Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 МикроРНК 16
1.1.1 Механизмы регуляции микроРНК 17
1.1.2 МикроРНК онкогены и онкосупрессоры 19
1.1.3 Гены-мишени микроРНК, ассоциированные с канцерогенезом 1.2 Опухоли молочной железы 35
1.3 Опухоли головы и шеи
1.3.1 Опухоли щитовидной железы 38
1.3.2 Плоскоклеточные карциномы головы и шеи 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1 Характеристика исследуемого материала 43
2.1.1 Опухоли молочной железы 43
2.1.2 Опухоли щитовидной железы 44
2.1.3 Плоскоклеточные карциномы головы и шеи 44
2.2 Методы исследования 45
2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот 45
2.2.1.1 Выделение нуклеиновых кислот из операционных образцов 45
2.2.1.2 Выделение нуклеиновых кислот из материала, нанесенного на цитологические стёкла 45
2.2.2 Обратная транскрипция 46
2.2.3 ПЦР в реальном времени 49
2.2.4 Цифровая капельная ПЦР 51
2.3 Статистическая обработка результатов 53
2.3.1 Непараметрический коэффициент Манна-Уитни 53
2.3.2 Метод ROC – анализа 53
Глава 3. Результаты 56
3.1 Профилирование экспрессии микроРНК в опухолях молочной железы 56
3.1.1 Профиль экспрессии микроРНК в доброкачественных опухолях молочной железы. Операционный материал 56
3.1.2 Профиль экспрессии микроРНК в злокачественных опухолях молочной железы. Операционный материал 60
3.1.3 Сравнительный анализ уровней экспрессии между доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы. Операционный материал 63
3.1.4 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК
между различными молекулярно-генетическими подтипами рака молочной железы. Операционный материал 67
3.1.5 Сравнительный анализ уровней экспрессии между доброкачественными и злокачественными опухолями молочной железы. Цитологические препараты 70
3.1.6 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК между различными молекулярно-генетическими подтипами рака молочной железы методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Цитологические препараты .73
3.1.7 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК
между различными молекулярно-генетическими подтипами рака молочной железы методом цифровой капельной ПЦР. Цитологические препараты
3.2 Профилирование экспрессии микроРНК в опухолях щитовидной железы 83
3.2.1 Профиль экспрессии микроРНК в доброкачественных опухолях щитовидной железы 83
3.2.2 Профиль экспрессии микроРНК в злокачественных опухолях щитовидной железы
3.2.3 Сравнительный анализ уровней экспрессии между доброкачественными и злокачественными опухолями щитовидной железы.
3.3 Профилирование экспрессии микроРНК в плоскоклеточных карциномах гортани 91
3.3.1 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК между подгруппами опухолей с диагнозом плоскоклеточные карциномы
гортани с наличием и отсутствием метастаз 93
ГЛАВА 4. Обсуждение .96
4.1 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК в опухолевых новообразованиях различного генеза 96
4.2 Повышение точности и информативности цитологического и гистологического заключений путем анализа уровней экспрессии микроРНК 104
4.2.1 Сравнительный анализ уровней экспрессии миРНК в дооперационном и операционном материале доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы 104
4.2.2 Сравнительный анализ уровней экспрессии микроРНК в дооперационном и операционном материале различных молекулярно генетических подтипов рака молочной железы 107
Выводы 111
Список литературы
- Механизмы регуляции микроРНК
- Опухоли щитовидной железы
- Профиль экспрессии микроРНК в доброкачественных опухолях молочной железы. Операционный материал
- Повышение точности и информативности цитологического и гистологического заключений путем анализа уровней экспрессии микроРНК
Механизмы регуляции микроРНК
За последние 20 лет понимание роли миРНК в клеточных процессах преодолело путь от специфичной малой РНК последовательности у C.elegans до ключевого регуляторного участника развития множества заболеваний человека (Lee et al., 1993; Adams et al., 2008; Croce, 2009; Ali et al., 2011). Рак - это сложное заболевание, характеризующееся нарушениями регуляции генной экспрессии. Молекулярный канцерогенез является многоступенчатым процессом и условно подразделяется на инициацию, промоцию и прогрессию, сопровождаясь накоплением мутаций и эпигенетических изменений. Ключевыми участниками в процессе канцерогенеза являются онкогены и онкосупрессоры. Нарушения их экспрессии, вызванные мутациями, гиперметелированием или транскрипционными факторами является основными генетическими изменениями при канцерогенезе. В последнее время большое внимание привлекает регуляция экспрессии онкогенов и онкосупрессоров с помощью миРНК (Hayes et al.,2014). Однако и сами миРНК могут выполнять роль как онкогенов, так и супрессоров опухолевого роста, активно регулируя процессы роста и деления клеток, опухолевой инвазии и метастазирования (Wang, Olson, 2009; Kong et al., 2010; Shenouda, Alahari, 2012; Tang et al., 2012). Кроме того, миРНК участвует в таких процессах как апоптоз, ангиогенез и контроль иммунной системы (Jovanovic, Hengartner, 2006; Xiao,Rajewsky, 2009; Andorfer et al.,2011; Sasahira et al.,2012). МиРНК является онкогеном если регулирует экспрессию онкосупрессорных генов и наоборот, миРНК, регулирующие онкогены являются онкосупрессорами (Croce, 2009).
Онкогены. По литературным данным миРНК-21 выполняет роль онкогена в опухолях различного генеза. А именно, повышенный уровень экспрессии миРНК-21 в медулярном раке ЩЖ коррелирует с плохим прогнозом, метастазами и высоким уровнем кальцитонина (Pennelli et al., 2015). Высокий уровень экспрессии миРНК-21 в опухолях молочной железы коррелирует с низкой выживаемостью пациентов (Wang et al., 2015). В опухолях гортани уровень экспрессии миРНК-21 также коррелирует со стадией злокачественности процесса (Manikandan et al., 2015). Повышенная экспрессия онкогенных миРНК-221/222 коррелирует с развитием метастазов и инвазией в глиомах, при раке желудка, в опухолях предстательной железы, папиллярном раке щитовидной железы, раке гортани (Yang et al., 2011; Liu et al., 2012; Zhang et al., 2012; Acibucu et al., 2014; Kneitz et al., 2014; Yang et al., 2014). Снижение экспрессии онкогенной миРНК-155 способствует снижению пролиферативной активности и миграции в клетках опухоли почек (Li et al., 2012). Также миРНК-155 проявляет свои онкогенные функции путем подавления онкосупрессоров в таких типах опухоли как РМЖ, лимфомы, рак пищевода, глиомы, лейкозы, карциномы гортани (Chang et al., 2011; Pedersen et al., 2009; Zhang et al., 2014; Sun et al., 2014; Zeng et al., 2014). МиРНК-155 также способствует клеточной выживаемости и химиорезестентности при лечении РМЖ, подавляя онкосупрессоры SOCS1 и FOXO3a (Jiang et al., 2010; Kong et al., 2010).
Последние клинические исследования показали, что повышенная экспрессия миРНК-146b связана с плохой выживаемостью больных с диагнозом плоскоклеточный рак пищевода (Li et al., 2014). Так же повышенная экспрессия миРНК-146b является характеристикой злокачественных опухолей ЩЖ, а именно, ПР ЩЖ (Peng et al., 2014). В опухолях молочной железы повышенная экспрессия миРНК-146b отмечается в наиболее агрессивных подтипах, а именно при тройном негативном РМЖ (Elsarraj et al., 2012). Онкосупрессоры. МиРНК-205 является супрессором снижая пролиферативную и метастатическую активность раковых клеток, а также усиливает апоптоз в опухолях различного генеза, а именно, в опухолях гортани, молочной железы, опухолях предстательной железы, меланомах, плоскоклеточных опухолях пищевода (Matsushima et al., 2010; Adachi et al., 2011; Liu et al., 2012; Wang et al., 2013; Gandellini et al., 2014; Tian et al., 2014). Исследования, направленные на выяснение роли миРНК-205 в развитии клеток молочной железы показали, что уровень её экспрессия повышен в стволовых клетках молочной железы и в популяции миоэпителиальных клеток. Эти данные характеризуют миРНК-205 в качестве маркера эпителиальных клеток, участвующего в их развитии и дифференцировке (Avril-Sassen et al., 2009). Таким образом, повышенная экспрессия миРНК-205 является характеристикой нормальных клеток молочной железы и изменения её экспрессии могут провоцировать трансформацию стволовых клеток в раковые (Greene et al., 2010). Уровень миРНК-205 повышен во многих эпителиальных опухолях, таких как плоскоклеточные опухоли головы и шеи, рак мочевого пузыря и рак шейки матки (Gottardo et al.,2007; Fletcher et al.,2008; Wang et al.,2008). В свою очередь пониженный уровень миРНК-205 наблюдается на более поздних стадиях заболевания, характеризующегося процессами метастазирования и как следствие эпителиально-мезенхимальным переходом (Wu et al., 2009; Tran et al., 2013; Huo et al., 2016). МиРНК-126 является супрессором в таких видах рака, как: рак прямой кишки, рак желудка, рак печени, рак простаты и молочной железы (Ebrahimi et al., 2014).
Опухоли щитовидной железы
Реакцию обратной транскрипции для получения кДНК проводили в объеме 30 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «Реал Бест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Реакция обратной транскрипции содержала: 3 мкл выделенной РНК, 16.2 мкл 40% раствора трегалозы, 3 мкл 10х буфера для обратной транскрипции, 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,32 мкл обратной транскриптазы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), 1.5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для обратной транскрипции. Использованные праймеры приведены в таблице 2. Протокол проведения ОТ приведен ниже (рис.1). Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени на приборе CFX 96 (Bio-Rad, США).
Последовательности праймеров и зондов приведены выше. Реакцию проводили в объеме 30 мкл: 3 мкл полученной кДНК, 14 мкл H2O, 3 мкл 10х буфера для ПЦР (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора BSA, 1 мкл Taq-полимеразы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, США), 3 мкл раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Системы праймеров и зондов разработаны компанией ЗАО «Вектор-Бест» и эффективность реакции составляет 85-100%. Протокол реакции ПЦР на приборе CFX 96 (Bio-Rad, США) представлен ниже (рис.2). Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени проводился 2(-Ct) методом (Livak, Schmittgen, 2001). 1. Анализ изменеия относительного уровня экспрессии миРНК, измеренного методом ПЦР в реальном времени между образцами опухолевой и морфологически неизмененной условно нормальной ткани: Расчет относительного изменения уровня экспрессии миРНК в опухолевой ткани: миРНК опу оли С опу оли С , где Ct миРНК опу оли – пороговый цикл исследуемой миРНК при проведении ПЦР в реальном времени в опухолевом образце, Ct U6 опу оли – пороговый цикл референсного гена U6в опухолевом образце. Расчет относительного изменения уровня экспрессии миРНК в морфологически неизмененной (условно нормальной) ткани: миРНК норме С норме С , где Ct миРНК норме – пороговый цикл исследуемой миРНК при проведении ПЦР в реальном времени в условно нормальной ткани, Ct U6 норме – пороговый цикл референсного гена U6 в условно нормальной ткани. Изменеие уровня экспрессии миРНК между опухолевой и морфологически неизмененной тканями оцениволсь путем сравнительного анализа медианных значений С исследуемых подгрупп.
Анализ изменеия относительного уровня экспрессии миРНК, измеренного методом ПЦР в реальном времени между различными молекулярно-генетическими подтипами опухолей: Расчет относительного изменения уровня экспрессии миРНК у пациента с определенным молекулярно-генетическим подтипом опухоли: миРНК опу оли С опу оли миРНК норме норме С , где Ct миРНК опу оли – пороговый цикл исследуемой миРНК при проведении ПЦР в реальном времени в опухолевом образце, Ct U6 опу оли – пороговый цикл референсного гена U6 в опухолевом образце; где Ct миРНК норме – пороговый цикл исследуемой миРНК при проведении ПЦР в реальном времени в условно нормальной ткани, Ct U6 норме – пороговый цикл референсного гена U6в условно нормальной ткани.
Изменение уровня экспрессии миРНК между различными молекулярно-генетическими подтипами опухоли оцениволсь путем сравнительного анализа медианных значений С исследуемых подгрупп пациентов.
Профиль экспрессии микроРНК в доброкачественных опухолях молочной железы. Операционный материал
РМЖ относится к группе опухолей, клиническое течение которых зависит от экспрессии стероидных гормонов. Как следствие следующим этапом анализа экспрессии миРНК в опухолях молочной железы является профилирование миРНК в зависимости от молекулярно-генетического подтипа опухоли. Люминальный РМЖ характеризуется наличием РЭ и РП и как следствие, обладает благоприятным прогнозом ввиду наличия мишеней для проведения неоадъювантной терапии. Кроме того, в группе РМЖ выделяют опухоли, в которых не обнаруживаются рецепторы эстрогенов, прогестерона и не наблюдается амплификация гена HER-2, так называемый ТНРМЖ, отличающийся агрессивным течением заболевания (Perou, Sorlie, ,2000). На практике клиницисты сталкиваются с ситуациями, когда люминальные подтипы РМЖ, характеризующиеся наличием рецепторов эстрогенов, прогестерона и наиболее благоприятным течением, ведут себя крайне агрессивно, при этом заболевание быстро прогрессирует и нередко заканчивается летальным исходом. И наоборот, наиболее агрессивный рак с тройным негативным фенотипом может протекать индолентно годами и не требовать адъювантных терапевтических методов лечения. Всё это требует поиска дополнительных молекулярных маркеров, позволяющих прогнозировать развитие опухолей при различных молекулярно генетических подтипах РМЖ (Веряскина и др., 2015). Таким образом, на следующем этапе нашей работы мы определили вариабельность экспрессии миРНК в зависимости от молекулярно-генетического подтипа РМЖ.
С целью оценки изменений уровней экспрессии миРНК в операционных опухолевых образцах ТНРМЖ по отношению к люминальным подтипам РМЖ методом ОТ-ПЦР в реальном времени измерен уровень экспрессии миРНК -21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -200a в 7 операционных образцах с диагнозом ТНРМЖ и 42 операционных образцах с диагнозом люминальный А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ (табл.7). Мы наблюдали увеличение уровня экспрессии миРНК-20a и миРНК-146b, а также снижение уровня экспрессии миРНК-125b в группе операционных образцов с диагнозом ТНРМЖ по отношению к образцам с диагнозом люминальный А и люминальный В/HER2/neu-негативный РМЖ (p 0.001). Однако методом ROC-анализа показано, что лишь миРНК-20a является значимым классификатором для дифференциации наиболее агрессивного РМЖ с тройным негативным фенотипом (AUC 0.8) (рис.7).
Таким образом, при сравнительном анализе уровней экспрессии 9 миРНК- 21, 221, 222, 155, 205, 20a, 125b, 146b, 200a между операционными образцами ТНРМЖ и операционными образцами люминального РМЖ получены результаты, свидетельствующие о том, что наиболее агрессивный ТНРМЖ характеризуется существенным повышением экспрессии миРНК-20a, которая может быть использована в качестве значимого классификатора при дифференциации ТНРМЖ. Табл. 7. Сравнительный анализ медианных значений относительных уровней экспрессии миРНК в операционных образцах ТНРМЖ по отношению к образцам с диагнозом люминальный А и люминальный В/НЕК2/пеи-негативный РМЖ. Примечания: p 0.05 - различия уровней экспрессии миРНК оцененные методом Манна-Уитни статистически значимы.
Традиционно для дифференциальной диагностики опухолей молочной железы используется тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия (ТАПБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием биоптата. Цитологическое исследование материала, взятого из очагов опухолевого роста является основополагающим для установления правильного диагноза и тактики лечения. Однако отмечается высокая частота гипер- и гипо-диагностики.
С целью оценки изменений уровней экспрессии миРНК в предоперационных образцах РМЖ по отношению к ФА МЖ методом ОТ-ПЦР в реальном времени измерен уровень экспрессии миРНК – 21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -200a в 51 образце с диагнозом РМЖ и 29 образцах с диагнозом ФА МЖ. Материал для исследования получен экстракцией с цитологических препаратов, используемых в клинике в качестве основного этапа предоперационной диагностики. В результате анализа полученных данных мы наблюдали увеличение уровня экспрессии миРНК-21, миРНК-200a и снижение уровня экспрессии миРНК-205, миРНК-125b и миРНК-221 (p 0.05) в образцах злокачественных опухолей молочной железы по отношению к образцам доброкачественных опухолей молочной железы (табл.8). ROC анализ позволил установить, что значение AUC для миРНК-21, -221, -205 и -200a менее 0.8, что говорит о недостаточной значимости данных классификаторов в дифференциации злокачественных опухолей молочной железы. Для миРНК-125b значение AUC равно 0.862, что говорит о высокой значимости данного критерия в понимании различий между злокачественными и доброкачественными опухолями молочной железы в предоперационной диагностике (рис. 11).
Повышение точности и информативности цитологического и гистологического заключений путем анализа уровней экспрессии микроРНК
Существует множество работ, описывающих изменения уровней экспрессии миРНК как в опухолевых образцах по сравнению с прилежащими морфологически неизмененными тканями, так и между опухолями различного генеза (Iorio, Visone, 2007; Iorio et al., 2011; Hayes et al.,2014). Однако данные полученные в разных лабораториях могут варьироваться в зависимости от метода измерения экспрессии, набора используемых реагентов, а также дизайна праймеров исследуемых миРНК. На сегодняшний день в Российской Федерации не зарегистрировано готовых диагностических панелей, в основе которых лежит анализ экспрессии миРНК, позволяющих различать молекулярно-генетические подтипы опухолей различного генеза и способствующих улучшению методов персонализированной терапии. Таким образом, разработка методических подходов и анализ изменений уровней экспрессии миРНК в опухолях различного генеза является актуальной задачей и на сегодняшний день.
C целью определения различий профилей экспрессии миРНК в опухолях человека различного генеза методом ОТ-ПЦР в реальном времени проведен сравнительный анализ относительных уровней экспрессии миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -181b, -200a, -126 в операционных образцах с диагнозами: ПР ЩЖ (n=108), ФР ЩЖ (n=15 ), РМЖ (n=78), ПКГ (n=51), ФА ЩЖ (n=41), зоб ЩЖ (n=39), ФА МЖ (n=16) (Таблица 16).
Доброкачест енные опу оли. При исследовании изменений уровней экспрессии миРНК в образцах ФА МЖ, ФА ЩЖ, доброкачественных узлах ЩЖ по отношению к прилежащим морфологически неизмененным тканям статистически достоверных различий не выявлено. Возможно, полученные результаты незначительных статистически недостоверных изменений уровней экспрессии миРНК между образцами доброкачественных опухолей и прилежащими морфологически неизмененными тканями подчеркивают отсутствие динамики развития опухоли и являются характеристикой доброкачественных опухолей различного генеза.
Злокачест енные опу оли. При исследовании изменений уровней экспрессии миРНК в образцах злокачественных опухолей, а именно, РМЖ, ПР ЩЖ, ФР ЩЖ, ПКГ по отношению к прилежащим морфологически неизмененным тканям, а также при сравнении с доброкачественными опухолями в пределах одного органа получены следующие результаты.
В представленной работе получены статистически достоверные результаты значимого увеличения уровня экспрессии миРНК-21 более чем в 3 раза в опухолевых образцах РМЖ, ПР ЩЖ и ПКГ по отношению к прилежащим морфологически неизмененным тканям (p 0.05). В опухолевых образцах ФР ЩЖ сохраняется тенденция к повышению уровня экспрессии миРНК-21, однако изменение незначительно и, возможно, для получения статистически достоверных значимых различий необходимо увеличить размер исследуемой выборки. Кроме того, миРНК-21 является значимым классификатором при дифференциации РМЖ от ФА МЖ (AUC=0.894, Sn=51.3%, Sp=100%) и ПР ЩЖ от подгруппы доброкачественных узлов ЩЖ (AUC=0.916, Sn=83.3%, Sp=89.7%). Таким образом, миРНК-21 может выступать в качестве маркера развития патологических процессов в клетках различных органов, а также в качестве классификатора, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью при дифференциации злокачественных опухолей различного генеза. Что коррелирует с литературными данными. Так миРНК-21 является онкогеном в большинстве типах опухолей. А именно, повышенный уровень экспрессии миРНК-21 при РЩЖ коррелирует с плохим прогнозом, метастазами и высоким уровнем кальцитонина (Pennelli et al.,2015). Высокий уровень экспрессии миРНК-21 в опухолях молочной железы коррелирует с низкой выживаемостью пациентов (Wang et al.,2015). В опухолях гортани уровень экспрессии миРНК-21 также коррелирует с прогрессированием опухоли и стадией злокачественности процесса (Manikandan et al.,2015).
При анализе уровней экспрессии кластера миРНК-221/222 в опухолях различного генеза получены противоположные данные динамики изменения уровня экспрессии при РМЖ и РЩЖ. Так получены результаты значительного увеличения уровней экспрессии миРНК-221/222 в образцах ПР ЩЖ и ФР ЩЖ по отношению к прилежащим морфологически неизмененным тканям. Однако в образцах РМЖ наблюдается тенденция к уменьшению уровня экспрессии кластера миРНК-221/222 по сравнению с морфологически неизмененной тканью. По литературным данным одной из мишеней миРНК-221/222 является РЭ (Di Leva et al.,2010). В исследуемой выборке порядка 80% образцов характеризуются положительным РЭ статусом. Таким образом, пониженный уровень экспрессии миРНК-222 коррелирует с РЭ-положительным статусом опухолей молочной железы. В свою очередь в опухолях щитовидной железы повышенный уровень экспрессии миРНК-221/222 возможно ассоциирован с участием данной миРНК в регулировании пролиферации. Из литературы получены данные эксперимента с клеточной линией РЩЖ где повышенная экспрессия кластера миРНК-221/222 способствовала пролиферации за счет подавления супрессоров TIMP3 и PTEN (Garofalo et al.,2009; Pallante et al.,2006). Полученные данные в очередной раз подчеркивают, что роль миРНК в процессе развития опухолей различного генеза варьируется в зависимости от гена-мишени который она регулирует. Кроме того, в представленной работе получены данные характеризующие миРНК-221/222 в качестве значимых маркеров при дифференциации злокачественных фолликулярно клеточных опухолей ЩЖ от доброкачественных опухолей ЩЖ, а именно, ФР ЩЖ от ФА ЩЖ ( миРНК-221: AUC=0.880, Sn=87.5%, Sp=85.4%; миРНК-222: AUC=0.912, Sn=81.3%, Sp=90.2%), ПР ЩЖ от доброкачественных узлов ЩЖ (миРНК-221: AUC=0.969, Sn=94.4%, Sp=89.7%; миРНК-222: AUC=0.976, Sn=92.6%, Sp=94.9%). При анализе уровня экспрессии миРНК-221 и миРНК-222 в образцах плоскоклеточных карцином гортани в сравнении с прилежащей морфологически неизмененной тканью различий не выявлено (p=0.99733 и p=0.59078 соответственно).