Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирусы группы бешенства относят к семейству Rhabaoviridae . Интерес, который проявляют исследователи к этим вирусам на протяжении длительного времени, определяется, прежде всего, глобальным распространением лиссаэирусов среди животных, высокой угрозой инфицирования людей и неизменным летальным исходом развившегося заболевания. На всей обширной территории Российской Федерации (РФ) постоянно сохраняется тяжелая эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству. Количество пострадавших людей от укусов различными видами животных имеет тенденцию к росту (Черкасский, 1992). Несмотря на более чем ЮО-леткюз история изучения рабической инфекции, до сих пор недостаточно известно о фундаментальных свойствах уличного вируса беяенства и интимных механизмах его взаимодействия с макроорганизмом. Не имеет еще убедительного экспериментального объяснения широкая вариабельность биологических свойств уличного вируса и механизм сохранения вируса в природе.
Одним из наиболее укоренившихся представлений о беиенстве является тезис о неизбежности летального исхода инфекции ( stell 1971 ; Селкмов, 1978). Эта концепция продолжает оставаться общепринятой. Однако, ряд фактов и наблюдений свидетельствуют о возможности существования и других форм инфекции. Pasteur и соавт. eqe в 1982 г. наблюдали выздоровление собаки от экспериментального бешенства. Аналогичные случаи были описаны и другими авторами (Гайдамович, 1958 ; Горауно-ва, I962-; Bolin , 1959 ; Johnson J948 ; Martin .IC:?). Однако, до последнего времени факт выздоровления, который, казалось бы, противоречит самому понятию оетенства, только констатировался, но не подвергался исследованию. Аналогичная ситуация складывалась и с другими неклассическими формами рабической инфекции (хроническая, возвратная).
Изучение антигенной структуры штаммов вирусов группы беаенства и их антигенных взаимоотношений с помощью систем, основанных на поли-клональных антителах, предоставляло информацию лишь на уровне серо-типа и не позволяло проводить дифференциальную диагностику и точную идентификацию вирусов группы бешенства, а также экологических вариантов в пределах серотипа. В частности, о циркуляции в европейской части республик бывшего СССР штаммов лиссавируса европейских летучих
мышей, антигенно связанных с вирусами 4-го се'рогипа, циркулирующих только на вге Африки, стало известно только благодаря гкбрэдоыной технологии. Вышеизложенное обуславливает необходимость использования гибридомной технологии для современного обеспечения изучения экологии и эпидемиологии лиссавируснызс инфекций, а также разработке нового поколения препаратов для диагностики и идентификации лиссавирусов.
Как известно, до начала 60-х годов все типы антирабическкх вакцин, независимо от степени инактивации вируса, применялись путем еже-, дневного введения препарата в течение 14-25 дней, одно- или двукратно в день, под кожу кивота (Селимов, 1978: Комитет экспертов ВОЗ, 1974), В К и большинстве стран Латинской Америки, Азии и Африки ежедневные прививки сохранились до настоящего времени. Ежедневные схемы лечебно-профилактических прививок чрезвычайно громоздки (до 48 инъекций вакцины) , сопряжены с физическими и моральными стрессами как для пострадавших, так и для медицинских работников и основаны на эмпирическом опыте. Нет экспериментальных обоснований, указывающих, что ежедневное введение антигена является оптимальным для формирования иммунитета. Наоборот, данные литературы, касающиеся микробных инфекций, свидетельствуют, что эффективность иммунизации зависит от схем применения вакцины (Здродовский, 1963). На эмпирическом опыте основана и лечебная схема иммунизации другой лиссавирусной инфекций - острого энцефаломиелита человека (ОЭМч).
Подкожный метод аппликации антирабической вакцины, предложенный Пастером еще в конце XIX века, оказался гениальным, в плане безопасности использования вакцины, содержащей живой вирус. Однако в конце XX века, когда применяются полностыэ инактивированные вакцины, с точки зрения наиболее быстрого и полного представления антигена иммуно-компетентным клеткам, метод введения вакцины под кожу живота нельзя считать оптимальным. В связи с изложенным разработка принципов построения оптимальной схемы применения вакцины, а также метода ее введения на основе изучения закономерностей иммунного ответа при антирабической вакцинации представляется актуальным как с точки зрения теории, так и практики.
Стратегия профилактики бешенства обоснованно базируется на комбинированном применении антирабической вакцины и гамма-глобулква (Селимов, 1962,1978; Доклады КЭ ВОЗ, 1974г. и др.). Основная функция
антирабического иммуноглобулина (ЛИГ) гомологичного или гетерологич-нсго состоит s создаии пассивного иммунитета с целью предупреждения развития бешенства с коротким инкубационным периодом. Однако, АКТ, в особенности гетерологичный, чрезвычайно реактогенен (вызывает аллергические реакции, в том числе анафилактический шок и сывороточную
болезнь) И интерферирует С вакциной ( Atanaaiuet al. І9бІ . Corey
e#a> 1976). Последнее может быть причиной неудач антирабических прививок. Эти данные, а также случаи заболевания гидрофобией после своевременного и полного курса прививок (Селимов, 1967 ; 1969 ; Кравченко и др., 1975), указывает на необходимость не только совершенствования принятого метода лечения, но и поиска альтернативных специфических и неспецифических препаратов для профилактики этой опасной для человека инфекции.
Цель и задачи исследования. Целыз настоящей работы было исследование фундаментальных свойств штаммов вирусов группы бешенства, а также разработка оптимальных схем и методов специфической и неспецифической профилактики, а также диагностики и идентификации возбудителей дкссавирускых инфекций.
В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучение биологических свойств штаммов вирусов группы бешенства из различных регионов, экологических ниш я хозяев: адаптационная характеристика, патогенность для различных видов животных (в том числе диких), антигенные свойства, популяциогатя структура штаммов уличного вируса бешенства.
-
Разработка моделей неклассических форм бешенства: воспроизведение и исследование абортивной, хронической и возвратной форм раби-ческой инфекции.
-
Исследование закономерностей вакцинального иммунитета при бешенстве и ОЗМч. Разработка оптимальных схем иммунизации.
-
Изучение зависимости антирабического иммунитета от места введения вакцины.
-
Изучение противовирусной и иммуномодулирущей активности препаратов различной природы при лиссавирусных инфекциях, определение оптимальных методов их введения.
-
Получение моноклональкых антител к структурным белкам вирусов группы бешенства с целью получения нового поколения препаратов для
диагностики и идентификации лиссавирусных инфекций.
Научная новизна работы. Открыт феномен гетерогенности популяции штаммов уличного вируса бешенства. Установлено, что популяция штамма уличного вируса бешенства может состоять из 1-го, 2-х или 3-х биологических вариантов, отличащихсл друг от друга по таким признакам, как уровень накопления вируса в мозгу, продолжительность инкубационного периода и болезни, а также по клинической картина болезни. Этот новый факт, впервые с научной точки зрения объясняет широкую вариабельность биологических свойств штаммов уличного'вируса бешенства и различных форм рабической инфекции (паралитическую, буйную и др.), формирование экологических вариантов лиссавирусов, а тахже феномен "фиксации" штаммов уличного вируса бешенства в процессе длительных последовательных пассажей - как результат селекции одного биологического варианта (паралитического) из состава популяции штамма вируса.
Экспериментально обоснована возможность развития не только острой летальной, но и различных неклассических клинических форд рабической инфекции: абортивной, хронической и возвратной. Впервые дана вирусологическая, патоморфологическая и иммунологическая характеристиках некдасенч^ских форм рабической инфекции. Раскрыт главный фактор механизма становления хронического бешенства.
Впервые показано, что абортивная форма бешенства иоже.т быть воспроизведена при различных путях введения вируса как фиксированного, так и уличного, как на лабораторных животных, так и на естественных носителях вируса домашних (собаки) и диких (корсаки) животных. Получены прямые доказательства специфичности абортивного и возвратного бешенства - неоднократного выделения вируса в течение болезни.
В ходе настоящего исследования были получены данные, позволяющие построить общую концептуальную модель механизма сохранения вируса в природе.
- Впервые исследованы закономерности развития вакцинального и
инфекционного антирабического иммунитета. Обоснован критерий, позво
ляющий их дифференцировать. Определены принципы построения оптималь
ной схемы иммунизации. Выявлена роль первичной иммунизации (грундим-
ыунитета), правила интервалов и разрешающей инъекции вакцины (бустер
инъекции). Впервые установлены закономерности развития клеточного
(Т-оффекторов) иммунитета ^ vlvo .
На основании изучения противовирусного действия многочисленных препаратов различного происхождения обоснована возможность альтернативного неспецифического метода профилактики лиссавирусных инфекции. Установлено, что противовирусная лечебная активность препаратов при лиссавирусных инфекциях проявляется на двух уровнях: на уровне ворот инфекции и на уровне центральной нервной системы (ЦНС). Показано, что ряд препаратов (индукторы интерферона и соединения фу-рана с малеиновым ангидридом) наряду с противовирусной обладает выраженной иммуностимулирующей активностью.
Впервые получены и охарактеризованы моноклональные антитела (МКА) к структурным белкам вакцинного вируса бешенства (штамм "Вну-ково-32") и к лиссааирусу европейских летучих мышей (штамм "Ели"), в том числе клон МКА, специфичный только к лиссавирусу европейских летучих мышей и вирусу Duvenhage , Выявлена, из известная ранее, об-щегрупповая антигенная детерминанта, свойственная для вирусов 1-4 серотиг.ов и отсутствующая у лиссавирусов европейских летучих мышей. Получение панели моноклональных антител к структурным белкам различных лиссавнруссз позволило получить совершенно новув информации об антигенной структуре вирусов группы бешенства. Создана основа для дачь-нейшей разработки нового поколения лечебных и диагностических препаратов, а также тест-систем для идентификации вирусов группы бешенства.
Практическая ценность.
-
Предложен новый вакцинный штамм для производства вакцины против одного из представителей лиссавирусов - вируса острого энцефаломиелита человека (ОЭМч). Получено авторское свидетельство на вакцинный штамм. Вакцина против ОЭМч на основе нового штамма внедрена в практику здравоохранения.
-
Успешное воспроизведение абортивной рабической инфекции на различных видах животных, в том числе естественных носителях вируса (домашних и диких) может служить экспериментальной базой для начала изучения различных аспектов механизма выздоровления от смертельного рабического энцефалита.
-
Установленные принципы построения оптимальной схемы прививок (правила грундиммунитета, интервалов и разрешавшей инъекции вакцины) нашли полное подтверждение в современных схемах применения концентрированных антирабических вакцин, в рекомендациях ВОЗ 1984 и 1992 гг.
(7-fl и 8-й доклады Комитета экспертов ВОЗ по бешенству), в новой схеме по применению концентрированной антирабической вакцины в РФ (о 1993 г.).
4. Предложена научно-обоснованная схема профилактических приви
вок КАВ на 0, 3, 7 и 30 день вместо существовавшей до настоящего вре
мени схемы 0 и 10 день. Положение об интервале в 25-30 дней между
подготовительной иммунизацией и бустер инъекцией получило отражение
в Инструкции по применению КАВ, 1991 г.
-
Предложена обоснованная схема прививок для лиц, ранее получивших полный курс профилактических или лечебных прививок, позволяющая значительно сократить принятый в настоящее вреші курс в БО—80JC от исходного курса, до 2-5 инъекций для кеконцэнтрированной ы 1-3 инъекции для концентрированной культуральной антирабической вакцины.
-
Предложен внутримышечный метод аппликации антирабической вакцины - вместо подкожного (под кожу живота). Предлозенный шиш метод позднее был рекомендован Комитетом экспертов ВОЗ по бешенству (1934, 1992 гг.), ас 1992-1993 гг. начал применяться и в РЗ.
-
Установлено, что для экстренной профилактики бешенства решающее значение имеет инфильтрация противовирусных препаратов, том числе антирабического иммуноглобулина, в месте варажения (в ткани окружающие рану). Фармкомитет утвердил разработанную нами програмку I фазы клинических испытаний бактериальной FHK-азы в качестве противовирусного препарата.
-
Получено 2 авторских свидетельства на моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства;
а) моноклональные антитела к гликопротеину вакцинного вируса
штамм "Внуково-32" используются для разработки метода оценки качества
полуфабриката антирабической вакцины и количественного определения
антигена в готовой вакцине (ИПиВЭ РАМН) ;
б) на основе моноклинальных* антител к нукдеокапсидноыу комплексу
разработан люиинесцирующий препарат для экспресс-диагностики лвсса-
вирусных инфекций. НТД представлена в ГИСК им.Л.А.Тарасовича.
Положения, выносимые на защиту.
I. Популяция штамма уличного вируса бешенства гетерогенна в может
состоять кз I, 2 или 3-х биологических вариантов, отличающихся друг от друга как по уровни накопления вируса в мозгу, продолжительности инкубационного периода и болезни, а также по клинической картине.
-
В експериментах на лабораторных животных, а также естественных носителях (доиаяших и диких) вируса бешенства установлена возможность развития не только острой летальной, но и различных неклассических клинических форм рабической инфекции: абортивной, хронической и возвратной. Абортивная инфекция может быть воспроизведена на различных видах животных при любых способах заражения (в том числе внут-риыозговом) как уличным, так и фиксированным вирусами бешенства.
-
Эффективность антираб.чческой иммунизации определяется тремя главными принципами: силой грундиммунятета, правилом интервалов, раз-решащей инъекцией вакцины (бустер), а также мостом ее аппликации. Схема'лвченяя'лиц, ранее привитых против бешенства, определяется характерен вторичного иммунного ответа.
41 Доказана перспективность к возиожнветь альтернативного метода профилактики бешенства путем комбинированного применения индукторов интерферона или бактериальной РНК-азы и вакцины. Для экстренной профилактики бешенства решающее значение имеет инфильтрация противовирусных препаратов,в том'числе антирабического иммуноглобулина, в ткаки окружающие место заражения.
б. Моноклональкые антитела к зпитопам структурных белков вирусов группы бепенства позволяют изучать тонкую антигенну» структуру, проводить -индикации, идентификации и классификации лиссавирусов.
Апробация заботы. Материалы диссертации были доложены на итоговые езесиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (1969, 1972, 1975, І9&5 гг.) t конференциях. Омского НИШИ (1975, 1976, 1932 гг.) ; Алма-Ата (1979) ; Симпозиуме по антивирусным взществам в Минска (1933, 1984, 1986) ; конференции Института прикладной молекулярной биологии ШЗ СССР (1990г., Москва) ; Всесоюзной научно-технической конференции по созданию новых готовых лекарственных средств (1990, г.Харьков) ; Всесоюзном симпозиуме "Арбовкрусы и арбовирусные инфекции" (Москва-Лыткико, 1991) ; Втором конгрессе Европейского общества ветеринарной вирусологии (Кппсала, Швеция, IS9I) ; Ш конгрессе гигиенистов,
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Республики Молдова (Кишинев, 1992) ; Ученом Совете Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (1985, 1986, 1988, 1992 гг.); Сессии РАМН (1992г.).
Публикация работ. Основные положения диссертации отражены в 80 печатных работах (из них Ю- в зарубежных изданиях), в тон числе 3 авторских свидетельствах, 40 статьях, из них 8 - в зарубежных научных журналах. Б настоящую работу вошли результаты многолетних исследовании, которые выполнены при непосредственном участии автора с 1968 по 1992 гг. Работа выполнена в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН, а также ИПиВЭ. Отдельные фрагменты исследования выполнены в Омском НИИПИ, Ленинградской портовой и противочумной станцим, Институте прикладной молекулярной биологии МЗ СССР (г.Москваі НПАО "Оптичум-Био".
х х х .
В данной работе отдельные ее этапы были проведены совместно с профессором М.А.Селиыовым, аспирантом Дж мухадэе В.А., ст.н.с.Зубри Г.. ст.н.с. Королевым М.Б. (ИП и ВЭ РАМН), ст.н.с. Грибановой Л.Я. (Омский НШПОИ МЗ РФ), к.б.н. Фуралевым В.А. (Ин-т прикладной молекулярной биологии МЗ Р5), к.б.н. Василенко О.В. (НПАО "Оптимум/Био"), к.м.н.Клювником С.Е., д.м.ніК.А.ВанагІ. д.м.н. Н.Н.Носиком, чл.-корр. РАМН Ф.И.Ершовым и к.м.н..Г.М.Игнатьевым (Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН). Всем им автор приносит иокреннюв благодарность.
Особую благодарность и признательность автор выражает своим научным консультантам,- профессорам И.Ф.Баринскому и(Р.А.Канторович! за внимание и поддержку, за ценные дисскусии и консультации, а также своему первому учители профессору М.А.Селимову.