Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Мобильные элементы 14
1.2 Классификация мобильных элементов 15
1.3 Особенности структуры и процессы перемещения non-LTR ретротранспозонов 1.3.1 Ретротранспозон Bov-B LINE 18
1.3.2 История открытия ретротранспозона Bov-B LINE 19
1.3.3 Особенности структуры и распространённость ретротранспозона Bov-B LINE 20
1.3.4 Особенности, функциональная и эволюционная роль
апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы и обратной транскриптазы у эукариот 1.4 Горизонтальный перенос 29
1.5 Использование ретротранспозонов в качестве генетических маркеров 33
1.6 Использование микросателлитных ДНК в качестве генетических маркеров 34
1.7 Однополые позвоночные 35
1.8 Партеногенетические виды рептилий 37
1.9 Партеногенетические Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia 1.9.1 Биогеография 39
1.9.2 Происхождение партеновидов 41
1.9.3 Изучение генетической изменчивости и клонального разнообразия 43
1.9.4 SINE-маркеры для изучения филогении у рептилий 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Коллекционные образцы ДНК 47
2.2 Методы исследования 47
2.2.1 ПЦР-амплификация 47
2.2.2 Электрофоретическое фракционирование ПЦР-амплификантов в агарозном геле 48
2.2.3 Фракционирование продуктов в ПААГ 49
2.2.4 Выделение амплификантов из геля и получение рекомбинантных ДНК 50
2.2.5 Молекулярное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках E. coli 50
2.2.7 Секвенирование рекомбинантных клонов 52
2.3 Статистическая и биоинформатическая обработка данных 52
Глава 3. Результаты 54
3.1 Определение первичной структуры ДНК ретротранспозона Bov-B LINE у трёх видов ящериц рода Darevskia 54
3.2 Анализ внутри- и межгеномного полиморфизма ретротранспозона Bov-B LINE у партеновида D. unisexualis и предполагаемых родительских видов D. nairensis и D. valentini. 61
3.3 Филогенетическая дифференциация трёх видов ящериц на основании полиморфизма Bov-B LINE 71
3.4 Филогенетические взаимосвязи между ящерицами рода Darevskia и другими рептилиями, выявленные на основании полиморфизма Bov-B LINE 77
3.5 Сравнение нуклеотидных последовательностей и анализ внутри- и межгеномного полиморфизма микросателлитного локуса Du47D ядерного генома у однополых и двуполых видов ящериц Darevskia 79
3.6 Анализ физико-химических свойств аминокислотных замещений в доменах AP-EN и RT ретротранспозона Bov-B LINE у трёх видов ящериц Darevskia 83
Глава 4. Обсуждение результатов 105
Заключение 117
Выводы 119
Список литературы
- Особенности структуры и процессы перемещения non-LTR ретротранспозонов 1.3.1 Ретротранспозон Bov-B LINE
- Электрофоретическое фракционирование ПЦР-амплификантов в агарозном геле
- Секвенирование рекомбинантных клонов
- Сравнение нуклеотидных последовательностей и анализ внутри- и межгеномного полиморфизма микросателлитного локуса Du47D ядерного генома у однополых и двуполых видов ящериц Darevskia
Особенности структуры и процессы перемещения non-LTR ретротранспозонов 1.3.1 Ретротранспозон Bov-B LINE
Ретротранспозоны были найдены в геномах всех эукариотических таксонов. Они могут в большей степени способствовать изменению структуры генома, чем другие источники разнообразия, такие как ошибки ДНК-полимеразы, приводящие к однонуклеотидному полиморфизму (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), поэтому необходимо изучать их структуру и механизмы перемещения (Adelson et al., 2015).
Ретротранспозоны кодируют собственный внутренний промотор и могут содержать одну или две открытие рамки считывания (Open-Reading Frame, ORF) (Eickbush & Jamburuthugoda, 2008; Adelson et al., 2015). Процесс ретротранспозиции non-LTR элементов инициируется эндонуклеазным доменом, который разрезает одну нить ДНК в сайте-мишени и создаёт 3 -гидроксильный конец, который используется как затравка для обратной транскрипции мРНК ретротранспозона в ДНК (Luan et al., 1993; Eickbush, 2002; Fujiwara, 2015). Этот уникальный процесс, механизм ретротранспозиции LINE-элементов (target primed reverse transcription, TPRT), характерен исключительно для non-LTR ретротранспозонов.
Эти ретротранспозоны были разделены на две большие группы, основываясь на их структурных и филогенетических особенностях (Malik et al., 1999; Kapitonov et al., 2009). Ретротранспозоны первой группы кодируют эндонуклеазу рестрикции (restriction enzyme-like endonuclease, RLE) в C-терминальной области единственной ORF (Yang et al., 1999). Функциональная роль эндонуклеазы типа RLE при выборе специфического сайта встраивания до сих пор до конца не ясна (Volff et al., 2001; Mandal et al., 2004; Shivram et al., 2011), и сайт-специфичный выбор осуществляется в основном за счёт ДНК-связывающих последовательностей. Ретротранспозоны другой группы обычно кодируют эндонуклеазу, которая гомологична апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазе (АП-эндонуклеазе, APE) в одной из двух её ORF (Feng et al., 1996). Сайт-специфичный выбор определённых последовательностей non-LTR ретротранспозонов в основном определяется доменом эндонуклеазы типа APE (Zingler et al., 2005). Большинство копий LINE-элементов усечены в своей длине на 5 -концах кодирующей нити, вероятнее всего, потому, что обратная транскрипция часто терминируется до завершения процесса на первой нити ДНК (Finnegan, 2012).
Ретротранспозоны широко распространены в геномах многоклеточных организмов (Fujiwara, 2015). Большинство ретротранспозонов интегрируются в случайных сайтах в геноме хозяина, но у некоторых есть определенные последовательности для встраивания. Большинство APE-кодирующих non-LTR ретротранспозонов не имеют определённых последовательностей для встраивания, но есть слабая специфичность для интеграции. Определённая направленность для интеграции у ретротранспозонов считается симбиотической стратегией, которая позволяет распространяться по геному хозяина, не вызывая повреждения основных генов хозяина. Противоположной стратегией считается случайное, паразитическое встраивание МЭ в геном хозяина. Копийность этих последовательностей считается основным показателем ограничения специфичности non-LTR ретротранспозонов (Kojima & Fujiwara, 2004; Fujiwara, 2015).
Ретротранспозон Bov-B LINE (Bov-B) принадлежит к обширному семейству LINE и обнаружен в геномах некоторых млекопитающих и рептилий. Высокое нуклеотидное сходство последовательностей этого элемента у значительно дивергировавших видов, а также мозаичный характер распределения в пределах класса рептилий и жвачных животных, предполагают наличие нетрадиционного механизма распространения Bov-B, а именно горизонтального переноса (ГП) (Kordi & Gubenek, 1999a; Walsh et al., 2013). Кроме того, недавно фрагмент RT этого элемента обнаружен в геноме нескольких видов кавказских скальных ящериц рода Darevskia (Мартиросян и др., 2006). В состав этого видового комплекса входят наряду с бисексуальными видами и несколько партеногенетических видов, полученные за счёт скрещивания двуполых родительских видов (Даревский, 1967). Поэтому весьма перспективной и интересной может оказаться информация о динамике и эволюции Bov-B при исследовании этой природной модели сетчатого видообразования.
Отдельные фрагменты Bov-B были впервые обнаружены в геноме быка, и затем найдены в геноме других жвачных домашних животных – козы, овцы и буйвола (Ruminantia). Одни исследователи предполагали, что эти последовательности являются аналогами Alu-элементов, и предложили называть их art2 (Duncan, 1987), или отряд-специфичными SINE-элементами (Lenstra et al., 1993). Другие исследователи считали, что эти последовательности входят в состав более крупных диспергированных повторов ДНК (Majewska et al., 1988; Smit, 1996; Okada & Hamada, 1997; Okada et al., 1997), и предложили называть их Pst (Majewska et al., 1988).
В дальнейшем было показано, что в геноме быка они представляют семейство повторяющихся последовательностей длиной около 3.1 т.п.н., которые кодировали собственную обратную транскриптазу, т.е. являлись LINE-элементами. Полагали, что последовательности из этого семейства могли быть мутантными или усечёнными МЭ, и распространялись по геному посредством сайт-специфичного распознавания с Alu-подобным димером, за что эта группа получила название сначала BDDF (bovine dimer-driven family), а затем – ретротранспозоны Bov-B из семейства LINE (Szemraj et al., 1995).
Bov-B считался специфичным только для жвачных (Jobse et al., 1995; Modi et al., 1996), пока не была обнаружена 5 -усеченная копия Bov-B у носатой гадюки (Vipera ammodytes). Фрагмент ретротранспозона входил в состав одного из четырех интронов в двух генах (аммодитин L и аммодитоксин C) токсина фосфолипазы A2 (PLA2). Количество его копий в геноме гадюки составило 62000-75000, а средняя гомология с Bov-B быка достигала 75%. Затем этот ретротранспозон удалось детектировать у других змей из разных семейств (Kordi & Gubenek, 1997, 1998; Castoe et al., 2011), у геконообразных (Gekkota) и у различных видов ящериц из подотряда Ящериц (Sauria). Во всех этих исследованиях, несмотря на высокое сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей МЭ у представителей разных классов, Bov-B оказался удобным филогенетическим маркером для разделения не только жвачных и рептилий, но и для дифференциации представителей разных семейств змей. На основании сравнения распределения копий Bov-B у представителей разных таксонов показано, что исходно Bov-B появились в геномах рептилий, а 140–210 млн. лет назад произошла их основная амплификация. Позднее, а именно 40–50 млн. лет назад, они внедрились в геном жвачных путем горизонтального переноса. Одним из возможных векторов для переноса ретротранспозона между разными классами позвоночных могли служить иксодовые клещи (Kordi & Gubenek, 1997, 1998, 1999a, b; Adelson et al., 2009; Walsh et al., 2013).
Электрофоретическое фракционирование ПЦР-амплификантов в агарозном геле
На сегодняшний день известно, что только четыре двуполых вида рода Darevskia из 32 являются основателями семи партеногенетических видов и поддерживают процессы сетчатой эволюции (Murphy, 2000; Аракелян, 2012; Uetz & Hoek, 2016).
Скрещивания одних и тех же родительских форм в разных сочетаниях приводили к возникновению различных партеногенетических гибридных видов (Даревский, 1993). Однополые виды воспроизводят путем партеногенеза и не нуждаются в повторных актах гибридизации (Fu et al., 2000). Многие аллозимные и молекулярно-генетические исследования дают основания предполагать, что каждый партеногенетический вид появился в результате гибридизации небольшого количества особей (Tarkhnishvili, 2012). Все однополые виды ящериц рода Darevskia аллопатричны со своими родительскими формами на большей части ареала. Однако местами между ними сохраняются зоны симпатрии, в которых обычно возникают стерильные триплоидные гибриды обоих полов, получающие два генома от партеногенетической матери и один геном от отца (Даревский, 1993).
Низкое генетическое разнообразие в роде Darevskia даёт основания предполагать, что прошло мало времени в эволюционном масштабе с момента их возникновения для появления различимого генетического разнообразия между партеногенетическими популяциями (Moritz et al., 1992; Tarkhnishvili, 2012). Возраст партеновида оценивается не более чем 10 тыс. лет (Darevsky et al., 1985).
Учитывая необходимость внутривидовой конкуренции и более высокой конкурентоспособности у однополых форм в определённых пространственно-временных условиях (Tarkhnishvili et al, 2010), партеногенетики могут вытеснить родительские виды в смежных ареалах и вызывать вторичное аллопатрическое видообразование, предотвращая последующую гибридизацию и распространение новых клонов. Этот механизм объясняет ограниченное число партеновидов и отсутствие генетического разнообразия материнских линий у каждой формы (Tarkhnishvili, 2012).
Несмотря на большое разнообразие видов скальных ящериц, они характеризуются сходной средой обитания, а также окраской и рисунком туловища (Tarkhnishvili, 2012). В настоящее время внутривидовое генетическое разнообразие у партеногенетических рептилий объясняют тремя основными причинами: мутации, возможная рекомбинация генетического материала и многократные акты гибридизации, т.е. однополые формы ведут своё начало от нескольких гибридных самок (Moritz et al., 1989a; Куприянова, 2014). Например, изучая генетическое разнообразие партеногенетических видов рода Darevskia с использованием микросателлитных маркеров, одни авторы склонялись в пользу рекомбинаций и мутаций (Fu et al., 1998), а другие – к многократным актам межвидовой гибридизации и последующим мутациям в микросателлитных локусах у исходных клональных особей (Vergun et al., 2014; Manrquez-Morn et al., 2014).
Около 40% партеногенетических рептилий являются полиплоидными, что является распространённым явлением, однако большинство видов ящериц рода Darevskia являются диплоидными с 38 акроцентрическими хромосомами (2n=38) и дифференцированными половыми хромосомами (Куприянова, 2009; Kearney, 2010). В лабораторных условиях удавалось скрестить двуполые виды (D. valentini и D. armeniaca), в результате чего появлялись стерильные триплоидные гибриды (все триплоиды в роде Darevskia стерильны). Но другие подобные эксперименты не были успешными. Так, скрещивание D. mixta и D.valentini, родительских форм для D. armeniaca, давало слабое и нежизнеспособное потомство (Danielyan, 1981). Экспериментальный повтор событий исторической гибридизации не предполагает появления партеногенетического потомства (Murphy et al., 2000). Кроме того, предполагается, что некоторые цитогенетические механизмы, такие как хромосомные, геномные и функциональные нарушения, могут вызвать генетическую изменчивость гибридных партеногенетических видов. Эти нарушения приводят к возникновению do novo аллелей, которые отсутствовали у родительских форм, а соответственно и к появлению новых клонов (Куприянова 1999, 2014). Однако в некоторых районах Армении, помимо диплоидных, наблюдаются триплоидные и даже тетраплоидные особи (Danielyan et al., 2008). Так, в симпатрической зоне в районе деревни Кутчак каждый год появляются большое количество гибридов. Большинство из них представлены стерильными триплоидными самками (3n=57) (Darevsky & Kulikova, 1964), хотя среди них встречаются и самцы-гибриды, и интерсексуальные формы, а также, возможно, и нестерильные самки-гибриды с развивающимися фолликулами и яйцами. Некоторые триплоидные самцы имеют развитые гонады, и, возможно, способны к размножению. Одна из особей тетраплоидного самца была внешне схожа с триплоидыми формами, и его наличие подразумевает способность к размножению у триплоидных гибридных самок или самцов. Таким образом, появление способных к размножению современных полиплоидных гибридов может привести к возникновению новых форм и видов ящериц рода Darevskia (Danielyan et al., 2008). Продолжительность жизни у изученных гибридов и родительских форм достигает 6-7 лет (Arakelyan, 2002), а половая зрелость у двуполых и партеногенетических видов наступает во второй или в третий год жизни (Arakelyan & Danielyan, 2000; Arakelyan, 2002).
В целом партеногенетические формы генетически менее разнообразны, чем двуполые родительские виды (Murphy et al., 2000). Филогения ящериц рода Darevskia была воссоздана с использованием данных митохондриальной ДНК и аллозимного анализов, результаты которых подтвердили их монофилетическое происхождение. Все изученные двуполые виды формировали три основных клады: caucasica, saxicola и rudis. Обнаружены отдельные противоречия между данными митохондриального и аллозимного анализов, которые можно объяснить генетической интрогрессией. Однако показано, что только представители двух последних клад принимали участие в гибридизации, приводившей к появлению партеногенетических видов. Важно, что только скрещивание между представителями разных клад приводили к формированию однополых видов. При этом представители клады caucasica всегда являлись «материнскими» видами, а представители клады rudis – «отцовскими». Возможным объяснением таких событий может быть исходно разная генетическая изменчивость в каждой из клад, приводящая к ограничениям в половом размножении (рисунок 8) (Murphy et al., 2000).
Короткие диспергированные повторы (SINE) являются надежными и информативными молекулярными маркерами для изучения филогении многих видов эукариот (Shedlock & Okada, 2000; Grechko et al., 2010). Их длина варьирует от 70 до 500 п.н., а количество копий на геном может составлять десятки и сотни тысяч. Данные маркеры могут быть использованы для изучения филогении у рептилий, для уточнения спорных вопросов об их систематике (Shedlock & Okada, 2000; Grechko et al., 2010). Так, для определения пригодности SINE-маркеров для изучения филогении у рептилий были поставлены реакции ПЦР с праймерами, специфичными для последовательностей, фланкирующих SINE-элементы для группы Веретеницевых ящериц (Anguidae) (Piskurek et al., 2006). Использованные в этом эксперименте локусы Sauria SINE оказались пригодными для отслеживания эволюционных изменений у рептилий.
Существуют три основных подхода по использованию SINE-маркеров для изучения филогении у эукариот (Serdobova & Kramerov, 1998; Veniaminova et al., 2007; Grechko et al., 2010). При первом подходе оценивают наличие или отсутствие семейства SINE в одном или нескольких таксонах («метод семейств»). При втором подходе анализируют общие локус-специфичные копии и степени их дивергенции («метод копий») (Okada et al., 2004; Wang & Kirkness, 2005; Ray et al., 2006; Piskurek er al., 2006). При третьем подходе учитывают, что SINE-семейства могут состоять из несколько разных подсемейств, начало которым дают небольшое количество отдельных «главных» копий (Kramerov & Vassetzsky, 2005; Piskurek et al., 2006). Этот подход можно обозначить как «метод подсемейств» (Veniaminova et al., 2007).
Секвенирование рекомбинантных клонов
Все партеновиды рода Darevskia являются близкородственными, поскольку произошли от четырёх двуполых видов в результате различных комбинаций межвидовой гибридизации. Интересно проследить, как варьируют аллельные варианты одного локуса у разных видов скальных ящериц, в том числе однополых и их родителей. На рисунке 17 представлено схематическое изображение тех участков аллельных вариантов микросателлитсодержащего локуса Du47D, по которым они различаются у изученных партеногенетических представителей и двух двуполых видов рода Darevskia. Было проведено сравнение структурных вариаций аллелей Du47D и их встречаемости у партеновидов. Кроме того, данные о внутри- и межгеномном полиморфизме микросателлитного локуса Du47D у партеновида D. unisexualis и предполагаемых родительских двуполых видов D. nairensis и D. valentini, полученные ранее (Корчагин и Токарская, 2010), были сопоставлены с данными о полиморфизме ретротранспозона Bov-B LINE для установления их взаимной согласованности.
Вариабельные участки аллелей локуса Du47D у четырёх однополых видов: D. dahli, D. armeniaca, D. rostombekovi и D. unisexualis и двух двуполых видов D. nairensis и D. valentini. Точками обозначены консервативные участки, дефис – единичные нуклеотидные делеции, (––) – область делеции 14 нуклеотидов. Нумерация дана относительно начала (AAT)n-кластера. В скобках 1– 7 – номера аллельных вариантов. Согласно полученным данным, все исследованные особи D. armeniaca и D. dahli гетерозиготны по Du47D, а сам локус представлен тремя и четырьмя аллельными вариантами соответственно, различающимися как структурой микросателлита – количеством (AAT)n-повторов, так и нуклеотидными заменами в прилежащих областях ДНК. Сочетание однонуклеотидных вариаций вне микросателлита логично рассматривать как специфический маркер, наследуемый аллелем гибридного генома партеновида от родительского генома двуполого вида. При этом, ассоциированный с этими однонуклеотидными вариациями микросателлитный кластер также наследуется этим аллелем от того же родительского вида, образуя единый аллель-специфический маркер. У D. armeniaca локус представлен тремя аллельными вариантами, два из которых имеют одно сочетание маркеров, а третий аллель по своей молекулярной структуре имеет другое сочетание маркеров. Вероятнее всего первые два аллеля происходят от одного родительского предкового вида, а третий аллель наследован от второго родителя. Третий аллельный вариант встречается у всех исследованных особей вида и является мажорным. У D. dahli локус представлен четырьмя аллельными вариантами. Три аллеля по своей молекулярной структуре относятся к одному типу, а четвёртый аллель представлен другим типом. И в этом случае разные типы аллелей происходят от разных предковых родительских видов. При этом четвёртый аллель встречается у всех, а третий аллель у большинства исследованных особей, и оба являются мажорными. В популяциях D. rostombekovi Du47D оказался мономорфным и представлен только одним аллельным вариантом с микросателлитным кластером, содержащим восемь (AAT)-повторов. Его структура полностью соответствует третьему аллелю D. dahli, за исключением нескольких видоспецифических замен тимина на цитозин. Наличие единственного аллеля, возможно, связано с тем, что другой аллель не амплифицируется в используемой системе ПЦР-анализа. У D. unisexualis локус представлен четырьмя аллельными вариантами, второй и третий из которых являются мажорными и встречаются во всех популяциях партеновида. Два других аллеля встречаются в отдельных популяциях. Таким образом, впервые получена информация о молекулярной природе структурных вариаций аллелей Du47D и их встречаемости у трёх партеновидов: D. dahhi, D. armeniaca и D. rostombekovi. Обнаруженные у разных партеновидов аллели с одинаковыми сочетаниями однонуклеотидных вариаций, но различающиеся по числу повторяющихся мономеров в микросателлите, отражают тенденцию сетчатого видообразования разных партеногенетических форм посредством гибридизации одних и тех же двуполых видов.
При сравнении D. unisexualis с предполагаемыми родительскими двуполыми видами D. nairensis и D. valentini можно заметить, что у партеновида половина аллелей имеют некоторые видоспецифичные точковые замены и индели, характерные для отцовского вида, а половина имеют некоторые замены и индели, встречающиеся у материнского вида. Это говорит о происхождении D. unisexualis как результата межвидовой гибридизации особей D. nairensis и D. valentini и согласуется с данными анализа Bov-B LINE. Аллельные варианты двуполых видов больше отличаются друг от друга по сравнению с однополыми видами, у которых не происходит рекомбинации, в отличие от ретротраспозона Bov-B LINE, где наблюдается обратная тенденция. Они характеризуются большей вариабельностью (AAT)n-звеньев микросателлитного кластера и более сложными преобразованиями нуклеотидных последовательностей, фланкирующих микросателлитный кластер, в том числе инделями, видоспецифическими и единично-случайными нуклеотидными заменами. Наиболее разнообразны аллели у D. nairensis, популяции которого весьма гетерогенны, а также могут включать и представителей популяций D. raddei (D. raddei raddei и D. raddei nairensis).
По результатам сравнения аллельных вариантов Du47D изученных видов рода Darevksia можно сказать, что в целом этот локус относительно мало изменчив. Число звеньев (AAT)n-микросателлитного локуса варьирует как в пределах одного вида, так и при сравнении всех видов. Однако данный показатель не является чётким диагностическим признаком, т.к. эти вариации могут быть вызваны ошибками репликации у каждого из представленных видов. Тем не менее, выявленные маркеры позволяют устанавливать происхождение партеновида от конкретных родительских видов, а в сочетании с молекулярно-генетическими характеристиками ретротранспозона Bov-B LINE решать многие функциональные проблемы происхождения и эволюции однополых и двуполых видов животных.
Сравнение нуклеотидных последовательностей и анализ внутри- и межгеномного полиморфизма микросателлитного локуса Du47D ядерного генома у однополых и двуполых видов ящериц Darevskia
Поэтому для дальнейшего анализа мы использовали аминокислотные остатки, кодированные несинонимичными нуклеотидными заменами. При этих расчётах явно преобладали замещения, вызванные мутациями в первом и втором положении триплета, с небольшим перевесом числа замен во втором положении. Причём замещения, относящиеся к третьему классу (т.е. с изменением гидрофобности), наиболее часто ассоциированы с мутациями во втором положении кодона. Исключение составили единичные замещения в домене RT, где число мутаций в первом и втором положении кодонов практически одинаково. Таким образом, аминокислотные замещения в подавляющем большинстве случаев вызваны мутациями по второму нуклеотиду триплета. Бльшая часть замещений не приводили к изменению сродства к воде и являлись консервативными, причём такая тенденция наблюдалась у всех трёх видов в обоих функциональных доменах. Таким образом, несмотря на произошедшие замены, транслируемые белки RT и AP-EN сохраняют в большинстве копий свою биологическую функцию. Ряд таких замещений, несмотря на существенное изменение физико-химических свойств, могут приводить и к появлению мутантных белков с неполностью подавленной функцией. Эти эффекты зависят, вероятно, от локализации единичных замещений в различных функционально-значимых областях двух полипептидов. По своей значимости их, как и большинство обнаруженных нами синонимичных замен, можно отнести к разряду «молчащих».
Помимо анализа возможных функциональных последствий единичных замещений, необходимо более детально рассмотреть множественные аминокислотные замещения, которые не учитывались при проведении статистических расчётов. Их число невелико и составляет шесть в домене RT и четыре в домене AP-EN. В домене RT у D. unisexualis и у материнского вида D. nairensis обнаружена идентичная единичная консервативная замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту (105 а.о.) и глутамина на пролин (233 а.о.) (см. таблицу 11), соответственно. В тех же положениях у отцовского вида D. valentini имеется радикальные замены аспарагиновой кислоты на аланин и глутамина на глутаминовую кислоту соответственно. Такое распределение аминокислот подтверждает возможное наследование вызывающих их мутации у гибридного вида D. unisexualis от материнского вида D. nairensis. Наследование аминокислоты в 129 положении у гибрида идёт с замещением аргинина на гистидин, как у материнского вида, и с замещением аргинина на цистеин, как у отцовского вида. Два разных аминокислотных замещения обнаружены по 176 положению. Одно из них (гистидин на аргинин) является консервативным без изменения сродства к воде, а замещение гистидина на цистеин является радикальным с изменением гидрофобности. Эти замещения наблюдаются сразу в нескольких внутригеномных копиях, и их распределение у трёх видов также свидетельствуют о происхождении D. unisexualis от двуполых родительских видов D. nairensis и D. valentini. В домене AP-EN обнаружены четыре случая множественных замещений. В 33 положении для всех трёх видов характерно замещение аргинина на лизин, и только в одной копии D. nairensis обнаружено замещение аргинина на триптофан. По 3 сайту у всех трёх видов найдены замещения валин-изолейцин, и только в одной из копий D. valentini найдена замена валина на треонин. Вторая специфичная только для D. valentini замена гистидина на аспарагин найдена при сравнении трёх видов по 122 сайту. Все три вида характеризуются присутствием в этом положении либо гистидина, либо глицина. А вот по 93 сайту все три вида характеризуются наличием аргинина, и только в единичных копиях у D. valentini аргинин замещается на лейцин или глицин.
Все эти замещения, как единичные, так и множественные, являются результатом действия стабилизирующего отбора. Большинство этих замещений в каждом из двух доменов относятся к селективно нейтральными и не приводят, вероятно, к изменению основных функций AP-EN и RT. При этом очевидно, что возникновение аминокислотных замещений у двуполых родительских видов можно объяснить не только накоплением мутаций, но и рекомбинацией при половом размножении. Гибридный вид лишен такой возможности при партеногенетическом размножении, поэтому он обычно сохраняет в себе унаследованные материнские и/или отцовские замещения. Его генетическое разнообразие поддерживается в условиях отсутствия рекомбинации именно за счет вертикального наследования одновременно двух родительских копий.
Все наши рассуждения базируются на сравнительном анализе ограниченной выборки неполных копий ретроэлемента Bov-B у трёх особей ящериц рода Darevskia, поэтому их можно рассматривать лишь как предварительные. Для более детального анализа последствий действия стабилизирующего отбора на встроенные в геном ящериц МЭ необходимы более многочисленные выборки полноразмерных копий для нескольких геномов каждого из трёх видов ящериц. Ящерицы рода Darevskia являются удобной и перспективной моделью для изучения эволюции однополого размножения.
Локализация Bov-B в геноме ящериц, определение его копийности и возможных функций в будущем можно получить лишь на основании полногеномного секвенирования. Тем не менее, данная работа является необходимым этапом для комплексного изучения видообразования ящериц рода Darevskia. Представленная нами информация о структуре внутригеномных копии необходима для выявления возможной активности и особенностей дивергенции ретротранспозона как в геноме представителей родительских видов, так и гибридного партеновида.