Введение к работе
Актуальность темы. Инфекционный бронхит, вызываемый РНК-содержащим вирусом семейства Coronaviridae, является высококонтагиоэным заболеванием. Вирус ИБК поражает трахеи, легкие, почки и яичники кур, что часто ведет к смертности птицы, особенно молодняка, снижению яйценоскости кур-несушек и ухудшению качества яиц.
Впервые заболевание было описано в США в штате Северная Дакота в 1931 году Schalk и Hawn, как ранее неизвестное заболевание дыхательной системы цыплят, сопровождающееся высокой летальностью. В дальнейшем болезнь была установлена и у взрослых кур. Заболевание широко распространено практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством и наносит значительный экономический ущерб. Экономические потери при ИБК складываются, в основном, из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста и повышения чувствительности к другим заболеваниям. На территории бывшего Советского Союза ИБК впервые был обнаружен на бройлерных птицефабриках БССР в 1982 году у цыплят, завезенных из Венгрии (А.Б. Терюханов и др., 1990).
Для профилактики ИБК используют иммунизацию живыми и инактивиро-ванными вакцинами. Поэтому представляется важным разработка методов, позволяющих количественно определять концентрацию антигена вируса ИБК в исследуемом препарате. Для обнаружения антигена вируса ИБК рядом авторов (Hesselink et al., 1983, Nagano et a!.. 1990, Naqi el al., 1993, Ignjatovic & Ashlon, 1996) разработаны «сэндвичо-варианты ИФА, основанные на разных комбинациях улавливающих и детекторных антител. Однако в этих работах были использованы моноклонапьные антитела, получение которых представляет определенную проблему. Системы с применением поликлональных антител обладали низкой чувствительностью (Yagyu & Ohta, 19S7). До сих пор не разработана тест-система для быстрого обнаружения антигена вируса ИБК и его количественной оценки в вирус-содержащих материалах, которая могла бы применяться для исследований в диагностических ветлабораториях.
Большое значение имеет контроль иммунного статуса поголовья кур птицефабрик, в первую очередь, контроль поствакцинального иммунитета и его напряженности, контроль материнского иммунитета, а также раннее выявление заболевания на птицефабриках, не применяющих вакцины. Традиционные методы для определенил уровня антител в сыворотках крови кур: реакцип диффузионной
преципитации, реакция торможения гемагглютинации и реакция нейтрализации, неудобны для массовых исследований, либо из-за недостаточной чувствительности и специфичности, либо в силу трудоемкости и невозможности стандартизации условий постановки реакции. На основе непрямого варианта ИФА за рубежом рядом фирм, такими как KPL (США), IDEXX (США), Svanova (Швеция), Нурга (Испания) и др., выпускаются диагностические наборы. Во ВНИВИП (Санкт-Петербург) разработан иммуноферментный набор для визуального учета. Однако набор основан на методе последовательных разведений и позволяет тестировать на одном планшете 10-20 проб, что делает проводимые исследования низкопроизводи--тельными-и-^грудоемкиыиЛоэтому возникла необходимость разработки сравни-тельно недорогого отечественного диагностического набора нового поколения для определения уровня антител к вирусу ИБК на основе ИФА методом одного разведения сыворотки с последующей компьютерной обработкой результатов, что позволит одновременно тестировать на одном планшете 90 проб и значительно уменьшит стоимость одного анализа.
Многие исследователи при постановке различных вариантов ИФА с использованием очищенных и концентрированных препаратов антигена вируса ИБК сталкиваются с проблемой их получения и хранения. Поэтому представляется перспективным использование в ИФА синтетических пептидов, аналогов антигенных детерминант нативного белка вируса, которые лишены недостатков препаратов вирусных антигенов, так как характеризуются отсутствием примесей, стабильностью, неограниченным сроком хранения и известным химическим составом.
Таким образом, разработка и совершенствование методов ИФА для диагностики ИБК являются актуальными и перспективными.
Цели и задачи исследования. Целью наших исследований явилась разработка иммуноферментных тест-систем для определения уровня специфических антител в сыворотках крови кур и выявления антигена вируса ИБК в вируссодер-жащих материалах. В связи с чем выполнение диссертационной работы предполагало решение следующих задач:
1) разработать тест-систему для выявления и определения уровня антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур методом одного разведения с компьютерной обработкой результатов, для чего необходимо:
получить высокоочищенные и концентрированные препараты антигена вируса ИБК и вирусспецифические сыворотки крови кур;
стандартизовать условия проведения реакции;
- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;
сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с коммерческим иммуноферментным диагностическим набором фирмы KPL (США), сертифицированным на территории Российской Федерации;
показать возможность применения набора на основе данной тест-системы как одного из способов контроля иммунного статуса поголовья птиц на птицефабриках и для проверки антигенной активности вакцин;
2) изучить возможность использования в иммуноферментных тест-системах
синтетического пептида с аминокислотной последовательностью, соответствую
щей участку структурного белка S2 вируса ИБК:
в качестве антигена при проведении непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу ИБК;
в качестве лиганда для иммобилизации на BrCN-сефароэе при аффинном выделении фракции IgG из вирусспецифических сывороток крови кур и пептидоспеци-фических сыоороток крови морских свинок;
3) разработать тест-систему для обнаружения антигена вируса ИБК и его
количественной оценки в вирусных суспензиях, для чего необходимо:
- испытать различные варианты ИФА, позволяющие обнаруживать антиген вируса
ИБК, и выбрать наиболее оптимальный;
- получить высокоочищенные, концентрированные препараты антигена вируса
ИБК и вирусспецифических иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови
животных;
стандартизовать условия проведения реакции;
установить критерии качественной и количественной оценки результатов;
оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы;
показать возможность применения данной иммуноферментной системы для обнаружения вируса ИБК в биологических материалах.
Научная новизна. Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при тестировании их в одном разведении. В ходе исследований определены пороговые значения титра антител с учетом неспецифического связывания, что позволяло производить качественную оценку тестируемых проб, и выведены коэффициенты уравнения линейной регрессии для определения уровня антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур. Параметры тест-системы введены в компьютерную программу «Иммуноферментный анализ», которая позволяет производить автомати-
ческую обработку, учет и хранение данных.
При использовании разработанной тест-системы для определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур проведен серологический мониторинг поголовья кур на птицефабриках Российской Федерации и стран СНГ в течение 1998-2000 г.г.
Показана возможность альтернативного использования в качестве антигена
при проведении ИФА синтетического пептида, являющегося аналогом фрагмента
N-концевого участка аминокислотной последовательности пепломерного белка S2
"вирусэгИБК:
Предложен метод выявления антигена вируса ИБК в биологических материалах, основанный на проведении непрямого блокирующего жидкофазного варианта ИФА с использованием в качестве блокирующих антител аффинно-очищенных IgG сывороток крови животных.
Разработана тест-система для выявления антигена вируса ИБК и его количественной оценки в пробах аллантоисной жидкости куриных эмбрионов с использованием двух способов постановки реакции: метода последовательных разведений и метода одного разведения проб. Установлены пороговые значения процента блокирования, отражающего количественное содержание антигена вируса ИБК в исследуемых пробах, и определена чувствительность предложенного метода. Установлена возможность перевода значения ОП исследуемых проб в значение титра антигена по уравнению линейной регрессии.
Показана область применения разработанной тест-системы: оценка концентрации антигена вируса ИБК в вакцинном сырье и обнаружение антигена вируса ИБК в образцах патологического материала после их пассирования на куриных эмбрионах.
Установлена возможность использования в качестве блокирующих антител моноклональных антител, полученных на штамм М41 вируса ИБК.
Модифицирован метод аффинной хроматографии для выделения фракции IgG, выработанных на определенный участок аминокислотной последовательности вируса ИБК, из сывороток крови морской свинки и курицы с использованием синтетического пептида, иммобилизованного на BrCN-сефарозе.
Практическая значимость. Результаты научных исследований легли в основу следующих документов, утвержденных Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации и/или директором ВНИ-ИЗЖ:
-
комплекта НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом»;
-
комплекта НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом при тестировании проб в одном разведении»;
-
методических указаний по определению антител к вирусу ИБК иммуноферментным методом;
-
методического руководства по определению титра антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при исследовании их в одном разведении;
-
методических рекомендаций по выявлению антигена вируса ИБК в вируссодер-жащих материалах;
-
методических рекомендаций по аффинному выделению специфических IgG из сывороток крови животных.
Разработанные иммуноферментные тест-системы применяются в научно-исследовательской и ветеринарной практике при оценке качества сырья для изготовления диагностических наборов и вакцин, при ретроспективной диагностике ИБК и контроле поствакцинального иммунитета.
При использовании диагностических наборов для определения антител к вирусу ИБК на основе разработанной иммуноферментной тест-системы в течение 1998-2000 г.г. было исследовано около 33000 сывороток из 262 птицеводческих хозяйств России и ближнего зарубежья, а также реализовано более 2000 коммерческих наборов, выпускаемых во ВНИИЗЖ.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 2000 г., на научно-производственной международной конференции «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства» (Казахстан, г. Алматы, 2000 г.), научной конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (г. Покров, 2000 г.), конференции молодых ученых ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2000 г.), Всероссийской научной конференции ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (г. Москва, 2001 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.
Основные положения, аьшосимыс на защиту: тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для
6 определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении;
применение тест-системы как одного из методов контроля иммунного статуса поголовья птицефабрик и исследования антигенной активности вакцин;
использование синтетического антигена при проведении непрямого ИФА для определения антител к вирусу ИБК;
тест-система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественной оценки антигена вируса ИБК в биологических
-материалах,
- применение тест-системы для определения концентрации антигена в сырье для
производства вакцин и диагностических наборов, а также полевых изолятов виру
са ИБК в пробах патологического материала.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах, иллюстрирована 32 таблицами и 21 рисунком. Список использованной литературы включает 155 источников, из них 145 на иностранных языках.