Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время сепсис является одной из наиболее сложных проблем медицины. Так, в США и странах Европы сепсис ежегодно диагностируется у 700 000 пациентов, причем число подтвержденных случаев растет на 1,5% в год (Riedemann et al, 2003). Несмотря на огромное число работ, посвященных этому вопросу, и значительные успехи в области выяснения механизмов развития, сепсис, а также его осложнение, септический шок, остаются главной причиной смерти в палатах интенсивной терапии (Cross, Opal, 2003) и занимают 13-е место среди всех причин смертности в США (Parrillo, 1993). По данным за последние десятилетия госпитальная смертность от сепсиса варьирует от 25 до 80% (Angus, Wax, 2001). При этом сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями, встречается в 45-60% случаев от общего числа заболевших и в 65-70% случаев становится причиной эндотоксинового шока (Bone, 1995), в патогенезе которого ключевая роль принадлежит липополисахаридам (Rietschel et al., 1994).
Эндотоксины (липополисахариды, ЛПС) - это компоненты бактериальной стенки, играющие основную роль в инициировании ответа организма на вторжение грамогрицательных бактерий. В случае массивного попадания бактерий в организм происходит активация клеток-мишеней эндотоксинами, что вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием. Высвободившиеся свободно циркулирующие цитокнны активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что, в конечном итоге, приводит к развитию эндотоксинового шока (Rietschel et al., 1996).
Основными стрессовыми белками у многих организмов, включая млекопитающих, являются белки теплового шока (БТШ), в частности БТШ70, интенсивный синтез которого индуцируется в клетке самыми разными стрессовыми агентами (Lindquist, Craig, 1988; Welch, 1993; Hard, Hayer-Hartl, 2002; Todryk et al., 2003; Kiang, 2004). В последние годы появилось много данных о том, что БТШ70 могут находиться во внеклеточном пространстве, функционируя как специализированные сигнальные молекулы - цитокины (Asca et al., 2000). Появление внеклеточного БТШ70 вызывает активацию различных звеньев иммунной системы, воспринимаясь ею как сигнал «опасности». Это приводит к усилению продукции цитокинов, повышению скорости фагоцитоза и активации системы комплемента, что увеличивает его потенциал, как противовоспалительного фактора (Евдонин, Медведева, 2009). Следует отметить, что данные эффекты вызывает как БТШ70, высвобождаемый из клеток во внеклеточное пространство, так и добавленный экзогенный белок (Zheng et al., 2010).
В работах на крысах, ранее выполненных нами совместно с центром по испытанию лекарственных препаратов в г. Пущино, было показано, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, до введения ЛПС оказывает защитное действие, снижая смертность животных и влияя на параметры их гемостаза и гемодинамики (Kustanova et al., 2006). Было важно
повторить эти эксперименты не только на модельных животных, но и на различных типах клеток, используя чистый рекомбинантный человеческий БТШ70, наработанный в экспрессионной системе в клетках шелкопряда {Spodoptera frugiperda). Для лучшего понимания процессов, происходящих в клетке, было необходимо выявить молекулярные механизмы действия экзогенного БТШ70, и показать, что данный препарат обладает значительным антисептическим эффектом, не зависящим от контаминации белка ЛПС.
Для того чтобы охарактеризовать защитную роль экзогенного БТШ70 млекопитающих на клеточном уровне, мы исследовали комбинированное действие БТШ70 и ЛПС на миелоидных клетках млекопитающих, которые играют важную роль в ответе системы врожденного иммунитета на полимикробный сепсис (Ulmer et al., 2002).
Основными клетками, участвующими в воспалении и обеспечивающими устойчивость к инфекциям, являются нейтрофилы, моноциты и макрофаги. Макрофаги и моноциты под действием ЛПС продуцируют различные цитокины и клеточные медиаторы и играют важную роль в развитии сепсиса.
Известно, что в воспалительном ответе на ЛПС-индуцированный бактериальный сепсис ключевую роль играют нейтрофилы (Alves-Filho et al., 2008). ЛПС праймирование нейтрофилов вызывает усиление продукции активных форм кислорода (АФК) и экспрессию р2-интегриновых рецепторов (Everton et al., 2009; Detmers et al., 1998). Кроме того, под действием эндотоксинов происходит ингибирование апоптоза этих клеток, препятствующее эффективному клиренсу нейтрофилов, что становится причиной повреждения тканей при воспалении. В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход к лечению ряда воспалительных заболеваний, в том числе и сепсиса (Wesche-Soldato et al., 2007).
Большая часть исследований по защитной роли БТШ70 против действия ЛПС проводилась с использованием рекомбинантного человеческого белка, экспрессированного в Е. coli, а потому зачастую загрязненного бактериальными эндотоксинами (Tsan, Gao, 2009). Было важно провести анализ препаратов БТШ70 млекопитающих различного происхождения на возможные антисептические эффекты. Для сравнения выбрали рекомбинантный человеческий индуцибельный БТШ70 (рБТШ70), экспрессированный в клетках Spodoptera и БТШ70, выделенный из сердечной мышцы верблюда, ткани, имеющей высокую концентрацию БТШ70. В обоих случаях было показано явное защитное влияние БТШ70 на активацию и апоптоз нейтрофилов человека при действии ЛПС из Е. coli. Мы исследовали также возможные антисептические эффекты БТШ70 на макрофагах, чтобы определить, насколько универсально действие данного белка. Для лучшего понимания процессов, лежащих в основе защитного влияния БТШ70 при ЛПС-индуцированном сепсисе, было необходимо изучить, что происходит в клетках на молекулярном уровне. Для этого мы сравнили белковые паттерны макрофагов при комбинированном воздействии теплового шока, рБТШ70 и ЛПС. Мы обнаружили и идентифицировали ряд белков, изменяющих свою экспрессию в ответ на данные воздействия.
Цель работы. Изучение роли препаратов БТШ70 млекопитающих в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина (ЛПС). Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Исследовать влияние рекомбинантного человеческого БТШ70, экспрессированного в клетках Spodoptera, на смертность животных в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса у крыс,
-
Исследовать влияние экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) на функциональные ответы нейтрофилов, вызываемые действием эндотоксина из Е. coli (ЛПС), а именно на:
а) генерацию активных форм кислорода;
б) экспрессию р2-интегриновых рецепторов;
в) апоптоз.
-
Исследовать влияние препаратов БТШ70 и ЛПС на продукцию N0 макрофагами.
-
Изучить воздействие комбинированной обработки макрофагов тепловым шоком (ТШ) и ЛПС на продукцию N0.
-
Провести анализ белковых паттернов макрофагов при комбинированном воздействии ЛПС, рБТШ70 и ТШ, и идентифицировать белки, экспрессия которых значительно меняется в ответ на такие воздействия.
Научная новизна. Впервые показан на клеточном уровне защитный эффект экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердечной мышцы верблюда) при действии бактериального эндотоксина. Установлено, что предварительное введение БТШ70 снижает генерацию АФК в различных типах миелоидных клеток, нормализует апоптоз нейтрофилов, ингибируемый при их стимуляции ЛПС, снижает ЛПС-индуцированный уровень экспрессии (32-интегриновых рецепторов нейтрофилов. Идентифицированы белки, изменяющие свою экспрессию в ответ на комбинированное действие ТШ, рБТШ70 и ЛПС, что расширяет наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе антисептической роли БТШ70 при эндотоксемии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Рекомбинантный человеческий БТШ70, экспрессированый в клетках Spodoptera, обладает антисептическими свойствами, значительно снижая процент смертности крыс в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса.
-
Предварительное введение экзогенных БТШ70 (рекомбинантного и выделенного из сердца верблюда) демонстрирует защитный эффект, влияя на функциональные ответы и апоптоз нейтрофилов при действии ЛПС из Е. coli.
-
Прекондиционирование макрофагов с препаратами БТШ70 снижает ЛПС-индуцированную продукцию N0.
-
Предварительная обработка макрофагов ТШ снижает продукцию N0, обусловленную действием ЛПС из Е. coli.
-
Защитный эффект БТШ70 при действии ЛПС реализуется на молекулярном уровне, затрагивая различные сигнальные пути в клетке.
Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты демонстрируют важную роль экзогенного внеклеточного БТШ70 млекопитающих в модуляции врожденного иммунитета, что делает этот белок многообещающим для создания на его основе эффективных противовоспалительных лекарств.
Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований -от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: 13th Congress of the International Association of Biomedical Gerontology: "Aging, cancer and age-related diseases; common mechanisms?" (Quebec, Canada,); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009); Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010).
Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 7 печатных работах, из них 3 - статьи в рецензируемых научных журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на страницах и
Похожие диссертации на Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина
