Введение к работе
Актуальность работы. Вирусные гепатиты в настоящее время являются іной из важнейших проблем инфекционной патологии человека. В первую іередь это относится к парентеральным вирусным гепатитам В и С, однако и ггеральные гепатиты А и Е вносят существенный вклад в эту проблему. Так, тример, в развивающихся странах с жарким климатом доля гепатита Е ютавляет более 50% всех случаев острого гепатита (Purcell R.H. etal. 1988).
Гепатит Е, ранее известный как энтеральный гепатит ни А ни В, в качестве імостоятельной нозологической формы был открыт в 1983 году М.С. Балаяном в іьітах с самозаражением (Balayan M.S. ег а/. 1983). Несмотря на сходство инических проявлений с другими вирусными гепатитами, заболевание, взываемое этим вирусом, характеризуется рядом особенностей. В их числе рывной характер эпидемических вспышек, которые могут охватывать десятки и іже сотни тысяч человек, отсутствие хронических форм заболевания, поражение основном лиц молодого и среднего возраста, выраженная сезонность подъема іболеваемости. Заражение наиболее часто происходит через употребление нтаминированной воды и значительно реже, чем при гепатите А, при контакте с іболевшими, поэтому редкими являются случаи семейной очаговости іболевания в эндемичных районах, и при завозе инфекции в неэндемичные ійоньї не происходит ее распространения. Особенностью гепатита Е является ікже высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со іертностью достигающей 20-40% (Bradley D.W. 1990). Гепатит Е выявляется в >лее, чем 60% всех случаев фульминантного гепатита ни А ни В ( Nanda S.K. et al. )94).
Недостаточно изучено присутствие антител к возбудителю инфекции -ірусу гепатита Е (ВГЕ) - у населения развитых стран с умеренным климатом, гносительно высокая (1-3%) частота серопозитивности при отсутствии іидемической заболеваемости не имеет аналогии с другими энтерально уедающимися вирусными инфекциями. Кроме того, антитела к этому вирусу >статочно часто обнаруживаются у регулярных доноров крови, отстраненных от жорства в связи с повышением уровня трансаминаз, медицинских работников, іркоманов, больных хроническими гепатитами В и С, первичной гепатоклеточной ірциномой, циррозом печени. Необычно высокая частота обнаружения антител к
ВГЕ у больных хроническим аутоиммунным гепатитом (до 46%) сочетается тяжелым поражением печени, быстро прогрессирующим в цирроз, что позволя предположить, что заражение ВГЕ может быть пусковым механизм! аутоиммунного процесса.
В последние годы участилась миграция населения из районов, зндемичні по гепатиту Е, в центральные области России, и вследствие этого возрос рк завоза этой инфекции. Этот факт, а также случаи обнаружения антител к вирусу лиц, проживающих в неэндемичных районах в условиях отсутств эпидемиологического процесса, свидетельствуют о необходимости изучен распространения вируса на территории России и природы феномена присутств антител в различных группах населения неэндемичных районов. Данные вопро невозможно изучать без надежных и доступных в экономическом отношен диагностических препаратов.
Отсутствие в нашей стране тест-систем для выявления антител к ВГЕ момент начала данной работы обусловило необходимость наших исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разрабої тест-систем для выявления антител к ВГЕ, предназначенных для диагносту вызываемой этим вирусом инфекции и проведения сероэпидемиологическ исследований.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
- провести анализ антигенной структуры белков вируса гепатита Е
определить в их составе антигеннс-значимые участки, способные индуцировг
образование антител;
синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам вируснс генома, кодирующим выбранные участки вирусных антигенов;
клонировать собранные из синтезированных олигонуклеотидов фрагмен генома ВГЕ в бактериальной системе;
создать и запатентовать векторную систему экспрессии рекомбинантн генов в клетках E.coli для получения препаративных количеств рекомбинантн антигенов;
используя разработанную векторную систему, получить бактериальн штаммы - продуценты рекомбинантных белков, содержащих антигенн
терминанты ВГЕ, и выделить рекомбинантные антигены в препаративных іичествах;
иммунологическими методами подтвердить специфичность полученных комбинантных антигенов и изучить их диагностическую значимость;
создать на основе рекомбинантных антигенов диагностические тест-:темы для обнаружения антител к вирусу;
- провести, используя разработанные тест-системы, сероэпидемилогические
зледования в эндемичных и неэндемичных по гепатиту Е районах.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Сконструирована и запатентована новая векторная система экспрессии комбинантных генов в клетках Escherichia coli, которую можно применять для пучения препаративных количеств рекомбинантных белков.
Получены бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантных пипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков, кодируемых ORF2 и ?F3 вируса гепатита Е штамма Бирма.
Изучена способность полученных рекомбинантных полипептидов язываться с антителами, содержащимися в сыворотках крови больных острым русным гепатитом из эндемичного района. Отобраны полипептиды с наиболее раженной антигенной активностью. Специфичность взаимодействия комбинантных полипептидов с антителами подтверждена с помощью нтетических пептидов - аналогов антигенов ВГЕ.
На основе отобранных полипептидов созданы первые отечественные агностические тест-системы «ВГЕ-скрин» и «ВГЕ-скан» для определения антител зирусу гепатита Е в сыворотках крови. Сравнительные испытания этих тест -стем и коммерческой тест - системы фирмы "Abbott" показали высокую зствительность и специфичность разработанных препаратов.
При помощи разработанных диагностических тест-систем впервые оведены серо-эпидемиологические исследования в районе, эндемичном по іатиту Е (южный Узбекистан), и в неэндемичных районах (г. Москва, г. Сургут, г. )йкоп). Получены новые данные об уровне заболеваемости гепатитом Е на цемичной территории и определена доля этой инфекции в этиологической эуктуре острых вирусных гепатитов в этом регионе.
Внедрение результатов в практику. С помощью тест-системы «ВГЕ скрин» обследованы все больные острым вирусным гепатитом (ОВГ), поступивц в течение 1993 года и в ноябре 1998 года в инфекционную больні Дехканабадского района Кашкадарьинской области Узбекистана. Таким образі дифференциальная диагностика ОВГ была дополнена обследованием на гепати в этом неблагополучном по данной инфекции районе.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработанная векторная система пригодна для экспресс
рекомбинантных генов в клетках E.coli, и её использование упрощает выделение
очистку рекомбинантных белков.
-
Синтезированные рекомбинантные антигены, содержащие антигени детерминанты вируса гепатита Е, способны связываться с антителами к виру содержащимися в крови больных.
-
Разработанные диагностические препараты пригодны для диагностк гепатита Е и проведения сероэпидемиологических исследований.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11-Международном вирусологическом симпозиуме (Sydney, 1999), на симпозиу FEMS (Стамбул, 2000), на VII съезде Всероссийского Общества эпидемиолоп микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), на общероссийской конференц "Острые кишечные инфекции вирусной и бактериальной природы" (Москва, 199 на Всероссийской конференции "Проблемы инфекционной патологии в регион Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998), международной конференции «Вирусные инфекции на пороге XXI веі эпидемиология и профилактика» (Санкт-Петербург, 1999), на конференф посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова "Актуальные проблеи медицинской вирусологии" (Москва, 19SS).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи и тези< семи докладов, получено четыре патента Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена і 107 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литератур