Введение к работе
Актуальность дроблены. Активно проходяшая кампания ликвидации шидемнческои кори в рамках расширенной Программы имнунизапии. раэра->отаниой Всемирной организацией здравоохранения, требует осушествления юстоянного надзора за эпидситузчией в отношении этой инфекции с по-юшью современных экспресс-методов, доступних в каждоп практической іаборатории. Анализ заболеваености по клиническим и серологический іаннкм, проводимый в последние годы, показал, что в странах, осэтпест-іляюших массовую ваккинопрофилактику кори, неняэтея характер клини-іеского течения болезни (возрастает процент легких, стертых Форн. а :акхе тяжелых случаев, нередко с летальный исходом) и происходит :двиг пика заболеваености на более старшие возрастные группы, это вы-іьгаает значительные трудности при диагностике кори и ее дифференциа-іии от других э'оантекных заболевания, что также заставляет проводить >азработку современных серологических методов.
до настоящего времени в нашей стране широко используется реакция орможения гемагглютинапии (РТГА). а в последние годы для этих целей :тая использоваться отечественный диагностикум для реакции непрянок "емагглютинации (РИГА). Несмотря на высокую чувствительность и спе-піфичность. ни один из этих нетодов не отвечает современным требова-[иям по ряду критериев, так. для РТГА необходимы эритроциты обезьян. іедоступньїе практическим лабораториям, а РИГА имеет ограничения при ^агностических исследованиях, т. к. выявляет преимущественно поздние дтитела. Кроне того, оба метода характеризуются некоторым субьекти-іиз:їом в опенке результатов и для них необходима предварительная об-аботка сывороток, что ограничивает возможности их использования для ироких серо?пидениологических исследований.
В связи с вышеизложенный постоянно идут поиски более чувстви-ельных. специфичных, воспроизводимых, быстрых, а главное, стандартів и поддающихся автоматизации нетодов диагностики кори и проведе-
3.
яия эпидемиологических исследований при этой инфекиии. Всей ЭТИМ Ті бованиян отзечает имнукофернентный анализ (ИФА). разработанный в на чале 70-х годов, одним из существенных преимуществ ИФА перед ДРУГИЕ методами является возможность без проведения какой-либо обработки с вороток выявлять специфические противовирусные иммуноглобулины клас К. что открывает новые перспективы для проведения экспресс-диагксст ки кори. В последнее вреня за рубежом большое внинание уделяется рз работке различных вариантов КФА для выявления противокоревых антите однако отечественные аналоги таких имнунофериентных тест-систем от сутствуот. Указанные причины делают конструирование инмунофернентнк тест-систем для диагностических и сероэпидениологических исследован кори весьма актуальной задачей.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы были:
-
Разработка иммунофернентной тест-системы для выявления антител вирусу кори, для достижения этой цели необходимо было решить еле дгаше задачи: определить методику приготовления твердофазного и иуносорбентг и отработать оптинальные условия постановки ИФА; ус танозить пригодность и стабильность ряда ингредиентов (твердофаз ных носителей - ннкротитроваяьных пластин, пероксидазкых коньюга тов. индикаторного и других необходимых растворов), определить чувствительность, специфичность, воспроизводимость разработанной тест-системы в сравнении с другими серологическими нетгааіи и ан логичными зарубежными системами.
-
Разработка отечественной иммуиофєрнєнтной тест-ситены для вкявле ния ієн антител к вирусу корк для экспресс-диагностики этой инФе; пик. Для этого нужно было определить условия создания твердоФазк-го иммуносорб^нта. получить и отобрать кококлональные антител. (ИкаТ). пригодные для эффективного выявления igH антител, ПРКГОТі вить и оценить перокекдазяые коньюгаты на основе различных сроти вокорєвьк НкАТ. отработать способы получения антигенов вируса ко
4.
ри. определить оптимальные условия постановки ИФА- изучить в сравнительных исследованиях различные варианты инмунофєрнєнтньпс тест-систен для выявления igK антител.
научная новизна. Впервые проведено вирокое сравнительное изу->ние различных антигенных препаратов вируса кори с целью создания «унофернентной тест-системы для выявления противокорезых антител. :тановлено преимущество нативных инфипироваюшх вирусом кори клеток ;го для получения твердофазного иннуноссрбента. Высокая чувствктель-эсть иннуноФерментной тест-системы для выявления антител К ВИРУСУ эри. по которой она не отличается от тест-системы аналогичной капра-аенностн производства фкрны Behrine-werKe (ФРГ), достигается полной йхраігкостью антигенных детернинант вируса, которые экспрессируются а поверхности клетки и играют решающую роль в иммуногенезе, высокая аепиФичность тест-системы определяется включением в качестве контро-я исследования сывороток с антигеном незарааенкых клеток Vero. обра-отаяных аналогично вируснону антигену, что позволяет исключить полу-екие ложно положительных результатов при связывании антител сыворо-ок с неспепифическини белками клеток. Определены 05ПИЄ принципы оп-кнкзапии ИФА: показано, что чувствительность и специфичность инмуно-ерментной тест-системы зависит не только от специфических биологи-еских Факторов (степень очистки и свойства антигенов, сорбированных а твердой Фазе, качества пероксидазных коньюгатов и ряда других), но : от системы учета результатов и правильно выбранного разведения ис-ледуекых СЫВОРОТОК.
влервые в нашей стране получена панель мкАТ. направленных к ген-ігглютинину (ГА) вируса кори, с помощью конкурентного ИФА установлено. iTo на молекуле ГА имеются, по крайней мере, три неперекрывающихся штигенных сайта.
для экспресс-диагностики кори впервые сконструированы и изучены і строго контролируемых условиях три варианта нкнунофєрмєнтянх тест-:ястем для выявления внрусспецифических иммуноглобулинов Н: два из
5.
них основаны на варианте "захвата" ИФА, и отличаются друг от.другі детекторной системой, а один - на непрямой варианте ИФА с использов;
ниен антигенного книуносорбента и антител к иммуноглобулинам н человека, меченых пероксидазоя. показано, что для первого варианта ИФ> могут быть с успехом использованы 3 из полученных нами НкАТ, направленных к различным антигенным детернинантан ГА вируса кори. СпедиФіг ность этом тест-систечы может быть значительно повышена при использ< вании очищенного вируса кори по сравнению с лизатнын антигеном и кої центрированным неочищенным вирусом, для создания второго варианта и< на основе неченых пероксидазоя антигенов вируса кори установлено пр< имущество использования нуклеокапсидного антигена в качестве коньюг: та для детекции IBM антител, что доказывает ведущую роль нуклеокап-сидных белков в иммуногенезе на раннем этапе инФекшш. в третьем непрямом варианте ИФА показана возможность использования антигенногс имнуносорбента на основе нативных зараженных вирусом кори клетої vero. на большом полевом материале установлено, что оба варианта *з< хвата* по чувствительности и специфичности не отличались друг от дрз га и значительно превосходили непрямой вариант ИФА.
Практическая аенность. впервые в нашей стране разработана рентабельная технология изготовления инмунофернентной тест-системы для выявления антител к вирусу кори, система изучена на 5456 сыворотках людей различных контингентов. Показано, что чувствительности ее составляет 10 + 5 нг. специфичность - 100 г.. натериалы исследования леї ли в основу нормативно-технической документации на тест-систену инмз ноферментную для выявления антител к вирусу кори: Технического задания на научно-техническую разработку, инструкции по изготовлению и контролю. Инструкции по применению. Временной Фармакопейной статьи (ВФС), пояснительной записки к ВФС и экспериментально-производственного регламента. ИмиУНОФернентная тест-система для выявления антите; к вирусу кори прошла комиссионные испытания, рекомендовано ее внедрі ниє в практику.
6.
Впервые в нашей стране разработана технология получения имиуно-^ернеитеой тест-скстекн для выяаяехпгя 1«л антител К ВИРУСУ коря из
>снове вирусспєдифичєскйх ноноклональных антител, при исследовании на ітся тест-системе 716 сывороток больных корье людей показана ее высосал чувствительность н специфичность. Составлена норнативно-техничес-<ая документация на тест-систему ихмунофєрмєнтную для выявления инну-зоглобулинов N к вирусу кори на основе вирусспепиФических нонокло-іальнмх антител: Инструкция по изготовлению и контролю и инструкция 10 применению, утверждегаые на 'Ученом совете ниивп АМН СССР «протокол ї 1 от 24.01. 1991). н.1 этот препарат получены положительные отзывы из ряда практических учреждений здравоохранения (Инфекционная больница пг. Москвы, нниизй им. г. н. Габричевского нинздрава рсфср. городская ;эс г.Москви». Получено авторское свидетельство на изобретение "Втанн гибридных клеток кышел (Hits кизеціїз) ВК-93. г. испольэуеиыя для получения ноноклональных антител к генагглютинину вируса кори (Л-16)".
публикация результатов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ. Материалы н основные результата работы доложены кг республиканской конференции "Актуальные вопросы этиологии, патогенеза, диагностики, эпидемиологии и профилактики зирусиых инфекпия" «г.Одесса. 19«с г. )> на проблемной комиссии "Корь, краснуха, паротит" !г. Москва, 1936 г.), на региональном семинаре пс применению кфа а диагностике вирусных инфекция (Г. Петрозаводск, 1983 г.). на Всесоюзной конференции "Соврененные направления создания ьедкшшских диагностикуксв* (г. Москва, 1988 г. ). диссертация апробирована ка конференции югава АМН есс? 14 ноября 1990 г.
Обьен и структура работы, диссертация изложена на гої странице наокноыисного текста, включая иллюстрации (18 рисунков и 35 таблиш. Она состоит из сдедгажх разделов: введение, обзор литературы (3 главы), ргзультаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы включает зп источников, из которых гто зарубежных.
?.