Введение к работе
Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота - тяжелое хроническое заболевание, вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС), который является представителем семейства Retroviridae. Данное заболевание регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России, и причиняет большой экономический ущерб вследствие недополучения молока и приплода из-за преждевременной выбраковки коров, убоя быков-производителей, утилизации туш больных животных и дополнительных расходов на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.
ВЛ КРС поражает В-лимфоциты, при этом вирусная РНК встраивается в геном клетки хозяина в виде ДНК-копии, образуя лровирус. Интегрированный в клеточный геном провирус может долгое время не экспрессироваться, чем и объясняется наличие длительного (от нескольких месяцев до нескольких лет) латентного периода в развитии заболезания, когда в крови животных не обнаруживаются антитела к вирусу, при этом инфицированные животные сами могут служить источником инфекции. В связи с этим актуальной является проблема диагностики лейкоза на ранних стадиях заболевания.
В настоящее время основным диагностическим методом, который широко применяется для массовых исследований, является реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД). Однако не у всех заболевших животных уровень антител в крови достигает значений, тестируемых в РИД. Разработанные в последние годы ИФА-тесты позволяют обнаруживать инфицированных животных раньше и с большей чувствительностью, чем РИД. Наиболее перспективным подходом является создание диагностикумов, в которых в качестве антигенов используются синтетические пептиды, обладающие рядом преимуществ перед рекомбинантными или выделенными из клеточных культур вирусными антигенами: прежде всего, это безопасность производства и использования; во-вторых, технологичность производства и стабильность при хранении.
Вместе с тем, не всегда при диагностике лейкоза КРС серологические тесты могут дать однозначный результат, например, при наличии различных хронических заболеваний, вакцинации. Ассоциированность ВЛ КРС с клеточными структурами обуславливает выработку широкого спектра антител, в том числе и к
нормальным клеточным антигенам, что в ряде случаев затрудняет серологическую диагностику лейкоза крупного рогатого скота.
В связи с этим необходима разработка подтверждающих тестов, основанных на специфической индикации ВЛ КРС. Особый интерес представляют методы молекулярной биологии, и прежде всего, полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая обнаруживать вирусный геном в лимфоцитарнои ДНК животных.
Перечисленные обстоятельства явились определяющими при выборе темы диссертационной работы.
Цели и задачи исследований. Основной целью нашей работы явилась разработка новых средств диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием метода иммуноферментного анализа на основе синтетических пептидов и полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- подобрать оптимальные условия концентрирования и очистки антигена ВЛ КРС;
- изучить возможность использования синтетических пептидов-фрагментов
гликопротеида др51 ВЛ КРС для обнаружения антител к вирусу лейкоза в
сыворотках крови инфицированных животных;
на основании сравнительного анализа известных нуклеотидных последовательностей гена др51 ВЛ КРС сконструировать праймеры и разработать метод выявления вирусспецифической последовательности в лимфоцитарнои ДНК животных с помощью ПЦР;
- провести сравнительное изучение возможности выявления методами РИД, ИФА
и ПЦР естественно и экспериментально инфицированных ВЛ КРС животных;
- на основании проведенных исследований разработать методические
рекомендации для серологической и молекулярно-биологической диагностики
лейкоза КРС.
Научная новизна.
Оптимизированы условия выделения и очистки вируса лейкоза КРС из клеточной культуры FLK, хронически инфцированной ВЛ КРС.
Изучена диагностическая ценность ИФА на основе синтетических пептидов при выявлении антител к ВЛ КРС в сыворотках крови инфицированных животных.
Сконструированы лраймеры, позволяющие выявлять лровирус лейкоза КРС в лимфоцитарной ДНК инфицированных животных путем амплификации фрагмента гена др51 ВЛ КРС.
Обнаружены отдельные нуклеотидные замены в составе штамма FLK-BLV, являющегося продуцентом ВЛ КРС, и полевого изолята, выделенного на территории Владимирской области. Проведено сравнение определенной нуклеотидной последовательности с опубликованными структурами и прослежены вероятные филогенетические отношения.
Показано преимущество метода ПЦР по сравнению с серологическими методами диагностики при раннем выявлении заболевания у естественно и экспериментально инфицированных ВЛ КРС животных.
Практическая значимость работы. В процессе исследований разработаны: "Методика выявления в ИФА антител к вирусу лейкоза в сыворотках крови крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов" (утверждена директором ВНИИЗЖ 8 сентября 1995 г.); "Методика выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции" (утверждена директором института 16 апреля 1997 г.); "Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (проект), одобренные Ученым советом ВИЭВ (протокол №7 от 25 августа 1997г.) и секцией инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 2 от 17 июня 1997 г.) и представленные на утверждение в Департамент ветеринарии Минсельхозпрода России, позволяющие проводить анализ проб, взятых из неблагополучных хозяйств, с целью раннего выявления инфицированных лейкозом животных.
Положения, выносимые на защиту:
метод выявления антител к ВЛ КРС в сыворотках крови животных с помощью ИФА на основе синтетических пептидов;
метод выявления вируса лейкоза в крови инфицированных животных с помощью ПЦР на основе амплификации фрагмента гена др51 ВЛ КРС;
результаты сравнительных исследований методами РИД, ИФА, и ПЦР образцов крови инфицированных животных при диагностике лейкоза КРС с целью раннего обнаружения инфекции.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены на конференции "Вирусные и микробные болезни
сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995 г.), на Международной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996 г.), на Международной научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных", посвященной 100-летию открытия вируса ящура (Владимир, 1997 г.), а также на заседаниях Ученого Совета ВНИИЗЖ (1994-1997 гг.).
Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ и одна работа находится в печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 20 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 192 источника, из которых 105 иностранных и приложение, содержащее документы, подтверждающие практическую ценность отдельных этапов работы.