Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Кушнир Анастасия Викторовна

Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae
<
Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae
>

Диссертация - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кушнир Анастасия Викторовна. Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae: дис. ... кандидата биологических наук: 03.01.03 / Кушнир Анастасия Викторовна;[Место защиты: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН], 2013. - 129 c.

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы 12

1.1 Биология Neisseria gonorrhoeae 12

1.1.1 Общая характеристика N. gonorrhoeae 12

1.1.2 Организация генома и факторы патогенности N. gonorrhoeae 13

1.1.3 Инфекционный процесс, вызванный N. gonorrhoeae 24

1.2 Устойчивость N. gonorrhoeae к антибиотикам 30

1.2.1 Применение антибиотиков для лечения гонореи 30

1.2.2 Механизмы устойчивости к антибиотикам 34

1.3 Молекулярная эпидемиология гонореи 40

1.3.1 Важность типирования N. gonorrhoeae для эпидемиологических целей 40

1.3.2 Методы типирования изолятов N. gonorrhoeae на основе фенотипа 42

1.3.3 Методы типирования изолятов N. gonorrhoeae на основе генотипа 44

2 Материалы и методы 53

2.1 Материалы 53

2.1.1 Коллекции ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae 53

2.1.2 Реактивы 53

2.1.3 Растворы и буферы 54

2.1.4 Олигонуклеотидные праймеры 54

2.2 Методы 56

2.2.1 Поиск VNTR-локусов 56

2.2.2 Мультилокусный VNTR-анализ 56

2.2.3 Секвенирование ДНК 58

2.2.4 Opa-типирование 58

2.2.5 NG-MAST 59

2.2.6 Статистический анализ данных 59

3 Результаты исследования 61

3.1 Разработка методики мультилокусного VNTR-анализа 61

3.1.1 Поиск потенциальных VNTR-локусов в геноме N. gonorrhoeae 61

3.1.2 Тестирование VNTR-локусов на коллекции ДНК N. gonorrhoeae 62

3.1.3 Расположение VNTR-локусов в геноме N. gonorrhoeae относительно кодирующих последовательностей 64

3.2 Изучение генетического разнообразия изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в городе

Алматы (Казахстан) 68

3.2.1 Мультилокусный VNTR-анализ изолятов N. gonorrhoeae 68

3.2.2 Opa-типирование и NG-MAST 70

3.2.3 Сравнение методов типирования 73

3.3 Изучение генетического разнообразия изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в семи

городах России 75

3.3.1 Мультилокусный VNTR анализ изолятов N. gonorrhoeae 75

3.3.2 Кластерный анализ 81

3.3.3 Результаты VNTR-анализа и устойчивость к антибиотикам 83

3.3.4 Сравнение методов типирования на выборке из 102 изолятов 86

4 Обсуждение результатов 88

Выводы 97

Список сокращений и условных обозначений 98

Список литературы 99

Организация генома и факторы патогенности N. gonorrhoeae

Гонококки – это грамотрицательные неподвижные и не образующие спор диплококки, имеющие слегка вытянутую форму. Гонококки имеют типичную внешнюю мембрану, которая расположена над слоем пептидогликанов и цитоплазматической мембраной, но в отличие от менингококков не имеют капсулы из полисахаридов.

Геном гонококков представлен кольцевой хромосомой и внехромосомными элементами – плазмидами. На настоящий момент полностью определены полные нуклеотидные последовательности геномов для трёх штаммов N. gonorrhoeae: FA1090, NCCP11945, TCDC-NG08107. Размеры геномов варьируют от 2.15 до 2.24 миллионов п.н., геномы содержат от 2069 до 2747 предсказанных генов, средняя длина гена – 845 п.н., плотность расположения генов – 78.6%. Содержание нуклеотидных пар GC составляет 52.4% – 52.7%.

Основу генома представляют 896 генов, которые присутствуют у всех видов рода Neisseria и обеспечивают основные функции бактериальной клетки («гены домашнего хозяйства») [12]. Эти гены обеспечивают общие метаболические процессы (биосинтез аминокислот, нуклеотидов, метаболизм липидов и т.д.), репликацию ДНК, рекомбинацию, транскрипцию и трансляцию. У всех представителей рода Neisseria имеются гены, обеспечивающие аэробное дыхание: гены пентозофосфатного пути и цикла трикарбоновых кислот, а также гены, необходимые для анаэробного дыхания, включая гликолиз и денитрификацию. Кроме того, в геноме содержится не менее четырёх копий оперона, кодирующего рибосомные РНК (16S-23S-5S).

Важной особенностью генома является наличие повторяющихся последовательностей (называемых минимальные мобильные элементы), которые играют роль в генетической трансформации, перестройках генома и регуляции экспрессии генов [13, 14]. Наиболее часто (около 2000 копий) в геноме встречается последовательность из 10 п.н. (GCCGTCTGAA), обозначенная DUS, которая важна для процесса трансформации. Другие повторяющиеся элементы – элементы dRS3 и Correia – участвуют в регуляции экспрессии генов и присутствуют в геноме в количестве 200-250 копий.

Большинство изолятов N. gonorrhoeae содержат плазмиды различного размера. Почти все штаммы содержат плазмиду размером 4.2 тысяч п.н., которую называют гонококковая криптическая плазмида. В некоторых штаммах эта плазмида присутствует в виде тримера размером 12.6 тысяч п.н., состоящего из трёх расположенных подряд копий плазмиды. Механизм образования стабильной формы тримера не изучен. Нуклеотидная последовательность плазмиды имеет компактную генетическую организацию и содержит две транскрипционные единицы [15].

Распространение изолятов, устойчивых к высоким концентрациям пенициллина, связано с наличием плазмиды, кодирующей -лактамазу типа TEM-1. Плазмиды из разных штаммов отличаются по размеру (5.3 – 7.2 тысяч п.н.) и имеют названия, связанные с регионом, где они были впервые выделены («Африканская», «Азиатская», «Рио» и т.д.) [16]. Все структурные варианты плазмиды имеют происхождение от предковой плазмиды, выделенной из Haemophilus ducreyi [17].

Многие штаммы гонококков содержат конъюгативную плазмиду размером 39 тысяч п.н. Эта плазмида способна осуществлять собственный перенос в реципиентные клетки гонококков, а также мобилизовать плазмиду, содержащую ген -лактамазы. С появлением штаммов N. gonorrhoeae, устойчивых к тетрациклину, были выделены плазмиды размером около 40 тысяч п.н., содержащие детерминант устойчивости tetM. Было обнаружено, что это конъюгативные плазмиды, в которых произошла инсерция детерминанта tetM и перестройка кластера генов. Выделяют два типа таких плазмид: «Голландский» и «Американский», которые различаются по структуре детерминанта tetM (по наличию или отсутствию транспозона Tn916) [18].

Наиболее важными факторами патогенности гонококков являются поверхностные молекулы, которые участвуют в прикреплении, инвазии, повреждении клеток или выступают в роли мишеней для иммунной системы человека [3, 11]. Следует отметить, что некоторые из факторов патогенности синтезируются и симбиотическими видами рода Neisseria, и достаточно сложно выделить те факторы, которые необходимы для возникновения болезни. Таким образом, симбиотические виды Neisseria служат резервуаром вирулентных генов, с которым происходит интенсивный генетический обмен [12]. Основные факторы патогенности N. gonorrhoeae суммированы в таблице 1.1 [11].

Коллекции ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae

В исследовании были проанализированы следующие коллекции ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae:

1) 48 образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae, выделенных у больных острой не осложнённой гонореей, которые проходили лечение в поликлинике Научно-исследовательского кожно-венерологического института Министерства Здравоохранения республики Казахстан города Алматы в период с 2008 по 2009 год. ДНК была выделена из культуры N. gonorrhoeae согласно описанной ранее методике [238].

2) 218 образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae, выделенных у больных острой не осложнённой гонореей, проживающих в разных городах России, в период с 2004 по 2005 год. Коллекция клинических изолятов была собрана Государственным научным центром дерматовенерологии и косметологии и включала 29 изолятов из Москвы, 30 изолятов из Санкт-Петербурга, 33 изолята из Мурманска, 32 изолята из Самары, 32 изолята из Архангельска, 29 изолятов из Екатеринбурга и 33 изолята из Иркутска. Для всех изолятов ранее был определён серотип и уровень чувствительности к пенициллину G (PEN), тетрациклину (TET) и ципрофлоксацину (CIP). Также ранее были определены хромосомные и плазмидные маркёры устойчивости к пенициллину, тетрациклину и фторхинолонам [239]. Кроме того, 102 изолята ранее были охарактеризованы при помощи методов por-типирования, MLST и NG-MAST [196].

В работе были использованы следующие реактивы: агароза («Chemapol», Чехия); акриламид, бромистый этидий (Serva, Германия); аммония пероксодисульфат («Panreac», Испания); N,N -метиленбисакриламид («MP Biomedicals», США); N,N,N ,N – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)

(«AppliChem», Германия); трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), Tween-20 («ICN Biochemicals», США); акрилекс P-6 («Reanal», Венгрия); набор для секвенирования BigDye Terminator v. 3.1 («Applied Biosystems»); бромфеноловый синий, ксилен цианол FF («Диа-М», Россия). Остальные реактивы: HCl, KCl, MnCl2, (NH4)2SO4, NaCl, NaAc, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), этанол, глицерин – отечественного производства («Реахим»), имели степень очистки «ХЧ» и «ОСЧ».

Также в работе были использованы дезоксинуклеозид-5 -трифосфаты (дНТФ), маркёры молекулярных длин ДНК pBlueSK/MspI (710, 489, 404, 328, 242, 190, 157, 147, 110, 67, 57 п.н.) и 100 п.н. (400х2) (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 400, 300, 200, 100 п.н.), Taq ДНК-полимераза («Биосан», Россия) и эндонуклеаза рестрикции TaqI («СибЭнзим», Россия). ТАЕх1: 0.04 М Трис, 0.02 М уксусная кислота, 0.001 М ЭДТА (рН 8,0). ТБЕx0.5: 0.045 M Трис, 0.045 M борная кислота, 0.001 М ЭДТА (pH 8.0). Буфер для нанесения образцов ДНК на агарозный и полиакриамидный гели: 0.5% бромфеноловый синий, 0.5% ксилен цианол FF, 50% глицерин в воде. Раствор бромистого этидия: 0.5 мкг/мл в воде. 30% раствор акриламида: 30% акриламид, 0.8% N,N -метиленбисакриламид. Буфер для акрилекса: 0.03 М KCl, 0.02 М Трис HCl (pH 8.0), 0.005 М ЭДТА (pH 8.0).

Олигонуклеотидные праймеры Олигонуклеотидные праймеры для каждого VNTR-локуса были подобраны с использованием программы Gene Runner 3.05 (Hasting Software, Inc.). Для opa-типирования были использованы праймеры, описанные ранее [189]. Праймеры были синтезированы в ИХБФМ СО РАН. В таблице 2.1 представлены структуры и температуры отжига (Tm) праймеров.

Поиск потенциальных VNTR-локусов в геноме N. gonorrhoeae

В геноме N. gonorrhoeae нами было выбрано in silico 15 потенциальных локусов, содержащих тандемные повторы. Положение VNTR-локусов в геномах штаммов NCCP11945 и FA 1090, размеры и число тандемных повторов представлены в таблице 3.1.

Выявленные VNTR-локусы можно разделить на три группы по длине тандемных повторов:

1) локусы, содержащие короткие тандемные повторы ( 20 п.н.): VNTR77, VNTR471, VNTR947, VNTR1117, VNTR1192, VNTR1405, VNTR1604, VNTR1609, VNTR2168

2) локусы, содержащие тандемные повторы средней длины ( 50 п.н., 200 п.н.): VNTR264, VNTR1638, VNTR2048

3) локусы, содержащие длинные тандемные повторы ( 250 п.н.): VNTR48, VNTR57, VNTR1432

В зависимости от длины тандемного повтора и соответствующей длины продуктов ПЦР электрофорез для разных локусов проводили в 8% ПААГ (короткие повторы), 6% ПААГ (повторы средней длины) или 1.5% агарозном геле (длинные повторы).

Все обнаруженные VNTR-локусы были протестированы на коллекции из 48 ДНК изолятов N. gonorrhoeae из Казахстана. При амплификации локусов VNTR57, VNTR77 и VNTR1117 были получены множественные продукты ПЦР, что, вероятно, обусловлено неспецифичным протеканием реакции. При амплификации локуса VNTR1405 для всех образцов были получены фрагменты одинаковой длины, т.е. этот локус оказался консервативным. Вследствие этого, указанные локусы были исключены из схемы VNTR-анализа.

Для локуса VNTR1604 не удалось подобрать условия амплификации, при которых происходит синтез фрагментов нужной длины. Для локусов VNTR48 и VNTR1432 продукт амплификации отсутствовал для 19 изолятов (40%) и 13 (27%) изолятов, соответственно, поэтому эти локусы были исключены из схемы VNTR-анализа. Продукты ПЦР для локуса VNTR1192 слабо различались по длине на электрофореграмме. При секвенировании продуктов ПЦР для всех образцов было выяснено, что данный локус имеет сложную структуру. Локус VNTR1192 содержит различные комбинации из тандемного повтора длиной 9 п.н. (TTCGGCAGG) и его укороченного варианта длиной 6 п.н. (TTCGGC), в результате чего получаются повторы длиной 15 (6+9), 21 (6+9+9), 24 (6+9+9) и 30 (6+6+9+9) пар нуклеотидов. Данный локус слишком сложен для электрофоретического анализа, поэтому он также не был включён в итоговую схему VNTR-анализа. Тем не менее, локус VNTR1192 может быть успешно использован для дифференциации близких штаммов N. gonorrhoeae при помощи определения его нуклеотидной последовательности.

Для остальных локусов (VNTR264, VNTR471, VNTR947, VNTR1609, VNTR1638, VNTR2048, VNTR2168) при амплификации всех образцов были получены специфичные фрагменты, которые различались по длине.

Таким образом, конечная методика VNTR-анализа включала в себя отдельную амплификацию семи VNTR-локусов и последующее разделение продуктов ПЦР в полиакриламидном геле. 3.1.3 Расположение VNTR-локусов в геноме N. gonorrhoeae относительно кодирующих последовательностей

Мы проанализировали расположение VNTR-локусов относительно кодирующих последовательностей в геноме N. gonorrhoeae. В соответствии с полными аннотированными последовательностями геномов штаммов FA 1090 и NCCP11945, по меньшей мере, два локуса (VNTR471 и VNTR1638) расположены в участках кодирующих последовательностей известных генов (Таблица 3.2).

Локус VNTR471 расположен в участке гена NGK_0571 (Рисунок 3.1), который кодирует субъединицу HsdS системы рестрикции-модификации I типа. Поскольку последовательность тандемного повтора состоит из 12 нуклеотидов, изменение количества повторов не приводит к сдвигу рамки считывания белка. Увеличение или уменьшение числа повторов на один приводит к добавлению или удалению четырёх аминокислот (Thr-Leu-Glu-Ala) после аланина в 23-ей позиции. Таким образом, изменение числа повторов приводит к изменению структуры белка, что может влиять на его функциональность.

Мультилокусный VNTR анализ изолятов N. gonorrhoeae

Был проведён VNTR-анализ 218 изолятов N. gonorrhoeae, собранных в семи городах России: Москве, Санкт-Петербурге, Мурманске, Самаре, Архангельске, Екатеринбурге и Иркутске. В результате VNTR-анализа для всех 218 изолятов был определен VNTR-профиль, состоящий из семи чисел. Секвенирование новых аллелей, обнаруженных на этом этапе, подтвердило, что различия в длине фрагментов соответствуют изменениям числа повторов.

Число аллелей для разных VNTR-локусов варьировало от двух (VNTR1609, VNTR1638) до семи (VNTR471). На рисунке 3.9 для всех VNTR-локусов представлены электрофореграммы с продуктами ПЦР разной длины, которые соответствуют различному количеству повторов. Цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 обозначено количество тандемных повторов для данного образца ДНК N. gonorrhoeae. М – маркёр длин ДНК pBlueSK/MspI (длины ДНК в парах нуклеотидов указаны на правой стороне первой панели).

Для точной оценки степени полиморфизма каждого локуса был рассчитан индекс аллельного полиморфизма (h), который варьировал для отдельных локусов от 0.237 до 0.689 (Таблица 3.5).

Наиболее дискриминирующими оказались локусы VNTR471 и VNTR2048, наиболее консервативным оказался локус VNTR2168.

В результате для 218 изолятов N. gonorrhoeae было выявлено 83 VNTR-типа, любые два из которых различались хотя бы на один повтор в одном локусе. Среди них 47 VNTR-типов были представлены одним изолятом, остальные VNTR-типы были обнаружены в случае от двух до десяти изолятов, а тип VNTR-16 (1,3,2,2,2,3,2) оказался наиболее распространённым и был выявлен у тридцати четырёх (15.6%) изолятов из разных городов: Мурманска (12 изолятов), Самары (8 изолятов), Иркутска (7 изолятов), Москвы (5 изолятов), Архангельска (1 изолят) и Санкт-Петербурга (1 изолят).

На основе VNTR-профилей при помощи метода кластеризации UPGMA была построена дендрограмма для 83 VNTR-типов (Рисунок 3.10).

Индекс дискриминации Хантера-Гастона для метода MLVA по семи локусам для 218 изолятов N. gonorrhoeae составил 0.963 (95% CI, 0.950-0.977).

Было проведено сравнение генетических профилей изолятов N. gonorrhoeae, выделенных в разных регионах. Количество обнаруженных VNTR-типов существенно различалось для разных локальных популяций (Таблица 3.6). При оценке индекса дискриминации для выборок из разных географическому положению этих городов. Наконец, популяция из Алматы находится в нижней правой части пространства, наиболее удалённо от остальных. 3.3.2 Кластерный анализ

Между пациентами, которые инфицированы изолятами N. gonorrhoeae со сходными VNTR-профилями, с большей вероятностью существует эпидемическая связь. Для выявления взаимосвязей между VNTR-типами был проведён иерархический кластерный анализ и построено минимальное остовное дерево (Рисунок 3.12). На минимальном остовном дереве определены кластеры – локализованные группы, содержащие не менее 7 VNTR-типов, любые два соседних VNTR-типа различаются не более чем по одному VNTR-локусу. Было выделено шесть кластеров: A (n = 67 изолятов), B (n = 13 изолятов), C (n = 24 изолятов), D (n = 33 изолятов), E (n = 37 изолятов) и F (n = 34 изолятов). Все кластеры содержат суммарно 208 (95.4%) изолятов.

Каждый круг представляет VNTR-тип, размер круга соответствует числу изолятов с данным VNTR-типом. VNTR-типы, соединённые сплошными линиями, различаются по 1 VNTR-локусу; VNTR-типы, соединённые штрихованными линиями, – по 2 VNTR-локусам; VNTR-тип 83, соединённый пунктирной линией, – по 3 VNTR-локусам. Кластеры обозначены серой заливкой. VNTR-типы 34, 35, 63, 64, 74, 82 связаны с другими типами на уровне изменений в двух локусах, т.е. эти типы отличаются от других типов не менее чем по двум VNTR-локусам. VNTR-тип 83 связан с типом 1 на уровне изменений в трёх локусах, т.е. этот тип отличается не менее чем по трём VNTR-локусам от любого другого типа.

Распределение изолятов по кластерам существенно различалось в разных городах (Рисунок 3.13). Распределение изолятов по кластерам статистически достоверно отличалось от совокупной выборки для городов Архангельск (2 = 19.4, p = 0.004), Екатеринбург (2 = 24.5, p 0.001), Иркутск (2 = 39.5, p 0.001), Самара (2 = 54.8, p 0.001) и Санкт-Петербург (2 = 29.4, p 0.001). Также показано, что кластеры A (2 = 34.1, p 0.001), D (2 = 21.6, p = 0.001) и F (2 = 43.3, p 0.001) статистически достоверно отличается от совокупной выборки по географическому распределению изолятов.

Похожие диссертации на Разработка и применение метода мультилокусного VNTR-анализа для изучения генетического разнообразия изолятов Neisseria gonorrhoeae