Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Общий план строения хемокинов и их рецепторов 14
1.2. Внутриклеточные изменения и пути передачи сигнала при действии хемокинов 16
1.3. Функции хемокинов
1.3.1. Функции CXC-хемокинов и их рецепторов 17
1.3.2. Функции СС-хемокинов и их рецепторов 19
1.3.3. Функции СХЗС- и С-хемокинов и их рецепторов
1.4. Хемокины, их рецепторы и раковые клетки 22
1.5. Роль хемокинов и их рецепторов в прогрессии аутоиммунных патологий на примере рассеянного склероза 26
1.6. Структура и регуляторные элементы гена хемокинового рецептора на примере CXCR5 27
1.7. Белок р53 и его влияние на развитие опухоли 29
1.8. Транскрипционные факторы семейства р53 - р63 и р73 - и их роль в развитии опухоли 32
1.9. Характеристика транскрипционных факторов семейства NFDВ 34
1.10. Взаимная регуляция белков семейства р53 и транскрипционных факторов семейства
NFDB 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Поиск регуляторных элементов гена CXCR5 при помощи онлайн-сервисов 38
2.2. Методы работы с эукариотическими клеточными культурами
2.2.1. Культивирование клеточных линии MCF-7, ВТ-20, Raji и Daudi 39
2.2.2. Снятие прикрепленных клеток с культуральных планшетов и матрасов 40
2.2.3. Замораживание и размораживание эукариотических клеток 40
2.2.4. Са-фосфатная трансфекция клеток линии НЕК-293Т экспрессионной конструкцией, содержащей ген хемокина CXCL13 41
2.2.5. Трансфекция клеток MCF-7 и ВТ-20 с использованием PEI 41
2.2.6. Электропорация клеток линий Raji, Daudi и MCF-7 42
2.2.7. Хемотактический тест в агарозных каплях (Wiggins et al, 2010) 42
2.2.8. Хемотактический тест с использованием культуральных вставок фирмы Geiner Bio-One 43 2.2.9. Индукция CXCR5-опосредованного сигнального каскада с использованием хемокинаСХСЫЗ 44
2.2.10. Активация В-лимфобластоидных клеток линий Raji и Daudi с использование LPS,
РМА и иономицина 44
2.3. Молекулярно-биологические методы 44
2.3.1. Выделение тотальной РНК из клеток 44
2.3.2. Определение концентрации РНК/ДНК в растворе 45
2.3.3. Горизонтальный электрофорез РНК/ДНК в агарозном геле 46
2.3.4. Синтез первичной цепи кДНК (обратная транскрипция) 46
2.3.5. Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 47
2.3.6. Анализ содержания белков в исследуемых клетках методом Вестерн-блоттинг 51
2.3.7. Получение компетентных клеток E.coli (штамм DH5) 52
2.3.8. Трансформация бактериальных клеток (штамм DH5) плазмидной ДНК методом теплового шока 52
2.3.9. Выделение плазмидной ДНК 2.3.9.1. Miniprep с использованием набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit 53
2.3.9.2. Midiprep с использованием набора GeneJET Plasmid Midiprep Kit 53
2.3.10. Создание люциферазных репортерных конструкций 54
2.3.10.1. Общая схема клонирования промотора и энхансера гена CXCR5 в люциферазную репортерную плазмиду pGL3 basic 54
2.3.10.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56
2.3.10.3. Очистка продуктов амплификации от других компонентов ПЦР-смеси 57
2.3.10.4. Рестрикция фрагментов ДНК 58
2.3.10.5. Реакция лигирования 58
2.3.10.6. Проверка собранных конструкций 58
2.3.10.7. Внесение делеций в промотор гена CXCR5 59
2.3.10.8. Внесение точечных мутаций в потенциальные сайты связывания факторов семейства NFDB, расположенные на промоторе гена CXCR5 61
2.3.10.9. Создание промотора CXCR5, содержащего минорный “А” вариант полиморфизма rs630923 и внесение точечных мутаций в потенциальный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C
2.3.10.10. Создание NFkB-зависимой люциферазной репортерной конструкции 63
2.3.10.11. Тестирование активности конструкций с геном-репортёром Firefly luciferase 64 2.3.11. Определение связывания транскрипционного фактора семейства NFkB p65 с последовательностью промотора CXCR5 in vivo методом хроматиниммунопреципитации (CHIP) 65
2.3.12. Определение связывания транскрипционного фактора MEF2C с фрагментами промотора CXCR5 методом DNA pull-down 67
2.3.13. Инактивация генов p73 и MEF2C с использованием siRNA 69
2.3.14. Инактивация генов p53 и p63 в клетках MCF-7 с использованием системы программируемой геномной нуклеазы CRISPR/Cas9
2.3.14.1. Подбор последовательностей для направляющих РНК (crRNA) 70
2.3.14.2. Интеграция последовательностей для синтеза crRNA в плазмиду px461 73
2.3.14.3. Создание донорных конструкций для внесения кассет, экспрессирующих флуоресцентные белки, в места вносимых Cas9 целевых разрезов 74
2.3.14.4. Электропорация клеток MCF-7 плазмидами для инактивации генов p53 и p63, отбор клеток с отредактированным геномом 75
2.4. Статистический анализ полученных данных 76
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 78
3.1. Роль основного опухолевого супрессора p53 в регуляции активности гена CXCR5 78
3.1.1. Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к увеличению уровня экспрессии CXCR5 и активации CXCL13-индуцируемого сигнального каскада 78
3.1.2. Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к повышению CXCL13-зависисой миграционной активности клеток 81
3.1.3. Предположительные цис-регуляторные элементы гена CXCR5 были идентифиицрованы с использованием биоинформатических баз данных 83
3.1.4. Активность промотора гена CXCR5 увеличивается в 1,4 раза при подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ MCF-7, в то время как предположительный энхансер гена CXCR5 повышает ее в среднем на 15 % 85
3.1.5. Участки 3 и 5 играют ключевую роль как в базовой активности промотора, так и в его зависимости от уровня белка p53 в клетках MCF-7 86
3.1.6. Точечная мутация предсказанных сайтов связывания NFkB в промоторе гена CXCR5 приводит к падению базовой активности промотора, а также ее невосприимчивости к уровню белка p53 88
3.1.7. Изменения активности транскрипционных факторов семейства NFkB в клетках РМЖ MCF-7 напрямую влияют на активность промотора гена CXCR5 91
3.1.8. Связывание факторов NFkB с предсказанными сайтами в промоторе CXCR5
подтверждено in vivo, а сила свзяывания демонстрирует обратную зависимость от статуса белка p53 в клетках РМЖ 93
3.2. Роль факторов p63 и p73, гомологов p53, в регуляции активности гена CXCR5 в условиях генотоксического стресса 94
3.2.1. Инактивация гена p53 с использованием системы CRISPR/Cas9 привела к исчезновению мРНК и белка p53, что коррелирует с ростом уровня экспрессии CXCR5 94
3.2.2. Повышение концентрации ДНК-повреждающего агента MMS и времени инкубации с ним приводит к снижению уровня экспрессии CXCR5 как в клетках MCF-7, так и MCF-7-p53off, но в разной степени 96
3.2.3. Инкубация с MMS приводит к подавлению уровня экспрессии CXCR5 как в клетках MCF-7, так и в клетках MCF-7-p53off с инактивированным геном p53, в которых также происходит активация экспрессии генов p63 и p73 99
3.2.4. Инактивация гена p63 с использованием системы CRISPR/Cas9 и гена p73 с помощью siRNA приводит к значительному снижению уровней их экспрессии и их невосприимчивости к генотоксическому стрессу 101
3.2.5. Белки p63 и p73 подавляют экспрессию гена CXCR5 только в клетках MCF-7 с инактивированным p53 и при генотоксическом стрессе 104
3.2.6. Миграционная активность клеток РМЖ MCF-7 по градиенту концентрации хемокина CXCL13 зависит от статуса белков p63 и p73 в клетках MCF-7 с инактивированным p53 и при генотоксическом стрессе 105
3.2.7. Уровень активности промотора гена CXCR5 в нормальных условиях демонстрирует зависимость от статуса белка p53, а при генотоксическом стрессе – от всех белков семейства p53 107
3.2.8. Делеции участков 3 и 5 приводят к полной невосприимчивости промотора CXCR5 к уровню белков p53, p63 и p73 в клетках РМЖ MCF-7 в нормальных условиях и при генотоксическом стрессе 108
3.2.9. Активность транскрипционных факторов семейства NFkB напрямую зависит от статуса белков p53, p63 и p73 в клетках РМЖ человека MCF-7 при генотоксическом стрессе 111
3.2.10. Мутация всех сайтов связывания NFkB в промоторе CXCR5 приводит к невосприимчивости активности промотора к статусу белков p53, p63 и p73 иуровню генотоксического стресса в клетках РМЖ MCF-7 112 3.2.11. Связывание NFkB с сайтами 2 и 3 в промоторе гена CXCR5 напрямую зависит от уровня экспрессии p53, p63 и p73 в клетках РМЖ человека MCF-7 114
3.2.12. Антагонизм систем p53 и NFkB может также лежать в основе регуляции ряда других генов, активных в опухолях, что показано на примере гена кластерина in silico 116
3.3. Роль полиморфизма rs630923, ассоциированного с развитием рассеянного склероза,
в регуляции промотора гена CXCR5 117
3.3.1. Влияние однонуклеотидного полиморфизма rs630923 на уровень активности промотора CXCR5 не связано с активностью NFkB 117
3.3.2. Предположительный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциирован с минорным “A” вариантом полиморфизма rs630923 в промоторе гена CXCR5 119
3.3.3. Фактор MEF2C демонстрирует связывание с вариантом промотора гена CXCR5, несущим минорный “А” вариант полиморфизма rs630923 119
3.3.4. Наличие функционального сайта связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциированно со сниженной активностью промотора CXCR5 в активированных B-лимфобластоидных клетках линий Raji и Daudi 122
Заключение 127
Выводы 131
Список литературы 132
- Внутриклеточные изменения и пути передачи сигнала при действии хемокинов
- Методы работы с эукариотическими клеточными культурами
- Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к повышению CXCL13-зависисой миграционной активности клеток
- Предположительный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциирован с минорным “A” вариантом полиморфизма rs630923 в промоторе гена CXCR5
Внутриклеточные изменения и пути передачи сигнала при действии хемокинов
Гомеостатические хемокины играют большую роль в процессах развития организма. CXCL12 (SDF-1) постоянно экспрессируется в ассоциированных с костным мозгом стромальных клетках, индуцируя пролиферацию предшественников B-клеток и мобилизуя миграцию гематопоэтических стволовых клеток в костный мозг во время эмбриогенеза. Показано, что мыши, дефектные по CXCL12 или по его специфичному рецептору CXCR4 умирают в ходе перинатального развития из-за сбоев в B-лимфопоэзе и миелопоэзе. Кроме того, мыши, лишенные CXCL12/CXCR4, имеют другие отклонения в развитии, такие как нарушения в развитии мозжечка и межжелудочковой перегородки сердца (Ma et al, 1998).
Тимус играет ключевую роль в развитии T-лимфоцитов. В нем обнаружена повышенная экспрессия CXCL12. Хемокины в тимусе отвечают за миграцию предшественников T-клеток из кортекса в центральную часть и выход зрелых Т-клеток из тимуса (Bleul et al, 2000).
B-клетки, циркулирующие по лимфоидным органам, в большом количестве экспрессируют рецептор CXCR5, который, посредством взаимодействия с хемокином CXCL13, способствует миграции B-клеток в фолликулярные области и их последующее созревание. CXCL13 экспрессируется в специфических B-клеточных областях лимфатических узлов стромальными и фолликулярными дендритными клетками. Для мышей с дефектами в экспрессии CXCR5/CXCL13 характерны нарушения в миграции B-клеток в области вторичных лимфоидных органов, что приводит к дезорганизации лимфатических узлов и снижению иммунного ответа (Junt et al., 2005). Для активации B-клеток в фолликулах, приводящей к их созреванию, пролиферации и продукции антител, необходимо их взаимодействие с фолликулярными T-хелперами. Для фолликулярных T-хелперов также характерна повышенная экспрессия CXCR5, что обеспечивает их локализацию в B-клеточных областях фолликулов с повышенной экспрессией CXCL13. Таким образом, у мышей с инактивированным CXCR5 наблюдаются нарушения в координации взаимодействия B-клеток с T-хелперами, что приводит к снижению гуморального иммунного ответа (Moser, 2015).
Во время активации незрелых В-клеток в герминальном центре, они невосприимчивыми к CXCL12, несмотря на экспрессию CXCR4. После полного созревания B-клеток они становятся полностью восприимчивыми к CXCL12, который экспрессируется в областях, окружающих фолликулы. Такой механизм препятствует выходу несозревших клеток из герминальных центров (Olson et al, 2002).
Физиологический ангиогенез протекает быстро, но подвержен жесткой регуляции. Хемокины играют роль как позитивных, так и негативных регуляторов ангиогенеза. CXC-хемокины, содержащие ELR мотив, CXCL8, CXCL5, CXCL1,2,3 индуцируют формирование сосудов (исследовано на роговице кролика). Напротив, ELR негативные хемокины CXCL4, CXCL10, CXCL9 подавляют индукцию ангиогенеза ELR позитивными хемокинами. В то же время, CXCL12, несмотря на отсутствие ELR мотива, выступает в качестве индуктора ангиогенеза (Streiter et al, 1995).
Показано, что хемокины контролируют процессы острого и хронического воспаления, способствуя проникновению воспалительных клеток в поврежденные или инфицированные ткани и их активации. Члены CXC семейства хемокинов вовлекаются в патогенез соматического воспалительного ответа. При бактериальной пневмонии привлечение нейтрофилов, опосредованное CXC-хемокином, необходимо для ликвидации чужеродных микроорганизмов. В качестве примера можно привести повышенную экспрессию CXCL1 в легких, что позволяет организму эффективно бороться с пневмонией.
T-клетки, способные проникать в легкие, экспрессируют CXCR3, рецептор к CXCL10, что необходимо для привлечения Th1 клеток в хронически воспаленные легкие (Le et al, 2004).
Высокие концентрации CXCL8, CXCL5, CXCL1 обнаружены в сыворотке, синовиальной жидкости и синовиальной ткани пациентов, больных ревматоидным артритом. Эти хемокины привлекают нейтрофилы и индуцируют ангиогенез. CXCL12, экспрессируемый в синовиальной мембране больных артритом, привлекает CD4+ T-клетки памяти, которые экспрессируют CXCR4 в повышенных количествах. Также CXCL12 может индуцировать миграцию дендритных клеток из кровяного русла в ревматоидную область, провоцируя их на аутоимунный ответ.
При рассеянном склерозе белые T-клетки и астроциты, проникающие в пораженные ткани экспрессируют CXCR3 (Le et al, 2004).
Показано, что клетки мозгового слоя надпочечников активно экспрессируют хемокиновый рецептор CXCR7. У мышей с гиперплазией надпочечников (SCH), экспрессируемые клетками SCH опиоидные пептиды-интермедиаты, выступая в качестве лигандов CXCR7, приводят к его активации, что паракринным образом вызывает повышенную секрецию глюкокортикоидов в ходе циркадных колебаний. Все это в конечном итоге приводит к сниженной тревожности мышей с гиперплазией по сравнению с контрольными группами (Ikeda et al, 2013).
Известно, что некоторые вирусы содержат гены, кодирующие хемокины и хемокиновые рецепторы, которые способны, взаимодействуя с клетками хозяина, подрывать работу иммунной системы. В частности, известен ряд антагонистов хемокина CXCL12 (например, vMIP-II, СС-хемокин, кодируемый вирусом герпеса, ассоциированным с саркомой Капоши), способных к высокоафинному связыванию с рецептором CXCR4 и регуляции активности иммунной системы (Qin et al, 2015).
Многие CC-хемокины подавляют in vitro пролиферацию предшественников миелоидных клеток. Например, показано, что повышенная экспрессия CCL3 ингибирует клеточный цикл и способствует уменьшению общего числа предшественников клеток костного мозга. Мыши, испытывающие недостаток в CCR1, главном рецепторе хемокина CXCL3, показывают повышенный уровень пролиферации миелоидных клеток, а также мобилизации лейкоцитов в кровяном русле. Для хемокинов CCL25, CCL17, CCL21, CCL19 характерна повышенная экспрессия в тимусе. Там они выполняют функции, аналогичные функциям CXCL12, описанным выше. Например, CCL25 продуцируется дендритными клетками тимуса и является селективным хемоаттрактантом для незрелых T-клеток (Bleul et al, 2000).
Некоторые CC хемокины могут принимать активное участие в развитии вторичных лимфоидных органов. Так, CCL21 и CCL19 индуцируют регенирацию лимфоидных органов в ходе эктопической экспрессии в островках поджелудочной железы мышей.
Характер миграции лимфоцитов в лимфоидные и нелимфоидные ткани и их циркуляции между вторичными лимфоидными органами зависит от хемокинов, экспрессирующихся в разных тканях. CCL19, ССL21 (связываются с CCR7) экспрессируются в лимфатических сосудах, высоком эндотелии посткапиллярных венул и вторичных лимфоидных органах, способствуя входу антиген-представляющих клеток, T-клеток и B-клеток в эти органы (Cyster, 1999).
Предшественники резидентных дендритных клеток в периферических тканях поглощают с помощью фагоцитоза микроорганизмы и клеточный дебрис и могут быть активированы патогенами или антигенами. При созревании эти клетки начинают экспрессировать CCR7, что позволяет им мигрировать по градиенту хемокинов через лимфатические сосуды в лимфатические узлы и проникать в T-клеточные зоны, где они представляют эпитопы антигена T-клеткам.
ССL19 и CCL21 отвечают за расположение лимфоцитов в лимфоидных органах. Так, CCL19 и ССL21, выделяемые дендритными и стромальными клетками, удерживают T-клетки внутри T-зон вторичных лимфоидных органов. ССR7 наравне с CXCR5 контролирует расположение B-клеток в фолликулах и T-клеточных зонах селезенки, где зрелые B-клетки взаимодействуют с T-клетками.
CC-хемокины, так же как и CXC, вовлечены в процесс ангиогенеза. Показано, что CCL1, CCL2, CCL11 могут выступать в качестве факторов ангиогенеза, а ССL21 – потенциальный фактор ангиостазиса (Bernardini et al, 2003).
Некоторые CC-хемокины, такие как CCL3 и CCL5, экспрессируются при сепсисе и обеспечивают провоспалительные эффекты, вызывая орган-специфическую миграцию лейкоцитов и их активацию. Хемокины играют ключевую роль в регуляции легочного воспаления. Кинетика продукции CCL2, CCL11, CCL17 и CCL22 коррелирует с привлечением в воздухоносные пути специальных лейкоцитов, имеющих рецепторы к этим хемокинам (Gerard et al, 2001).
Методы работы с эукариотическими клеточными культурами
Трансфекцию производили с целью наработки хемокина CXCL13. Использовали набор фирмы Promega (ProFection Mammalian Transfection System) для Ca-фосфатной трансфекции. Для экспрессии CXCL13 или IL7 использовали конструкцию pCDNA3.1 hygro(+), содержащую ген CXCL13 или IL7 соответственно. Схема конструкции, содержащей ген CXCL13, представлена на рисунке 7.
Рассевали клетки HEK-293T в 6-луночный планшет так, чтобы на следующий день их плотность составляла 30-40% конфлюэнтности. На следующий день меняли у клеток среду. 2x HBS и CaCl2 из набора размораживали и нагревали до комнатной температуры. В одну лунку вносили 100 мкл комплекса: 50 мкл 2x HBS, 6,25 мкл CaCl2, 0,6 мкг плазмидной ДНК, до нужного объема доводили водой. Сначала смешивали раствор ДНК с водой, к нему по каплям добавляли раствор CaCl2. Полученный раствор по каплям добавляли к 2x HBS, инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Добавляли комплекс к клеткам. Кондиционную среду снимали через 48 часов.
PEI (полиэтиленимин) представляет собой широко используемый полимерный агент для трансфекции эукариотических клеток. PEI образует с ДНК положительно заряженные комплексы, способные связываться с поверхностью клетки и поступать в нее посредством эндоцитоза (Boussif et al, 1995).
Рассевали клетки в 6-луночный планшет так, чтобы на следующий день их плотность составляла 30-40% конфлюэнтности. На следующий день меняли у клеток среду. PEI, хранение которого осуществляли при -70оС, размораживали. В пробирке смешивали 300 мкл бессывороточной среды DMEM, 4,6 мкл раствора PEI (1 мкг/мкл), 2 мкг соответствующей плазмидной ДНК и 100 нг ко-трансфецируемой плазмиды pRL cmv (Promega), несущей независимый репортёрный ген люциферазы Renilla, для выравнивания результатов трансфекции. Осуществляли инкубацию в течение 20 минут при комнатной температуре. Полученный раствор добавляли к клеткам. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37оС и 5% CO2, после чего тестировали активность люциферазы в клетках.
Электропорацию проводили с использованием капиллярного электропоратора Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific). Все процедуры проводили в соответствии с протоколами производителя. На одну точку электропорации брали 5 млн клеток Raji и Daudi и 1 млн клеток MCF-7. Клетки осаждали при 1100 об/мин в течение 4 минут (Laboratory centrifuge LMC3000), ресуспендировали в 100 мкл буферного раствора R (входит в комплект фирменного набора для электропорации), смешивали с 5 мкг плазмиды, набирали полученную суспензию в капилляр для электропорации с электродом, помещали капилляр в кювету с фирменным буфером E2, после чего проводили электропорацию. После электропопрации суспензию незамедлительно помещали в заранее подготовленный культуральный матрас с полной средой DMEM/RPMI. Условия электропорации зависели от клеточной линии: 1) MCF-7: напряжение импульса 1100 В, длительность импульса 30, количество импульсов 2. 2) Raji и Daudi: напряжение импульса 1300 В, длительность импульса 30 мсек, количество импульсов 1. Выживаемость клеток Raji и Daudi составляла около 80%, MCF-7 – около 70%.
Данный метод может быть использован для оценки степени подвижности клеток в ответ на градиент хемокинов. Это полезно для оценки функциональности рецепторов к хемокинам в исследуемых клетках. Плюсами данного метода являются простота и скорость выполнения, а также цена реактивов и доступность оборудования. Метод основан на миграции клеток под капли агарозы, содержащие необходимый хемокин. Для работы использовали 6-луночные планшеты. В каждую лунку планшета помещали покровное стекло. 0,5% раствор легкоплавкой агарозы, приготовленный на PBS, нагревали до 80оС, охлаждали до 40оС и смешивали в соотношении 4:1 с кондиционной средой (хранили при 20оС), снятой с клеток HEK293 (инкубация 48 часов), продуцирующих CXCL13 человека (опыт) или IL-7 (контроль). Полученный раствор наносили на покровное стекло в виде капель объемом 5-10 мкл. После нанесения капель на покровное стекло, плашку инкубировали на +4оС до полного застывания капель (примерно 5 минут). Сверху на капли аккуратно наливали 2 мл суспензии исследуемых клеток (концентрация клеток 0,5 млн. клеток/мл), после чего планшет ставили на инкубацию при 37оС в течение 12-16 часов.
Анализ прохождения хемотаксиса осуществляли с помощью микроскопа на 150-кратном увеличении. Для каждого типа клеток выполняли подсчет клеток в 10 каплях агарозы одинакового диаметра, вычисляли среднее количество клеток в одной капле и % мигрировавших клеток от общего количества внесенных клеток.
Для количественной оценки хемотактической активности клеток по градиенту концентрации хемокина CXCL13 использовали вставки для 12-луночных планшетов ThinCert с порами диаметром 8 мкм (Greiner Bio-One).
В лунки 12-луночного планшета наливали по 450 мкл среды DMEM и 150 мкл кондиционной среды, содержавшей хемокин CXCL13 (см. п. 2.4); в качестве контроля использовали лунки, содержавшие 450 мкл среды DMEM и 150 мкл кондиционной среды, содержавшей цитокин IL-7. В лунки помещали вставки, на которые сверху наносили по 200 мкл суспензии клеток MCF-7 или MCF-7-2Si. Планшет со вставками инкубировали в течение 24 часов при 37оС и 5% CO2. После инкубации вставки переносили в новый 12-луночный планшет, содержавший по 500 мкл трипсина в каждой лунке. Планшет со вставками инкубировали в течение 10 минут при 37оС и 5% CO2. Клетки, оказавшиеся в растворе трипсина, осаждали при 1100 об/мин в течение 4 минут, после чего ресуспендировали в 200 мкл среды DMEM и переносили в 96-луночный планшет. В каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma) концентрацией 5mg/ml в PBS. Планшет инкубировали в течение 24 часов при 37оС и 5% CO2, после чего добавляли по 50 мкл солюбилизирующего раствора (0,1 мг/мл SDS, 0,6% уксусной кислоты в PBS) и инкубировали в течение 3 часов при 37оС при постоянном перемешивании. Планшет считывали на фотометре микропланшетном Мультискан Ассент (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 570 нм. Калибровочную кривую (рис.8.) строили, внося в лунки 96-луночного планшета известное количество клеток.
Подавление экспрессии p53 в клетках РМЖ человека MCF-7 приводит к повышению CXCL13-зависисой миграционной активности клеток
Для осуществления теста активности транскрипции репортерной конструкции в клетках использовали набор Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, E1910). Клетки прикрепленных линий MCF-7 и BT-20 отмывали PBS, затем лизировали посредством добавления по 0,5 мл лизис-буфера (Passive lysis buffer) в каждую лунку 6-луночного культурального планшета с последующей инкубацией в течение 15 минут при аккуратном перемешивании на шейкере. В случае суспензионнных линий Raji и Daudi осадок клеток из каждой лунки собирали центрифугированием, отмывали PBS и проводили лизис в 40 мкл лизис-буфера. После этого полученную суспензию переносили в чистую пробирку и замораживали в жидком азоте для увеличения эффективности лизиса. Содержимое пробирки размораживали при комнатной температуре и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 1 минуты для осаждения клеточного дебриса.
Принцип методики определения люциферазной активности основан на экспрессии и измерении активности двух репортерных белков в единой клеточной системе. Активность опытного гена-репортера (Firefly luciferase reporter) зависит от экспериментальных условий, тогда как активность ко-трансфецируемого контрольного репортера (Renilla luciferase reporter) обеспечивает калибровку базового ответа клеточной системы, что позволяет исключить внешние эффекты и артефакты при выполнении эксперимента.
Сигнал биолюминисценции при превращении индивидуальных субстратов под действием двух репортерных белков измеряли на приборе Luminometer 20/20n (TurnerBioSystems). Определение связывания транскрипционного фактора семейства NFkB p65 с последовательностью промотора CXCR5 in vivo методом хроматиниммунопреципитации (ChIP) Предварительно наращивали клетки MCF-7 до конфлюэнтности 70%. Производили ковалентную сшивку хроматина с локализованными на нем транскрипционными факторами посредством добавления непосредственно в среду формальдегида до конечной концентрации 0,75% и инкубировали при комнатной температуре и аккуратном перемешивании в течение 10 минут. Добавляли в среду глицин до финальной концентрации 125 мМ и инкубировали при комнатной температуре и перемешивании в течение 5 минут. После этого клетки промывали дважды 10 мл охлажденного PBS. Добавляли к клеткам холодный PBS из расчета 8 мл на 20 млн. клеток, снимали их скребком и переносили в 50 мл пробирку. Центрифугировали в течение 5 минут при +4оС и 1000g (Eppendorf Centrifuge 5804 R). Супернатант аккуратно отбирали, к осадку добавляли ChIP лизирующий буфер (50 мМ HEPES-KOH pH 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА pH 8,0, 1% Triton X-100, 0.1% дезоксихолат натрия, 0.1% SDS, ингибиторы протеаз SIGMA FAST S8820) в расчете 1,5 мл на 20 млн. клеток и инкубировали суспензию в течение 10 минут на льду.
Полученные лизаты подвергали соникации (обработке ультразвуком) с целью сегментирования хроматина на фрагменты длиной 200-1000 п.н (средняя длина 700 п.н.). Соникацию проводили на льду на установке Diagenode Bioruptor sonicator в течение 10 минут с чередованием циклов вкл/выкл по 30 сек. После соникации осуществляли осаждение клеточного дебриса центрифугированием (10 мин, 4оС, 8000g), супернатант, содержащий сегментированный хроматин, переносили в чистую пробирку.
От полученных проб отбирали по 50 мкл для анализа концентрации и длины фрагментов ДНК. К 50 мкл раствора добавляли по 70 мкл буфера для элюции (1% SDS, 100 мМ NaHCO3) и по 2 мкл раствора РНКазы А (0,5 мг/мл), после чего инкубировали в течение 4-5 часов на шейкере при 65C для разрушения ДНК-белковых ковалентных связей. Добавляли 2 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировали на шейкере при 45C в течение 1 часа. ДНК очищали с использованием набора GeneJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) по протоколу производителя. Для определения концентрации, раствор ДНК разводили в 200 раз, после чего определяли концентрацию на приборе Nano Drop. Также контролировали длину полученных фрагментов ДНК при помощи электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.
Для иммунопреципитации брали 25 мкг ДНК (хроматина), разводили ее в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА pH 8,0, 1% NP-40, 0.5% дезоксихолат натрия, 0.1% SDS, ингибиторы протеаз SIGMA FAST S8820) в соотношении 1:10 по объему. Добавляли первичные антитела к p65 (D14E12, Cell Signaling Technology) в количестве 2 мкг на пробу и инкубировали пробы в течение 1 часа при 4оС при постоянном перемешивании на ротаторе.
Осуществляли подготовку частиц сефарозы с протеином-А (Sigma) к эксперименту. Осуществляли их 3-кратную промывку в RIPA буфере, для забивки добавляли одноцепочечную ДНК из спермы лосося в количестве 75 нг и БСА в количестве 0,1 мкг на 1 мкл частиц, добавляли буфер RIPA в количестве 1:1 к объему частиц и инкубировали на ротаторе в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого один раз промывали частицы буфером RIPA. Добавляли 60 мкл забитых частиц сефарозы с протеином-А к пробам ДНК с антителами и инкубировали в течение ночи на ротаторе при +4oC. Центрифугировали иммунопреципетированные образцы в течение 1 мин при 2000 g и удаляли супернатант. Осуществляли следующие отмывки: однократно в низкосолевом буфере (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 150 мМ NaCl), однократно в высокосолевом буфере (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl), однократно в LiCl промывочном буфере (0.25 М LiCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl pH 8.0). После каждой отмывки центрифугировали частицы в течение 1 мин при 2000 g, супернатант удаляли.
Элюцию ДНК осуществляли посредством добавления к частицам 120 мкл буфера элюции и инкубации с ним при интенсивном перемешивании в течение 15 мин при 30оС. Центрифугировали в течение 1 мин при 2000g и переносили супернатант в чистую пробирку. Добавляли 4,8 мкл 5 М NaCl на пробу и инкубировали при перемешивании в течение ночи при 65C. Добавляли 2 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировали на шейкере при 45C в течение 1 часа. ДНК очищали с использованием набора GeneJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) по протоколу производителя.
Предположительный сайт связывания транскрипционного фактора MEF2C ассоциирован с минорным “A” вариантом полиморфизма rs630923 в промоторе гена CXCR5
Делеции участков 3 и 5 приводят к полной невосприимчивости промотора CXCR5 к уровню белков p53, p63 и p73 в клетках РМЖ MCF-7 в нормальных условиях и при генотоксическом стрессе
Для каждой клеточной системы точки, соответствующие значениям активностей делеционных вариантов промоторов, последовательно соединены линиями с целью повышения наглядности представленных данных. Уровень активности промотора соответствует уровню активности люциферазы Firefly в клеточных лизатах, нормированному на активность люциферазы Renilla. Индукцию генотоксического стресса осуществляли посредством инкубации клеток с 8 мкг/мл MMS в течение 24 часов. Представлен результат 5 независимых экспериментов.
Из результатов, представленных на рисунке 41, видно, что, как и было показано ранее (п. 3.1.5 раздела “Результаты и обсуждение”), внесение в промотор делеций 1, 4, 6, 7 и 8 не влияет на степень роста активности промотора при инактивации p53. В то же время, инкубация клеток MCF-7 и MCF-7-p53off с MMS приводит к снижению в них активности оригинального промотора CXCR5, а также вариантов промотора с делециями 1, 4, 6, 7, 8. Полученные данные свидетельствуют о том, что участки промотора под номерами 1, 4, 6,7 и 8 не участвуют в регуляции экспрессии CXCR5 ни белком p53 (как и показано ранее), ни белками p63 и p73. Важно отметить, инкубация с MMS клеток MCF-7-p53p63p73off не приводила к изменениям в активности промотора, вне зависимости от его варианта, что в очередной раз подтверждает исключительную роль белков семейства p53 в подавлении активности промотора CXCR5 при генотоксическом стрессе.
Особое внимание стоит уделить делециям под номерами 3 и 5. Их внесение приводит как к снижению базовой активности промотора, так и к полному исчезновению различий в активности промотора в клетках MCF-7, MCF-7-p53off и MCF-7-p53p63p73off, причем вне зависимости от генотоксического стресса.
Полученные данные свидетельствуют о невосприимчивости вариантов промотора CXCR5 с делециями 3 и 5 к следующим событиям: 1) Активации p53 – исчезновение различий между активностями промоторов в клетках MCF-7 до и после инкубации с MMS; 2) Активации p63 и p73 - исчезновение различий между активностями промоторов в клетках MCF-7-p53off до и после инкубации с MMS; 3) Инактивации p53 - исчезновение различий между активностями промоторов в клетках MCF-7 и MCF-7-p53off; 4) Инактивации p63 и p73 - исчезновение различий между активностями промоторов в клетках MCF-7-p53off и MCF-7-p53p63p73off до и после инкубации с MMS. Таким образом, как и в случае p53 (см п.3.1.5 раздела “Результаты и обсуждение”), именно участки 3 и 5 отвечают за регуляцию промотора CXCR5 белками p63 и p73 при генотоксическом стрессе.
С целью идентификации возможного механизма регуляции промотора CXCR5 белками p63 и p73, мы с использованием базы данных Jaspar провели биоинформатический поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов, расположенных в областях 3 и 5 промотора. Непосредственных консенсусных сайтов связывания p63 и p73 в данных областях обнаружено не было, в связи с чем можно было сделать вывод, что действие данных белков на промотор гена CXCR5 должно быть опосредованно какими-либо другими транскрипционными факторами. В связи с этим фактом, наибольший интерес для нас представляли сайты связывания транскрипционных факторов семейства NFkB (особенно NFkB2 и NFkB3, расположенные в областях делеций 3 и 5 соответственно), ключевая роль которых в регуляции промотора белком p53 была показана ранее в рамках данной работы (см п. 3.1.6 раздела “Результаты и обсуждение”), а функциональность подтверждена in vivo (см п. 3.1.8 раздела “Результаты и обсуждение”). Как для p63 (Sen et al., 2011), так и для p73 (Ryou et al., 2006) показана способность к индукции процесса апоптоза и подавлению активности системы транскрипционных факторов семейства NFkB. В силу того, что регуляция промотора CXCR5 белком p53 происходит посредством подавления активности NFkB, мы предположили, что и в случае p63 и p73 может действовать аналогичный механизм.
С целью подтверждения высказанного в предыдущей главе предположения о зависимости активности транскрипционных факторов семейства NFkB в клетках MCF-7 от статуса белков p63 и p73, мы сравнили активность ранее созданной NFkB-зависимой люциферазной репортерной конструкции (описана в п. 3.1.7 раздела “Результаты и обсуждение”) в клетках MCF-7, MCF-7-p53off, MCF-7-p53p63off, MCF-7p53p73off, MCF-7p53p63p73off в нормальных условиях и при генотоксическом стрессе. Индукцию генотоксического стресса осуществляли посредством инкубации клеток с 8 мкг/мл MMS в течение 24 часов.
На рисунке 42 представлены нормированные результаты измерения сигнала биолюминесценции продукта люциферазной реакции Firefly (собраны данные, полученные в 5 независимых экспериментах).
Активность NFkB-зависимого промотора была выше во всех клетках MCF-7 с инактивированным p53, что коррелировало с ранее описанными результатами. Инкубация клеток MCF-7 и MCF-7-p53off с MMS приводила к снижению активности NFkB, что, вероятно, было вызвано повышением активности p53 или p63/p73 в зависимости от линии. В клетках MCF-7-p53p63off и MCF-7-p53p73off эффект снижения активности NFkB при генотоксическом стрессе был менее выражен. В случае клеток MCF-7-p53p63p73off инкубация с MMS не приводила к значимым изменениям в уровне активности NFkB-зависимого репортера, что говорит о невосприимчивости уровня активности NFkB к инкубации с MMS. Суммируя полученные данные можно сделать вывод, что снижение активности NFkB в клетках MCF-7 ассоциировано как с активацией p53, так и p63/p73, причем действие p63 и p73 синергично – активация одного из белков приводит к менее выраженному эффекту.
Использована NFkB-зависимая люциферазная репортерная плазмида. Уровень активности промотора соответствует уровню активности люциферазы Firefly в клеточных лизатах, нормированному на активность люциферазы Renilla. Индукцию генотоксического стресса осуществляли посредством инкубации клеток с 8 мкг/мл MMS в течение 24 часов. Представлен результат 5 независимых экспериментов. P 0,05. P 0,01. Таким образом, система транскрипционных факторов семейства NFkB продемонстрировала зависимость от статуса в клетках p63 и p73, что делает осмысленным дальнейшее изучение NFkB-опосредованного влияния этих белков на промотор CXCR5