Введение к работе
Актуальность темы
Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) - острое, высококонтагиозное заболевание, поражающее цыплят 2-15-недельного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Avibirnavirus. семейства Birnaviridae (Brown, 1986). Инфекционную бур-сальную болезнь (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) регистрируют в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления, причем ИББ часто принимает характер энзоотии.
Высокая контагиозность, устойчивость вируса к действию факторов внешней среды и дезинфектантов, а'также экономический ущерб, наносимый птицеводческим хозяйствам, делают ИББ серьезной проблемой для птицеводства многих стран мира, включая Россию.
Согласно данным эпизоотологического обследования в течение 1975-1996 годов ИББ подтвердили серологически во всех обследованных птпцехозяйстиах России, а вирус выделили в 145, что указывает па широкое распространение инфекции.
До середины 80-х годов максимальный уровень смертности во время вспышек ИББ достигал 30%. В 1986 г. в Европе появились и начали быстро распространяться высоко вирулентные штаммы вируса, которые вызывали вспышки ИББ, характеризующиеся высоким уровнем смертности - до 70 % и выше. Наряду с прямыми потерями (гибель молодняка, снижение продуктивности, вынужденная выбраковка) заболевание представляет серьезную опасность вследствие развивающейся у инфицированных цыплят нммуносупрессии. Цыплята, перенесшие субклиническую форму ИББ. не способны полноценно реагировать на применение вакцин против болезни Марека, Ньюкасла, инфекционного бронхита и др.
Проявление ИББ маскируется другими болезнями и физиологическими нарушениями. Только при типичном течении ИББ сравни-
тельно легко диагносцируется по клиническим и патологоанатомиче-ским признакам. Внезапное появление болезни, сопровождающееся диареей, высокая заболеваемость, быстрое распространение, зубчатая кривая смертности дают основание предположить наличие ИББ в хозяйстве. Подтверждением диагноза может быть обнаружение характерных изменений в фабрициевой сумке. На ранней стадии или при субклиническом течении болезни необходимы лабораторные исследования.
В настоящее время лабораторная диагностика ИББ включает: выделение вируса на куриных эмбрионах или в культуре ФЭК, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН и РДП, выявление антител в сыворотке крови в РН, РДП и ИФА, обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.
Появление антигенных вариантов вируса ИББ, а также высоко вирулентных штаммов, охарактеризованных с использованием панели моноклональных антител (МАТ) как классические, но тем не менее способных вызывать заболевание у вакцинированных птиц, определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых более эффективных средств диагностики її профилактики ИББ.
Совершенствование методов диагностики ИББ предполагает прежде всего повышение их чувствительности, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.
Одним из перспективных направлений, способных решать эти задачи, является использование метода ПЦР, который основан на эн-зиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфических праймеров. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять не только инфекционный вирус, но и фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагмента генома, характеризующегося максималь-
з ной вариабельностью, позволяют наиболее точно установить штаммо-вую принадлежность вируса.
Возможность применения метода ПЦР и сравнительного генетического анализа для идентификации вируса ИББ определяется степенью изученности вируса. Накопленные данные о первичной структуре генома ВИББ позволяют выявить высоковариабельный фрагмент ге-' нома, оптимизировать нуклеотидные последовательности фланкирующих этот фрагмент праймеров и разработать тест-систему для индикации и штаммовой дифференциации ВИББ. Цель и задачи исследования
Основная цель данного исследования заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ и изучении методами молекулярной биологии генетических взаимоотношений штаммов вируса ИББ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать метод индикации вируса ИББ в различных вируссодер-жащих образцах па основе ПЦР;
на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Vp2 разработать метод идентификации вируса ИББ, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;
провести анализ нуклеотндной последовательности вариабельной области гена Vp2 полевых и вакцинных штаммов вируса ИББ;
сравнить первичные структуры антигенно-значнмой области Vp2 полевых и вакцинных штаммов вируса ИББ.
Научная новизна исследования
Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена Vp2 46 изолятов вируса ИББ, выделенных на территории России в течение 1993-1997 гг., и 14 отечественных и зарубежных вакцинных штаммов. Выявлены генетические группы штаммов вируса ИББ. Определены особенности первичной структуры антнген-но-значимой области Vp2 российских изолятов и вакцинных штаммов
вируса ИББ и создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей. Практическая значимость исследования
Разработан метод выделения, очистки и концентрирования ВИББ и вирусной дцРНК, позволяющий получать из 100 г фабрішис-
вых сумок инфицированных птиц 5-7 мг вируса и соответственно около 0,5 мг вирусной дцРНК.
Разработан метод индикации ВИББ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих образцах в течение 4-6 ч.
Разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена Vp2, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию вновь выделенных изолятов ВИББ.
С использованием разработанного метода проведена идентификация 46 изолятов ВИББ, выделенных на территории России в 1993-1997 г., а также 14 отечественных и зарубежных вакцинных штаммов.
Разработанные методы выделения вирусной дцРНК, выявления и штаммовой дифференциации вируса ИББ одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, и в настоящее время используются для индикации и идентификации вируса ИББ. Публикация научных исследований
По теме научных исследований опубликовано 11 научных работ. Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены на научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г. Владимир (1995 г.), научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии" г. Москва (1996 г.), всемирном ветеринарном конгрессе в г. Иокогама (Япония. 1995 г.).
Структура и объем работы