Введение к работе
Актуальность темы. Синдром приобретенного
иммунодефицита (СПИД, AIDS) - это первое ретровирусное
заболевание, которое быстро распространилось по всему миру,
приобретя характер пандемии. Несмотря на то, что более 20 лет
научные ресурсы всего мира направлены на борьбу с этим
заболеванием и, начиная с 1996 года, благодаря применению
высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ),
заболеваемость СПИДом значительно сократилась, число ВИЧ-инфицированных продолжает расти. В 2004 году общее число людей, являющихся носителями ВИЧ, возросло и составило 39,4 миллиона человек [UNAIDS/WHO, 2004]. Надежда врачей на то, что с помощью ВААРТ удастся излечить ВИЧ-инфицированных больных, столкнулась с уникальными патогенетическими особенностями ВИЧ-инфекции, не позволяющими ни иммунной системе, ни применяемым в настоящее время анти-ВИЧ препаратам обеспечить полную элиминацию вируса из организма. [Finzi, 1999; Hamer, 2004; McMichael, 2001; Ramratnam, 2000;]. ВИЧ характеризуется высокой генетической и антигенной изменчивостью. [Chen, 2004; Frenkel, 2004; Mayers, 1996; Pfflay, 2001; РШау, 2000; Richman, 1996].
ВИЧ поражает самую сердцевину иммунной системы - CD4+ Т-лимфоциты, постепенно на протяжении многих лет уничтожая иммунокомпетентные клетки.
Неспособность обратной транскриптазы ВИЧ контролировать стабильность генома, на фоне высокой скорости репликации вируса в условиях применения специфической противовирусной терапии приводит формированию мутантных штаммов со сниженной чувствительностью к анти-ВИЧ препаратам [Kellam, 1992; Larder, 1989; Larder, 1991; Ross, 2001; Schmit, 1996; Tisdale, 1993]. X4 и R5 штаммы ВИЧ-1 используют различные ко-рецепторы для проникновения в клетки и поражают различные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов [Bleul, 1997, Ostrowski, 1998]. Поэтому необходим поиск лекарств, которые будут эффективны против штаммов различной тропности. Ключевые патофизиологические процессы ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани [Fauci, 1996; Haase, 1996; Pantaleo, 1993], что требует разработки специальных подходов для тестирования препаратов на лимфоидной ткани ex vivo.
По последним оценкам, ВИЧ интегрируется в геном и существует в виде стабильной латентной формы провируса в покоящихся CD4+ Т-лимфоцитах памяти в течение периода сравнимого с человеческой жизнью [Siliciano, 2004]. В такой форме вирус не чувствителен к ВААРТ и может быть активирован при активации Т-клегок памяти в ответ на специфический патоген [Belmonte, 2003; Chun, 1997; Hamer, 2004].
Сложные особенности патогенеза ВИЧ-инфекции требуют создания новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов.
Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования была разработка новьж экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов in vitro, в том числе на лимфоидной ткани в соответствии с современными представлениями о патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Получить коллекцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.
Изучить фенотипические и генотипические свойства, полученных мутантов.
Исследовать перекрестную устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4.
Оценить подавление AZT-устойчивых мутантов ВИЧ-1 и штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.
Исследовать активность НзИОТ и других перспективньж антиретровирусньж препаратов против штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам в культуре лимфоидной ткани человека.
Разработать экспериментальную систему для оценки анти-ВИЧ активности постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.
Научная новизна.
Впервые получен мутант ВИЧ-1, устойчивый к фосфонату d4T.
Впервые проведено сравнительное исследование развития устойчивости к нуклеозидным аналогам и их фосфонатным производным.
Впервые показано, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и достигает более высокого уровня, чем к их фосфонатным производным.
Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентньж к AZT и d4T.
Впервые проведено исследование анти-ВИЧ активности новьж мембранотропньж соединений - анионной поликарбоксилатной матрицы и ее производных, модифицированных адамантаном и норборненом.
Впервые показано эффективное ингибирование комплексными адамантан- и нонборнен- содержащими мембранотропными соединениями репродукции Х4 штаммов LAI.04 и ВИЧ-IevKj а также AZT-устойчивьж вариантов в культуре клеток человека МТ-4.
Впервые показана возможность использования культуры лимфоидной ткани миндалин человека для оценки анти-ВИЧ активности противоретровирусных препаратов.
Впервые проведено тестирование новых препаратов микробицида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы UC781 и неконкурентного ингибитора обратной транскриптазы ниглизина в первичной культуре лимфоидной ткани миндалин человека. Показано, что эти препараты эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1, при этом R5 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 вирус.
Впервые разработана экспериментальная система для исследования препаратов, действующих на постинтеграционные стадии вирусной репликации в лимфоидной ткани человека.
Практическая значимость работы.
Созданная коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT, H-phAZT, ddl, d4T, phd4T) может быть использована для оценки эффективности новых препаратов против резистентных мутантов.
Использование в качестве экспериментальной модели культуры лимфоидной ткани миндалин человека позволит тестировать перспективные соединения в условиях, приближенных к in vivo.
Разработанная тест-система позволит оценивать препараты, направленные на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.
Основные положения, выносимые на защиту
Резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным.
Фосфонатное производное d4T с высокой эффективностью подавляет репродукцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.
Комплексные адамантан- и нонборнен- содержащие мембранотрогтые соединения эффективно ингибируют репродукцию штаммов LAI.04 (СХОЭД-тропный вариант) и ВИЧ-Ievk. а также AZT-устойчивых вариантов ВИЧ в культуре клеток человека МТ-4.
Культура лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной системой для оценки анти-ВИЧ активности перспективных противоретровирусных препаратов.
Препараты UC781 и ниглизин эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1 в культуре лимфоидной ткани миндалин человека.
Разработана тест-система, перспективная для оценки препаратов, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Вектор, Кольцове, 2001); 8 и 9 международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001); IX International conference "New informational technology in medicine and ecology" (Гурзуф, Украина, 2001); XII International congress of virology (Paris, France, 2002), XV International round table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Leuvev, Belgium, 2002), I Международном Симпозиуме "Стресс и экстремальные состояния" и Сателлитном Симпозиуме "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия". (Кара-Даг, Украина, 2002); 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, (Paris, France, 2003), симпозиуме "Интегративная медицина" (Кара-Даг, Украина, 2003); международной конференции "Microbicides 2004" (Лондон, Великобритания, 2004); международном симпозиуме "Keystone symposia on HIV Pathogenesis" (Банф, Канада, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 статей в отечественных и зарубежных журналах, 11 тезизов на международных конференциях.
Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 17 таблиц и 29 рисунков и состоит из 6-ти разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, а также списка сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 343 ссылки.
