Введение к работе
Актуальное п. проблемы Выполнение программы Всемирной Организации Здравоохранения " К 2000 году здоровье для всех", а тагоке разработка концентрированных противовирусных вакцин потребует значительных количеств клеточной массы. В настоящее время для производства оолыпинстпа таких препаратов используют первичные культуры клеток, получаемые из эмбрионов птиц и тканей почек млекопитающих: обезьян, сирийских хомяков, морских свинок, кроликов и других животных. Эти клеточные системы часто контамипированы посторонними агентами, неоднородны, у них варьирует чувствительность различных партий культур клеток, полученных от животных одного вида, к одному и тому же вирусу. Кроме этого недостаток животных - доноров ткани и высокая их стоимость не позволяют рассматривать первичные культуры как перспективный и безопасный субстрат для производства биологических препаратов. Перечисленных недостатков лишены линии перевиваемых клеток, контроль которых проводят в процессе их установления с одновременной закладкой банка посевных клеток, способного обеспечить любое круппосерийное производство. Наиболее безопасными признаны линии диплоидных клеток, что связано с устойчивостью их биологических свойств, происхождением из нормальных тканей и препараты, полученные на их основе,не нуждаются в очистке от клеточной ДНК. Разработана международная регламентированная система получения и контроля, обеспечивающая производство качественных субстратов. За рубежом с использованием линий диплоидных клеток получены вакцины против полиомиелита, корн, краснухи, бешенства, гепатита и различные диагностические препараты.
Наиболее полное удовлетворение запросов производства иммунобиологических препаратов может быть достигауто за счет применения линий гстероплоидных клеток, полученных из тканей здоровых животных. Эти линии обладают неограниченным сроком жизни вне организма, чувствительностью к широкому спектру вирусов, меньшей требовательностью к условиям культивирования. Использование гетероплоидных клеток дает возможность применять передовые технологии для их выращивания, в частности, на микроносителях в условиях автоматического контроля и управления всеми жизнешюважпыми параметрами. Единственным недостатком этих клеточных систем является необходимость освобождения приготовленных на них вакцин от клеточной ДНК.
На основании вышеизложенного расширение набора линий диплоидных и гетероплоидных клеток с побробно изученными морфобиологичесхими и генетическими свойствами и отконтролированных на безопасность, способных расти на отечественных средах и сыворотках позволяет решить задачу накопления стандартных субстратов для производства иммунобиологических препаратов.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в получении н характеристике линий диплоидных и гетероплоидных клеток почек эмбрионов овец и новорожденных ягнят, разработке и выборе надежных контролен безопасности этих субстратов. Изучение возможности использования новых линий в качестве стандартных систем в научно-экспериментальных исследованиях и в практической деятельности.
и
Для выполнения поставленной дели решались следующие основные задачи.
1. Установление линий перевиваемых клеток почек эмбрионов овец и
новорожденных ягнят и изучение их морфобиологических свойств.
2. Определение чувствительности полученных линий клеток к
заражению различными вирусами. Предложение клеточных систем для
вирусологический исследований.
3. Выбор линий, перспективных для практической работы, полная
характеристика их свойств, проведение контроля безопасности в соответствии с
международными и национальными требованиями к вакцинным субстратам.
Научная новизна работы
1. Установлены и впервые охарактеризованы в соответствии- с
требованиями ВОЗ и ГИСК им. Л.А.Тарасевича две лилии клеток почек
новорожденных ягнят (91 и 574) и эмбриона овцы (41). Показало, что они
обладают свойствами, характерными для линий диплоидных клеток, не
содержат посторонних агентов, не имеют оикогенных потенций. Получена
новая линия гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы 4184, которая также
охарактеризована в отношении безопасности согласно требованиям ВОЗ и
ГИСК к вакцинным клеточным субстратам и полностью им удовлетворяет.
2. Впервые на крупных выборках установлены количественные
цитогенетические параметры первичных культур клеток почек овец,
необходимые при оценке линий диплоидных клеток и уровней гипер- и
полиплоидии гетероплоидной линии клеток животных этого вида.
3. Впервые предложен и проведен контроль клеток почек овец на
наличие агента скрепи.
Практическая ценность Линия 91 защищена авторским свидетельством №1427827 (1988 г.). Она предложена в качестве субстрата для размножения вакцинного штамма вируса кори ЭШЧ. Составлена Инструкция на изготовление соответствующей вакцины, одобренная Ученым Советом И11ВЭ им. МЛ. Чумакова РАМН 7 июля 1989 года.
На линию 4184 получен Патент РФ № 1559700 (1993 г.). С использованием клеток линии 4184 изготовлены диагностикумы клещевого и японского энцефалитов. Разработала методика культивирования клеток этой линии на микроиоси гелях в спйннерах "Биотех М" и "Techne", что позволит при необходимости масштабировать процесс репродукции клеток.
Установление трех новых линий диплоидных клеток почек новорожденных ягнят и эмбриона овны (41, 91, 574), а также линии гетерошюидных клеток 4184 увеличивает число отечественных стандартных клеточных субстратов, которые растут на доступных средах и сыворотках и могут быть использованы вместо первичных культур как для лабораторных исследований, так и для изготовления иммунобиологических препаратов. Созданы банки рабочих и посевных клеток этих линий, сохраняемые в криоконсервированпом состоянии.
Публикация результатов исследования и апробация работы По теме диссертации опубликовало 14 работ. Получено одно авторское свидетельство и один Патент РФ. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ утверждены Методические рекомендации по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи (23.08.96). Материалы доложены на И Всесоюзной конференции по
криобиологии и медицине, Харьков, 1984, на П, III и IV Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1985, 1990,1994.
Апробация работы состоялась на заседании Ученого Совета ИПВЭ им. М.И. Чумакова РАМН 17 июня 1996 года.
Объем и структура работы