Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Протеазы как индукторы и медиаторы регулируемой клеточной смерти 11
1.1 Каспазы 11
1.2 Кальпаины 18
1.3 Гранзимы 21
1.4 Катепсины 25
1.5 Бактериальные протеазы 27
1.6 Вирусные протеазы 31
1.7 Заключение 35
2. Материалы и методы исследований 38
2.1 Реактивы и материалы 38
2.2 Линии клеток и бактериальные штаммы 38
2.3 Плазмиды и синтетические олигонуклеотиды 39
2.4 Общие методы 40
2.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 40
2.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций 41
2.4.3 Манипуляции с белками 44
2.4.4 Работа с бактериями и эукариотическими клетками 45
2.5 Получение антител, специфичных к протеазе 3С вируса гепатита А человека 47
2.6 Оценка цитотоксического действия 3Cpro в зависимости от уровня экспрессии ее гена 47
2.7 Исследование эффекта свидетеля, сопровождающего гибель клеток вследствие экспрессии 3Cpro 48
2.8 Обработка и анализ полученных данных 48
3. Результаты и обсуждение 49
3.1 Характеристика клеточной гибели, вызываемой протеазой 3С вируса гепатита А человека 49
3.1.1 Экспрессия и оценка цитотоксического действия 3Сpro с помощью системы Tet-Off 49
3.1.2 Экспрессирующие 3Cpro клетки характеризуются нарушением функционирования митохондрий 52
3.1.3 Гибель клеток, экспрессирующих 3Cpro, сопровождается конденсацией хроматина и не зависит от каспаз, кальпаинов и катепсинов является причиной пути 54
3.1.4 Вакуолизация и гибель экспрессирующих 3Cpro клеток происходит не по механизму некроптоза 54
3.1.5 Вакуоли экспрессирующих 3Cpro клеток имеют неописанные ранее характеристики 56
3.1.6 Разработка экспериментальной системы для конститутивной экспрессии 3Cpro и оценки цитотоксического действия фермента 58
3.1.7 Гибель клеток, трансфицированных конструкцией pCI-3C, сопровождается цитоплазматической вакуолизацией 60
3.1.8 Гибель трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток не зависит от активности каспаз 61
3.1.9 Некростатин-1 не оказывает влияния на выживаемость клеток, трансфицированных конструкцией pCI-3C 62
3.1.10 Вызываемая 3Cpro клеточная гибель может быть отнесена к одному из четырех известных типов РКС 63
3.1.11 Гибнущие вследствие действия 3Cpro клетки приобретают некротическую морфологию 64
3.1.12 Индуцируемая 3Cpro клеточная гибель не является разновидностью партанатоса или MPT-ассоциированной РКС 66
3.1.13 Массовая деградация лизосом не гибели клеток при экспрессии 3Cpro 3Cpro гибель развивается 68
3.1.14 Индуцируемая ферроптоза 68
3.2 Характеристика эффекта свидетеля, сопровождающего гибель клеток при экспрессии протеазы 3С вируса гепатита А человека 71
3.2.1 Ассоциированный с экспрессией 3Cpro эффект свидетеля не зависит от межклеточных контактов и связан с действием цитотоксических факторов, находящихся в среде 71
3.2.2 Цитотоксическое действие факторов, обуславливающих эффект свидетеля при экспрессии 3Cpro, распространяется на клетки грызунов 73
3.2.3 Гибель трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток и эффект свидетеля проявляются при одинаковом уровне экспрессии 3Сpro 74
3.2.4 Цитотоксические факторы, обуславливающие эффект свидетеля при экспрессии 3Cpro, индуцируют гибель клеток по пути ферроптоза 75
3.2.5 Цитотоксические факторы, обуславливающие гибель экспрессирующих 3Cpro клеток, имеют узкий диапазон молекулярной массы 77
3.3 Оценка перспектив использования комбинации 3Cpro и суицидальной системы FCU1/5-ФЦ для генной терапии онкологических заболеваний 79
3.3.1 Создание моно- и бицистронных конструкций, обеспечивающих индивидуальную и совместную экспрессию 3Cpro и FCU1 82
3.3.2 Клетки, экспрессирующие FCU1 бицистронных конструкций, чувствительность к 5-ФЦ 84
3.3.3 Совместная экспрессия 3Cpro и суммированию цитотоксических ферментов 88
3.4 Заключение 90
Выводы 91
Благодарности 92
Список сокращений 94
Список литературы 94
- Каспазы
- Вирусные протеазы
- Индуцируемая ферроптоза
- Клетки, экспрессирующие FCU1 бицистронных конструкций, чувствительность к 5-ФЦ
Каспазы
В 1977 году было обнаружено, что в ходе нормального развития нематоды Caenorhabditis elegans происходит гибель значительного количества соматических клеток, причем эта гибель происходит не хаотично, а зависит от направления и стадии дифференцировки клеток [26]. Это открытие положило начало исследованиям, направленным на изучение молекулярного механизма РКС в C. elegans. В ходе этих работ было показано, что в регулируемой гибели клеток у нематод ключевую роль играют три белка, среди которых CED-3 (от англ. cell death protein 3). Было установлено, что CED-3 – цистеиновая протеаза, которая по своей структуре высоко гомологична интерлейкин-1-конвертирующему ферменту (interleukin-1-converting enzyme, ICE) млекопитающих [27, 28], а в последствии было показано, что индивидуальная экспрессия ICE в клетках мышей вызывает в них РКС [29]. Эти результаты послужили импульсом к активному поиску и в дальнейшем привели к открытию группы цистеиновых протеаз млекопитающих, участвующих в регулируемой гибели клеток. В 1996 году для обозначения данных ферментов был введен термин «каспазы» [30].
Первым представителем каспаз стал фермент ICE, который был переименован в каспазу-1. В настоящее время известно 18 каспаз, из которых в геноме плацентарных млекопитающих обнаружено 15, и еще 3 – в геноме сумчатых [31, 32]. Каспазы являются высокоспецифичными ферментами, поскольку узнают в субстратах последовательность из как минимум 4 аминокислотных остатков (в положениях P4-P3-P2-P1) и гидролизуют пептидную связь строго после Asp в P1, откуда и происходит название семейства – cysteine-aspartic proteases, caspases [33]. Обычно каспазы разделяют на две подгруппы – «воспалительные» и «апоптотические». К первым относятся каспаза-1, -4, -5, -11 и -12, которые, главным образом, регулируют процессинг цитокинов в воспалительных процессах при различных инфекциях; в подгруппу апоптотических каспаз входят каспаза-2, -3, -6, -7, -8, -9 и -10, которые, как следует из названия, играют ключевую роль в регуляции такого типа РКС как апоптоз [34]. Однако эта классификация не совсем корректна, поскольку слишком упрощает реальную ситуацию. Так, например, известно, что каспаза-7 может активироваться каспазой-1 и принимать участие в развитии воспалительных процессов (подробно рассмотрено в [35]), а некоторые воспалительные каспазы способны индуцировать в клетках апоптоз [29, 36]. К тому же, каспаза-14 не может быть отнесена ни к одной из этих подгрупп, поскольку ее функция связана с регуляцией дифференцировки кератиноцитов [37, 38].
В связи с этим каспазы удобнее классифицировать в зависимости от их строения, которое напрямую связанно с их ролью в сигнальном каскаде регулируемых ими процессов. Все каспазы синтезируются в виде неактивных предшественников – прокаспаз, которые состоят из продомена, а также большого (p20) и малого (p10) каталитических доменов [32, 33, 39]. Каспазы-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10, -11 и -12 называют инициаторными, поскольку они первыми активируются в ответ на индуцирующий стимул. Инициаторные каспазы характеризуются длинным продоменом, который содержит один из двух мотивов для белок-белковых взаимодействий: DED (от англ. «death effector domain») или CARD (от англ. «caspase recruitment domain»). Несмотря на различие в функциях, активация всех инициаторных каспаз происходит по схожему механизму. Наиболее подробно данный механизм изучен на примере апоптоза. Апоптоз является первым отрытым и наиболее хорошо изученным типом РКС.
Характерными признаками апоптотической гибели являются: значительное сокращение объема клетки, конденсация хроматина, расщепление геномной ДНК на олигонуклеосомальные фрагменты, экспонирование фосфатидилсерина на внешний слой цитоплазматической мембраны, а также распад клетки на характерные структуры, т.н. «апоптотические тельца», которые поглощаются фагоцитами и соседними клетками [40-42]. При этом цитоплазматическая мембрана в течение длительного времени сохраняет свою целостность и содержимое клетки практически никогда не «вытекает» в межклеточное пространство, поэтому при апоптозе не происходит воспаления и повреждения окружающих тканей. По-видимому, именно эти свойства апоптотической гибели привели к тому, что данный тип РКС является наиболее распространенным и часто используемым живыми организмами. В процессе апоптотической гибели клетка осуществляет процесс контролируемого и рационального «самодемонтажа», причем без постоянного участия других систем организма, за исключением, разве что, иммунной системы в лице фагоцитов, утилизирующих апоптотические тельца на конечной стадии. В связи с этим, апоптоз позволяет локально элиминировать большое количество клеток, не причиняя при этом вреда всему остальному организму.
Апоптоз может запускаться в ответ на внешние или внутренние стимулы и поэтому классифицируется как внешний или внутренний.
Внешний путь апоптоза запускается при связывании внеклеточных лигандов с т.н. «рецепторами смерти» (рисунок 1). Данные рецепторы относятся к суперсемейству факторов некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF) и включают в себя белки TNF receptor-1 (TNFR1), CD95 (также называемый Fas или APO-1), death receptor 3 (DR3), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor-1 (TRAIL-R1; также называемый DR4), TRAIL-R2 (также называемый DR5) и, наконец, DR6 [43]. Связывание лиганда с рецептором смерти вызывает конформационные изменения в структуре рецептора, в результате чего на его участке, экспонированном в цитоплазму, собирается индуцирующий гибель сигнальный комплекс (death-inducing signaling complex, DISC) [44, 45]. В состав DISC входят различные белки, в том числе т.н. «адапторные белки», которые за счет взаимодействия с мотивами продоменов проскапазы-2, -8 и -10 привлекают и удерживают данные прокаспазы в DISC. Например, адапторный белок FADD содержит в своей структуре на С-конце мотивы, взаимодействующие с цитоплазматическими участками активированных рецепторов смерти (в частности Fas), а на N-конце DED мотивы, которые взаимодействуют с DED мотивами продоменов прокаспазы-8 и -10 [46].
Запуск внутреннего пути апоптоза главным образом происходит в случаях, когда ключевые процессы жизнедеятельности клетки нарушаются в такой мере, что клетка больше не в состоянии справиться с этими нарушениями (рисунок 1). Это такие процессы как разрушение цитоскелета, необратимое повреждение геномной ДНК, чрезмерное накопление в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) агрегатов денатурированных белков, окислительный стресс вследствие продукции активных форм кислорода (АФК) и многие другие. В клетке существуют разнообразные механизмы, отслеживающие возникновение перечисленных выше событий. Ключевыми регуляторами внутреннего апоптоза являются белки семейства BCL-2 [47, 48]. Представители данного семейства имеют в своей структуре характерные домены, которые обозначаются как BH1, BH2, BH3 и BH4. Белки, содержащие только BH3-домены (BH3-only proteins, BH3-белки), являются ключевыми сенсорами нарушений жизненно важных клеточных процессов [49-51]. При возникновении данных нарушений происходит активация BH3-белков, главные функции которых заключаются в ингибировании анти-апоптотических и, наоборот, активации про-апоптотических белков, также являющихся представителями семейства BCL-2. К последним относятся белки Bax и Bak [52, 53], которые, будучи активированными, транслоцируются из цитоплазмы в мембрану митохондрий, где они олигомеризуются и формируют поры [54], тем самым вызывая пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий (ПВММ) [55-58]. ПВММ приводит к высвобождению в цитоплазму ряда локализованных в межмембранном пространстве митохондрий белков, среди которых цитохром С (цитС) [59]. В цитоплазме цитС связывается с адапторным белком Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1), в результате чего происходит конформационное изменение последнего, приводящее к его олигомеризации и, тем самым, к формированию комплекса, называемого апоптосомой [60]. В апоптосоме, CARD мотивы на N-конце молекул Apaf-1 взаимодействуют с CARD мотивами продоменов прокаспаз-9, тем самым привлекая и удерживая молекулы последних в комплексе.
Внутри DISC и апоптосомы происходит конформационное изменение и димеризация инициаторных каспаз, что приводит к формированию активного центра данных ферментов (рисунок 1). При этом оказывается, что протеолитическое расщепление, приводящее к отделению продомена, а также p20 и p10 доменов, служит лишь для стабилизации димера и не является обязательным условием активации инициаторных каспаз (подробно рассмотрено в [61]). Активированные инициаторные каспазы в составе соответствующего комплекса (в DISC или в апоптосоме) осуществляют ограниченный протеолиз различных белков, тем самым передавая инициирующий апоптоз сигнал дальше по каскаду. В число субстратов инициаторных каспаз в первую очередь входят другие каспазы, называемые эффекторными [34, 39, 62]. Это каспазы-3, -6 и -7, которые играют ключевую роль в процессе апоптоза, о чем свидетельствуют результаты исследований, в которых показано, что делеция генов данных каспаз в клетках мышей приводит к возникновению в них устойчивости к апоптозу, причем как внешнему, так и внутреннему [63]. В отличие от инициаторных, эффекторные каспазы характеризуются коротким продоменом, который не содержит в своей структуре специфичных для каспаз мотивов [32, 33, 39]. Молекулы прокаспазы-3, -6 и -7 находятся в цитоплазме в виде димеров. При активации они подвергаются ограниченному протеолизу, в результате которого происходит удаление продомена и разделение p20 и p10 доменов на соответствующие субъединицы. Таким образом, каталитически активные эффекторные каспазы представляют собой тетрамеры, состоящие из двух p20 и двух p10 субъединиц [32, 33, 39]. Инициаторные каспазы процессируют и активируют каспазу-3 и -7, а каспаза-6 активируется путем процессинга предшественника каспазой-3; кроме того, активированные эффекторные каспазы способны самостоятельно процессировать свои предшественники, тем самым образуя положительную петлю обратной связи в процессе активации [34, 39, 62]. Эффекторные каспазы получили свое название благодаря тому, что именно они за счет процессинга чрезвычайно широкого спектра клеточных белков [64-66] запускают ряд молекулярных процессов, в конечном итоге приводящих к реализации апоптоза. Субстраты эффекторных каспаз в основном вырождены, хотя при этом каждая из них действует и на собственные специфичные субстраты [67, 68].
Вирусные протеазы
Протеазы играют важную роль в жизненном цикле вирусов. Их основная функция заключается в процессинге вирусных пробелков с целью продукции их зрелых форм. Поскольку расщепление пробелков должно происходить строго в определенных сайтах, в процессе эволюции вирусные протеазы сформировались как высокоспецифичные ферменты, распознающие в своих субстратах аминокислотные остатки в положениях P4-P4 относительно расщепляемой связи, а также чувствительные к пространственной структуре сайта протеолиза (подробно рассмотрено в [264]). Как было обнаружено, вирусные протеазы выполняют и другие важные функции. В частности, они действуют на ряд белков аппарата экспрессии генов, тем самым выключая процессы транскрипции и трансляции собственных генов клетки-хозяина и переключая их на обеспечение репликации вируса; кроме этого, вирусные протеазы могут гидролизовать рецепторы и ключевые белковые медиаторы сигнальных механизмов, вовлеченных в развитие реакций иммунного ответа, тем самым препятствуя запуску противовирусных защитных процессов (подробно рассмотрено в [7]).
К настоящему времени накоплено достаточно большое количество информации о способности протеаз вирусов семейства Picornaviridae вызывать клеточную смерть. Так, например, в геноме полиовируса человека (ПВЧ) закодированы две протеазы – 2А и 3С. Обе протеазы при инфекции не только осуществляют процессинг вирусного полипептида, но и действуют на ряд клеточных белков, регулирующих трансляцию и транскрипцию [265-268]. Индивидуальная экспрессия данных протеаз в клетках человека in vitro вызывает их гибель, сопровождающуюся дисфункцией митохондрий и деградацией геномной ДНК, а в некоторых случаях и активацией каспазы-3 [8, 269]. При этом механизм индукции клеточной смерти при экспрессии протеаз 2А и 3С ПВЧ остается не установленным. Наиболее вероятно, что клеточная смерть запускается вследствие гидролиза вирусными протеазами пока неустановленных клеточных белков. Но есть и другое предположение. Известно, что данные протеазы, главным образом 2А, вызывают в клетке практически полное ингибирование кэп-зависимой трансляции за счет гидролиза вовлеченных в данный процесс трансляционных факторов и вспомогательных белков [265-267, 270]. В этой связи, клеточная гибель может индуцироваться как результат двух процессов: угнетения кэп-зависимого синтеза важных для поддержания жизнедеятельности клетки белков и, наоборот, стимулирования кэп-независимого синтеза про-апоптотических белков. В пользу этого предположения говорит то, что в мРНК некоторых вовлеченных в регуляцию апоптоза белков обнаружены элементы, обеспечивающие их кэп-независимую трансляцию [271-273].
Запуск клеточной гибели в ответ на подавление кэп-зависимой трансляции может также иметь место при инфекции вирусом коксаки В3 (ВКВ3). Вирусы коксаки являются наиболее частой причиной возникновения миокардита – поражения сердечных мышц, нередко приводящего к смерти из-за остановки сердца [274]. Механизмы индукции гибели клеток миокарда в настоящее время не установлены, но известно, что in vitro инфекция ВКВ3 вызывает классический каспазо-зависимый апоптоз [275-277]. Также известно, что в зараженных клетках протеаза 2А ВКВ3, но не протеаза 3С, гидролизует белок DAP5 (death-associated protein 5) на два фрагмента [278]. При этом N-концевой фрагмент DAP5 (N-DAP5), по-видимому, играет важную роль в процессе репликации вируса, поскольку его транзиентная экспрессия в зараженных клетках приводит к продукции значительно большего количества вируса, чего не наблюдается при экспрессии C-концевого фрагмента DAP5 (C-DAP5), а также мутантного белка, лишенного сайта гидролиза протеазой 2А ВКВ3 [278]. DAP5 является трансляционным фактором, обеспечивающим в клетках кэп-независимую трансляцию мРНК. В частности, DAP5 регулирует экспрессию на трансляционном уровне ряда белков, вовлеченных в процессы дифференцировки и пролиферации клеток, а также регулирующих апоптоз [279-281]. Примечательно, что при гидролизе DAP5 протеазой 2А ВКВ3, образующиеся при этом фрагменты по-разному влияют на трансляцию мРНК одних и тех же генов. Так, N-DAP5 повышает экспрессию про-апоптотического белка p53, но не анти-апоптотического Bcl-2, в то время как C-DAP5 приводит к увеличению количества обоих белков [278]. В дополнение к этому, обнаружено, что индивидуальная экспрессия протеаз 3С и 2А ВКВ3 вызывает гибель клеток по пути классического апоптоза. При этом в клетках, экспрессирующих протеазу 3С, но не 2А, наблюдалось повышение количества про-апоптотического белка Bax, в то время как уровень экспрессии белка Bcl-2 существенно не менялся [10]. Таким образом, селективное увеличение количества про-апоптотических белков, наблюдаемое в клетке при инфекции ВКВ3, происходит за счет протеолитической активности протеаз 2А и 3С. Это может быть основной причиной индукции гибели зараженных клеток, которая, по-видимому, служит для высвобождения вирусных частиц в межклеточное пространство для дальнейшего распространения инфекции.
Цитопатический эффект при инфекции энтеровирусом 71 (ЭВ71) обусловлен, главным образом, индуцируемой вирусом гибелью зараженных клеток по пути апоптоза [282-286]. Точный механизм индукции клеточной смерти инфицированных ЭВ71 клеток не установлен, но, по-видимому, важную роль в этом процессе играют вирусные протеазы 2А и 3С. Известно, что протеаза 2А ЭВ71, аналогично протеазам 2А ПВЧ и ВКВ3, ингибирует процесс кэп-зависимой трансляции за счет расщепления тех же трансляционных факторов [287]. Соответственно, можно предположить, что индукция апоптоза при инфекции ЭВ71 происходит по тем же механизмам, что и в случае ПВЧ и ВКВ3 (обсуждалось выше). Кроме этого, показано, что индивидуальная экспрессия протеазы 3С ЭВ71 вызывает гибель клеток по пути каспазо-зависимого апоптоза [9, 288]. Механизм индукции клеточной смерти не установлен, но показано, что ключевую роль в данном процессе играет гидролиз протеазой 3С белка PinX1, поскольку экспрессия мутантного варианта PinX1, лишенного сайта протеолиза, значительно ингибирует индуцируемую протеазой 3C ЭВ71 клеточную гибель [288]. Экспрессия PinX1 обнаруживается практически повсеместно в организме; данной белок является эффективным ингибитором теломеразы и играет важную роль в поддержании целостности теломер [289, 290]. Однако, остается непонятным взаимосвязь деградации данного белка с индукцией в клетках апоптоза.
Протеазы вирусов других семейств также способны индуцировать гибель клеток. Так, протеаза вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1), относящегося к семейству Retroviridae, способна процессировать прокаспазу-8 как in vitro, так и in vivo, генерируя при этом 41 кДа фрагмент, обозначаемый как casp8p41. Данный фрагмент лишен активного сайта протеазы, но содержит BH3-подобный домен, который, по-видимому, «замаскирован» в полноразмерном белке каталитическим доменом [291-293]. Взаимодействие данного BH3-подобного домена в casp8p41 с BH3-доменом белка Bak вызывает активацию последнего, что приводит к ПВММ и индукции апоптоза [294].
Протеазы вирусов семейства Flaviviridae также индуцируют в клетках апоптоз. При этом известно, что индивидуальная экспрессия протеазы NS3 вирусов Лангата и Западного Нила индуцирует апоптотическую гибель путем непосредственного расщепления и активации прокаспазы-8 [295, 296]. В то же время протеаза вируса Денге действует иначе. Белки IB и IB являются эндогенными ингибиторами транскрипционного фактора NF-B, регулирующего в клетке ряд важных процессов, в том числе апоптоз [297-299]. Ограниченный протеолиз данных белков вирусной протеазой приводит к их последовательным фосфорилированию, убиквинтированию и деградации; в отсутствии данных ингибиторов NF-B активируется, что индуцирует в клетках апоптоз через активацию каспаз-8 и -3, но не -9 [300]. В соответствии с этим, гиперэкспрессия IB и IB блокирует клеточную гибель, индуцируемую протеазой вируса Денге [300].
Индуцируемая ферроптоза
Таким образом, из известных на данный момент типов РКС индуцируемая 3Cpro клеточная гибель может быть отнесена только к ферроптозу. Ферроптоз представляет собой относительно недавно открытый и до сих пор мало изученный тип регулируемой смерти, который возникает вследствие интенсивного окисления фосфолипидов в мембранах клеток [340-342]. Процессы образования и накапливания липидных пероксидов при ферроптозе до конца не установлены, но известно, что при этом важную, но на данный момент плохо охарактеризованную, роль играют ионы железа. В связи с этим, при ферроптозе гибель клеток может быть блокирована как использованием хелатирующих железо веществ, так и с помощью метода проточной цитометрии. Клетки А549 трансфицировали конструкциями pCI-3Сmut (А) или pCI-3C (Б), после чего в указанные времена после трансфекции митохондрии окрашивали с помощью MitoProbe (Mito), а лизосомы -акридинового оранжевого (АОг). Результаты представлены как среднее значение трех повторов, планками обозначено стандартное отклонение. Репрезентативная картина окрашивания клеток через 16,5 ч после трансфекции конструкцией pCI-ЗС с помощью Mito и АОг (В): Живые -клетки, характеризующихся наличием активности митохондрий и закисленности лизосом; Неакт. лиз -клетки, характеризующиеся потерей закисленности лизосом при сохранении активности митохондрий; Неакт. мит - клетки, характеризующиеся потерей активности митохондрий при сохранении закисленности лизосом; Некр - некротические клетки, характеризующиеся утратой как активности митохондрий, так и закисленности лизосом. липофильных антиоксидантов, которые встраиваются в мембраны и предотвращают перекисное окисление липидов [343]. К последним относится ферростатин 1 (Fer1), хорошо известный селективный ингибитор ферроптоза [343, 344]. Чтобы проверить влияние данного ингибитора на индуцируемую 3Cpro клеточную гибель, клетки линий HEK293, HeLa и A549 были трансфицированы конструкциями pCI-3Cmut и pCI-3C, а затем культивировались в отсутствии или присутствии в среде Fer1 в течение 18 часов, после чего доля жизнеспособных клеток была оценена с помощью реагента MTS (рисунок 18). В результате эксперимента было показано, что Fer1 эффективно блокирует гибель как трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток (рисунок 18, 3C+Fer1), так и клеток, экспонированных действию 50 мкМ эрастина (рисунок 18, Era+Fer1) – подробно охарактеризованного индуктора ферроптоза [345, 346]. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что гибель клеток при экспрессии 3Cpro вызывается нарушением окислительно-восстановительного баланса в мембранах. Это означает, что индуцируемую 3Cpro клеточную смерть можно считать разновидностью ферроптоза.
Морфология, наблюдаемая в клетках при гибели под действием 3Cpro, соответствует имеющемуся на данный момент представлению о механизме смерти по пути ферроптоза. Известно, что при данной РКС вследствие интенсивного окисления липидов происходит неспецифическая дестабилизация и исследования показывают, что данные процессы происходят одновременно в цитоплазматической мембране, а также мембранах митохондрий, лизосом и эндоплазматического ретикулума HEK293 HeLa A549
Дополнительно, нетрансфицированные клетки инкубировали в присутствии 50 мкМ эрастина (Era), «классического» индуктора ферроптоза, или в присутствии Era совместно с 2 мкМ Ferl (Era+Fer1). Через 18 ч п.т. метаболическую активность клеток анализировали с помощью реагента MTS. Полученные значения нормировали на значения для нетрансфицированных клеток. Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение. se -статистически достоверное различие (тест Манна-Уитни, n = 6, p 0,05).
Таким образом, в результате исследования нами было установлено, что протеаза 3C вируса гепатита А человека индуцирует гибель клеток по пути ферроптоза. Как упоминалось ранее, охарактеризованные к настоящему времени пикорнавирусные протеазы 3С вызывают гибель клеток по пути классического каспазо-зависимого апоптоза [8-10], за исключением протеазы 3С риновируса, которая индуцирует каспазо-независимую смерть клеток [11]. В этой связи, полученные нами результаты представляют ценность с фундаментальной точки зрения, поскольку способность 3Cpro вызывать в клетках ферроптоз может указывать на наличие у вирусного фермента новой ранее неописанной функции. Это, в свою очередь, может указывать на существование ранее неизвестного пути взаимодействия вируса с клеткой-хозяином. В связи с этим, исследование механизма индуцированной 3Cpro клеточной гибели может способствовать более полному пониманию процессов вирусной инфекции человека.
Кроме того, на данный момент это единственный известный случай, когда экспрессия протеазы вызывает в клетках ферроптоз (см. раздел Обзор литературы). Более того, все известные на сегодняшний день индукторы ферроптоза являются низкомолекулярными синтетическими веществами [347]. В настоящее время механизмы возникновения и роль данного типа РКС для функционирования живых организмов, в том числе человека, не известны. При этом в ряде исследований показано, что накопление липидных пероксидов в клетках, приводящее к их дисфункции и гибели, часто ассоциировано со старением [348, 349], а также нейродегенеративными [350, 351] и онкологическими [352, 353] заболеваниями. В этой связи, изучение механизма индуцированного 3Cpro ферроптоза, вероятно, поможет установить роль данного типа РКС.
Клетки, экспрессирующие FCU1 бицистронных конструкций, чувствительность к 5-ФЦ
Для оценки чувствительности к пролекарству клетки HEK293 и HeLa были трансфицированы полученными экспрессионными конструкциями, а затем подвергнуты действию различных концентраций 5-ФЦ в течение 7 дней, после чего метаболическая активность клеток в трансфицированных культурах анализировалась с помощью реагента MTS.
Было установлено, что действие 5-ФЦ на клетки обеих линий было сходным для всех конструкций, несущих ген FCU1 (рисунок 28, pFCU1, pFCU1-3Cmut и pFCU1-3C): значительный цитотоксический эффект проявлялся уже при 1 мкМ и достигал максимума при 1000 мкМ 5-ФЦ. При этом в случае одинаковых концентраций 5-ФЦ в среде цитотоксический эффект, обеспечиваемый моноцистронной конструкцией pFCU1, был выражен сильнее (особенно в случае клеток HEK293), чем для бицистронных конструкций pFCU1-3C и pFCU1 3Cmut, что может быть связано с обсуждавшимися выше различиями в уровнях экспрессии FCU1. Эту тенденцию отражают также рассчитанные на основе полученных результатов значения IC50 (таблица 3), однако, учитывая разбросы экспериментальных данных, наблюдаемые различия нельзя считать достоверными. В то же время, в ходе эксперимента было отмечено, что все конструкции, содержащие ген активной 3Сpro, при введении в клетки вызывают их гибель независимо от концентрации 5-ФЦ (данные не представлены). При этом в случае гена, кодирующего каталитически неактивную 3Cmut, гибель клеток не наблюдалась, что соответствует полученным нами ранее данным о связи цитотоксического действия вирусного фермента с его протеолитической активностью. Таким образом, в ходе эксперимента нами было установлено, что экспрессия гена FCU1 в составе бицистронных конструкций обеспечивает цитотоксический эффект, сравнимый с действием, обусловленным моноцистронной конструкцией. При этом в случае конструкции pFCU1-3C цитотоксический эффект FCU1 проявляется даже на фоне действия 3Сpro.