные гнтп-ВКЧ препарата откосятся к группе нуклеотидных аналогов, являющихся инп'бпторЕки вирусного фермента-обратяой транскриптазы. Один иг :zu. - ззпдоті2.е!Діш (AZT)- стал перзіні п пока единственным
- 2 -появлению AZT-устойчивых штаммов ВИЧ (Marx J.L., 1989.. Larder В.А., et al., 1989, larder В.А. and Kemp S.D., 1989). Поэтому актуальным представляется поиск новых ингибиторов размножения ВИЧ. И в этом плане особый интерес представляет препараты с ыеханизном действия, не связанным с ингибированием обратной транскриптазы вируса, что, вероятно, позволит дополнить действие AZT. Исследователи в поиске эффективных химиотерапевтических агентов против ВИЧ используют разнообразные стратегии, основанные на разных мишенях в репдвкативном цикле вируса, с которыми могут взаимодействовать анти-ВИЧ агенты. В добавок к обратной транскриптазе, являющейся і—піни дин 2\3'-дидазоксящуклеозидных аналогов, различные другие мшюнв могут служить местами для химиотврапевтической атаки: адсорбция вирусной частицы ва клеточной мембране, раздевание вирусного капенда, интеграция пронирусной ДНК в клеточный геном, процессинг вирусных белков-предшественников, сборка к висвобеддание (почкование) потомства вирусных частиц. Поиск нонах эффективных ингибиторов размножения ВИЧ, действу швах на рдяяитг этапах его жизненного цикла, остается актуальном на сегодняшний день.
Так как все «ніш-дниня ваше химвотерапввтические подходы яяпрявднаи на подавление вируса на одном или более этапах его цикла репликации, нельзя ожидать, чтобы хоть один из таких агентов "вырвал" бы вирус из резервуаров {макрофтта/мояощвтоа). Дія достижения этой цели, которая актуальна для змимиштии провирусной ДНК из персистентно
-я^тщ«іяяш*ПЯі КДЄТКИ, дп««—і бНТЬ ПрВМеНВНЫ 00ЛЄ9 ЭффеКТИННЫб аГЭНТЫ, TSKZS Как ^>цтятчла:жаагя OJШта^yKJЇЗOTИДЫ, КОВаЛвНТНО
- з -связывающиеся с нуклеиновой кислотой, - разрезающие реагента. Только такие вмешательства, которые достигают цели элиминирования вирусных последовательностей ДНК из клеток хозяина-, можно предположить, завершат действительный курс лечения болезни. В нескольких лабораториях мира в течение ряда лет ведутся интенсивные исследования в области создания нового поколения эффективных лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции на основе антисмысловых олигонуклеотидов. К настоящему времени в литературе описано ингибирование размножения ВИЧ в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарными различным функциональным участкам РНК вируса (Zamecnlk et al., 1986; Matsukura et al., 1987, 1989; Agrawal et al., 1988, 1989; Zala et al., 1988; Rennelsen et al., 1990). Тем не менее поиск новых более эффективных в отношении ВИЧ антисмысловых олигонуклеотидов и разработка на их основе лекарственных средств остается актуальным.
Важно отметить, что высоко эффективных средств для лечения СІЩ еще нет и в целом в настоящее время не существует такого подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения СІЩ, который мог бы претендовать на монополию. Эффективная терапия этого заболевания может стать результатом системного комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления болезни будут использоваться лекарственные средства различной природы с разными механизмами действия, их различные комбинации.
Принимая это во внимание мы в своей работе проводили поиск новых перспективных для лечения СПИД анти-ВИЧ агентов среди уже известных ингибиторов ВИЧ-инфекции (р-глипирризшювая кислота)
путем получения их различных химических производных, среда химических препаратов, для которых показана противовирусная активность в отношении других вирусов (энциклан), среди препаратов нового поколения - антисмысловых олигонуклаотидов; оценивала возможность совместного применения с AZT некоторых из них.
ШЖ.и_залачи_исслвдованияі Целью настоящей работы был поиск анти-ВИЧ активных препаратов и изучение анти-ВИЧ действия наиболее перспективных из них. Работа связана с решением задач, поставленных в рамках Государственной программы по борьбе со СПИЦ.
На первом этапэ исследования была подобрана система вирус-клетка, адекватная для разрешена поставленной задач:-!, и разработан комплекс методов по оценке уровня ингибировашя ВИЧ в клетках. В качестве эталонных были использованы известные препараты, обладающие анти-ВИЧ активностью - AZT, гепарин, ауринтрикарбоновая кислота (АТК). Среди клеточных культур, пермиссивных для ВИЧ, наше внимание привлекли не только Т-хелперы (ЫТ-4, СЕМ, НЭ),но и макрофагальные линии (U-937). Использование клеток-макрофагов для тестирования противовирусных препаратов дает возможность провести более полную оценку препаратов и выявить те из них, которые могут дополнить действие AZT.
На втором этапе работы проводили скрининг различных химических соединений таких как компоненты экстракта корня солодки (Glycyrrhlza. radix): р-глицирризиновая кислота, Злавоноиды; химические производные (З-глицирризиновой кислоты :.-.ъ различные амиды и гликопепшш); изоборниловые эфирк
- 5 ~ (эншклан), антисмысловые олигонуклеотида и их производные.
На третьем этапе исследования определяли количественные характеристики (1%0, CD5q, IS) для наиболее перспективных, из изученных анти-ВИЧ препаратов.
По ходу выполнения работы была" рассмотрена возможность использования для ингибирования ВИЧ-инфекции разных комбинаций изученных препаратов с AZT.
Научная новизна.. В процессе скрининга препаратов,
относящихся к различным классам химических соединений, выявлены новые ингибиторы репродукции ВИЧ:
а) производные р-глицирризиновой кислоты, эффективно
ингибирущие размножение ВИЧ-І как в культуре Т-лимфоцитов, так
и в моноцитарной клеточной системе:
-
ниглизин (пента-о-никотинат р-глицирризиновой кислоты),
-
амид р-глицирризиновсй кислоты с 6-аминоурацилом,
-
амид р-глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом,
-
гликопептид р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром 1-гистидана,
-
гликопептид р-глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром L-глутаминовой кислоты,
-
гликопептид р-глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты,
-
гликопептид р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-Інвалина;
б) впервые была установлена способность изоборнилового эфира
2,9-диметал-За,4,9,9а-тетраівдрофуро-[2,3-Ь] - хиноксалин - 3 -
карбоновой кислоты (энциклана), относящегося к новому классу
химических соединений, эффективно ингибировать репродукцию как
- 6 -ВИЧ-І так и ВИЧ-2 в культуре клеток;
в) впервые показана высокая противовирусная активность (IS
100-500) и специфичность анти-ВИЧ действия олигонуклеотидов
последовательности pGCAICAAGCAGCTCCAGGCA (РМ-20),
комплементарной области начала трансляции открытой рамки
считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-І, и последовательности
pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC (МР-20), комплементарной олигонуклеотиду
РМ-20.
г) На примере уже известных антисмысловых олигонуклеотидов -
ингибиторов ВИЧ-І и новых олигонуклеотидов РМ-20 и МР-20
показано, что введение в 5'-положение олигонуклеотидов
химических модификаций (алифатических аминов, остатков
холестерина) приводит к существенному повышению эффективности
ингибирования ими репродукции ВИЧ и обеспечению значительной
степени защиты Т-хелгоров от цитопатического действия вируса.
д) Установлено, что глицирам-лекарственный препарат на основе
р-глицирризиновой кислоты- не является антагонистом AZT.
Теоретическая и практическая ценность. Во всем мире под эгидой ВОЗ осуществляется комплексная программа борьбы со СПИД, включающая поиск лекарственных средств, способных хотя бы приостановить течение этой смертельной в большинстве случаев болезни. Бесспорно, что в этой связи выявление новых ингибиторов размножения ВИЧ (ниглизин, амида, и гликопептиды р-глицирризиновой кислоты, знвдклан, олигонуклеотидн РМ-20 и МР-20, а также их производные, несущие на 5'-конце гидрофобные группировки) имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Результаты работы по изучению совместного действия
- 7 -препаратов р-глицирризиновой кислоты с азидотшидином позволили сделать вывод о возможности такого применения, что может оказаться полезным при комплексной терапии СІВД.
Определены количественные характеристики для ряда олигонуклеотидов и показана более высокая анти-ВИЧ активность новых олигонуклеотидов Рм-20 и МР-20 по сравнению с уже известными, а введение химических модификаций позволило существенно повысить их эффективность за счет повышения их стабильности и увеличения проницаемости клеточных мембран для таких препаратов и обеспечить высокую степень защиты клеток от цитопатического действия вируса, что, вероятно, может быть использовано при создании доступных для практического применения эффективных препаратов для лечения заболевания СІВД.
Апробация. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Химия природных и низкомолекулярных биорегуляторов" (Ереван, 1990), IX Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание лекарственных средств" (Юрмала, I991)Международной конференции "International conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy or AIDS" (Новосибирск, Академгородок, 1991), IV Всесоюзном симпозиуме "Изучение и использование солодки в СССР" (Алма-Ата, 1991), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992).
Наличие анти-ВИЧ активности найденных нами новых препаратов (ниглизин, энциклан, олигонуклеотид РМ-20) было подтверждено экспериментально в Кембриджском университете, в Национальном институте биологических стандартов и контроля, в Центре по сотрудничеству при Медицинском Исследовательском Совете (Лондон).
- 8 -Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ.