Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоянеє время острые кишечные инфекции (ОКИ) являются актуальной проблемой здравоохранения. Вспышки диареи насчитывают до 5 миллиардов случаев в год (Malson 0., Este3 М.К.,1990). при этом регистрируется от 3.7 до 4.6 млн смертельных случае» (Black R.Е. ,1933). В экономически развитых странах заболеваемость острыми гастроэнтеритами (ОГЗ) еанимает второе место после респираторных инфекций (Ransome-Kutl, 1991).
Среди всех ОКИ наиболее частим этнологическим агентом тяжело протекающих ОГЭ у детей являются ротавигусы. В развивающихся странах ротавирусы является причиной более 60 ОГЭ. а в развитых - до 50 X (Bishop R,F.,1993; Cook S.M., GlassR.1..1990). Общее число только лаОораторно подтверженных случаев с летальным исходом ротавирусного гастроэнтерита составляет до I 000 000 случаев в год (Bishop R.F.. 1993). В результате исследований, проведенных в нашей стране, установлено, что при спорадической заболеваемости ротавирусный гастроэнтерит составляет до 50 t у детей и 12 X у взрослых (Дроздов С.Г. 1989; Вукринская А.Г. 1989). Ротавирусная инфекция является Еысококонтагиозным заболеванием о различней. путями и множественными факторами распространения.
В этой связи становится очевидной все Солее возрастающая роль вирусологических исследований в расшифровке ротавирускых гастроэнтеритов и вопросы разработки и совершенствования методов лабороторной диагностики. ПЭДективные апробированные средства н методы диагностики необходимы для контроля над эпидемиологической ситуацией при вепшках и спорадических случаях этого заболевания.
В издай стране перзые разработки ротавирусных диагностических препаратов появились в 1968 году. Это были ишунофер-ментные тегт-си^темы и зритроцнтарные диагностик/ни, направленные на 1-ил?.лс-Н№ антигена ротавирусов группы А. в Фекалиях
Сольных и выявление специфических антител в сыворотке крови Сольных н реконвадасценгоэ.
Цель работы состояла в сравнительном изучении и оценке эффективности впервые разрабатываемых отечественных препаратов для диагностики ротавируснои инфекции и их стандартизации.
Задачами исследования являлось:
-
Лабораторное изучение и аттестация иммуноферментных и зритро-цитарных тест-систеи. а также твердофазной реакции коаглотинации (ТРКОА) для диагностики ротавируснои инфекции на соответствие их качества требованиям НТД.
-
Сравнительная оценка диагностической эффективности исследуемых тест-систем в строго контролируемых шифрованных опытах в натурных условиях в райках Государственных испытаний.
-
Разработка и аттестация отраслевых стандартных образцов (ОСО) подлинности и активности антигена ротавнрусов группы А и соответствующей ротавируснои сыворотки дм контроля и стандарти-вации ротавирускых диагностических препаратов.
-
Составление унифицированной математической модели для оценки диагностической эффективности препаратов и испольаованио ее при создании компьютерной программы для ускоренного обсчета большого массива данных, получаемых при натурных испытаниях.
Научная новизна работы. В регухьтат» сравнительного изучения разработанных в нашей стране препаратов для диагностики ротавируснои инфекции (иымуиофермектшлс, эритроцитарных и для ТРКОА). в условиях Государственных испытания впервые дана^,комплексная оценка их эффективности.
Впервые разработаны, аттестованы я допуаеяы к применению в практику ОСО активности ротавирусного антигена группы А и ротавируснои сыворотки к нему, необходимые для стандартигации и контроля как вновь разрабатываемых, так и выпускаемых на производственных предприятиях коммерческих препаратов для диагностики ротавируснои инфекции.
Предложен унифицированный подход к оценке эффективности диагностических тест-систем на основе математического алгоритма, легшего в основу составления коипьотерноя программы "ДИАТЕСГ* для обсчета показателей эффективности диагностических препаратоп.
Практическая значимость. Робота имеет практическую направленность и нацелена ва изучение эффективности новых препаратов и усовершенствование методов их контроля и стандар^чзации. Так, лабораторная апробация впервые разработанных отечественных иыму-ноферментных тест-систем, тест-системы для ТРКОА и эритроцитар-шх диагностикушв а сопоставлении о референс-методом (электронной микроскопией) показала высокую информативность, специфичность и простоту использования этих препаратов для диагностики ротавирусной инфекции.
Приказом U3 СССР вновь разработанные препараты: Тест-система иммуноферментная моноклоналыгая для выявления антегена ротавирусов группы А - "РОТА-АНАЛИЗ"; Тест-система иммунсфериент-ная для выявления антигенов ротавирусов группы А -"РОТА-АНТИГЕН"; Тест-система для выявления антигенов ротавирусов группы А в реакции коагглютинации - ТРКОА; Иммунодиагностикум ротавирусный зритроцитарный сухой для РИГА и РГНГА - "ИДОТОДИАГНССТИКУЫ"; Диагностикум зритроцитарный рставирусішй иммуноглобулиновый сухой для РИГА и РТЛГА - "РОТА-ТЕСТ"; - были внедрены в систему практического здравоохранения.
Нами были разработаны отраслевые стандартные образцы рота-вирусного антигена группа А (ОСО 42-28-195-92) и ротавирусной сыворотки (ОСО 42-28-196-Э2) для повышения качества ротавирусных диагностических тест-систем при их создании и производственном коыыорчесчом выпуске. Составлена и угверлдена нормативно-техническая доь"л:-пнташ« (Свидетельства и Инструкции но применению). . ОСО внесоч в реестр отраслевых стандартних образцов, допущенных к прі'ле:!; ",.ъ к-си^тем." Міііпгі'іга № і: на грздпг-і-.ятиях лгугих вэ-
- I -домств, выпускающих медицинские иммунобиологические препараты.
Проведена стандартизация методов оценки диагностической эффективности препаратов, при этом был предложен математический алгоритм, который лег в основу компьютерной программы "ДИАТЕСТ",разработанной в ПАСК. им. Л. Л. Тарасовича для обсчета показателей, характеризующие эффективность различных диагностических препаратов.
На защиту выносятся следуюдие основные положения: .
-
Результаты лабораторных и полевых (натурных) исследований, проведенных в рамках Государственных вспытаяий. псжаваш.что впервые раараоотанные для диагностики рставирусной инфекции отечественные тест-системы (кымуиофермеитиыи. эритроцитарнь» N ТРКОА) обладают различной диагностической эффективностью.
-
Диагностическая эффективность ккмуиоферыектных тест-систем "РОТА-АНАЛИЗ", "РОТА-АНТИГЕН", а так» ТРКСМ достоверно выве эффективности эритроцитарных препаратов.
-
Разработанные и аттестованные ОСО подлинности и активности антигена ротавирусов группы А к ротавирусной сыворотки способствуют стандартизации тост-систем м позволяют влиять на качество их при разработке и последующем коммерческой выпуске.
-
Предложенный наш математический алгоритм оценки показателей диагностической эффективности исследуемых тест-систем поа-водил унифицировать их обсчет к лег основу разработанной компьютерной программы "ДИАТЕСТ".
Апробация работы состоялась на васедании конференции вирусологического отдела ГИСК им Л.А.Тарасевича 07.07.93 г.. а также иа заседании Ученого Совета Государственного Научно исследовательского института им.Л.А. Тарасевича 13.07 Л993 года.
Материалы диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых в ГИСК им.Л.А. Тарасевича (Москва, 1991 г.); Всесоюзной конференции " Энтеровнрусы. Свпвтеоретические и медицинские аспекты." (Киев, 1991 г.); Конференции молодых уче-
- Б -
тле "Актуальные вопросы эпидемиологии м инфекционных болезней", посвященной 30-тя летню ЦНИИ эпидемиологии (Астрахань, 1992 г.);
Публикации реяультатов исследований. Материалы проведенных исследований отражены в 12 публикациях.
Объем и структура работа. Диссертация изложена на 160 страницах мзяииописного текста я состоит из введения, обзора литературы (3 главы), раздела собственных исследований (4 главы), обсуждения результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована в рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 54 отечественных я 187 варубежных источников. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы. За период с 1889 по 1992 гг. обследовано 10Г0 лиц больных ротавнруснымн гастроэнтеритами, гастроэнтеритами иеротавирусноя этиологии я моровых лиц. Материалом для исследовании служили 10 і "фекальные эютракты и сыворотки крови. Биоматериалы поступали ив инфекционных Детских больниц НН 6,?3 города Москвы и Московской области, СЭСЛ00, детского оздоровительного санатория и детского сада N 47 г.Москвы.
*
КСПЫТУЕмШ ГЕСТ-СИСТЕМЫ: »ло^С)фері^нтнне: ТОТА-АКАЛЮ", равраСотанная иа основе моклональных ротавирусных антител (ЦМДиЛ г.Москва); "РОТА-АНТИГЕН-, разработанная иа основе поликлокаль-ннх антител с двумя различньам субстрат-индикаторными р&створаыа (вначале 5 АСК. затем СФД) (НИИЭМ им. Пасгера); препарат для ТРКОА - ИПЮ АМН РФ г.Москва и эрктроцитарнью диагностикуыы:"РОТА-ТЕСТ- (сухая и жидкая формы). (НПО РООТЗГОІДКОтЛЕКС г. Ростов-на-Дону) и шцтщАтстоадг, (нииш г.Екатеринбург).
МЕТОДЫ - прлмоя электронной и иммунно-электронной микроскопии (ПЭМ и КМ) использовали в качестве референтных при оценке диагностической эффективности исследуемых ротавирусных тест-систем. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM-100В при усксрдкщем напрядений 60 кат. Электронномикроскопическис иссле-
- в -дования проводили на Баге ИЛВЭ РА1Ш совместно со о.н.с. В.И.Ха-устовым.
Метод электрофореза (Э1) ротавирусной РНК в ПААГе испольао-вали для дополнительной характеристики анткгенсодердадаго Оиош-териала, а также как дополнительный метод сравнения при определении диагностической эффективности исследуемых тест-систем. ЭФ проводили в 10 X ПААГе, в буферной система laeimll.Экстракция вирусной РНК - фенол-хлороформная. Гель окрашивали нитратом сервера,
Для разработки ОСО и юс аттестации использовали: ротавируо телят - итамм РМ, полученный ив ВНИИ экспериментальной ветеринарии ИСК РФ (для ОСО антигена) и сиворотку кроликов, иммунизированных ротавирусоы обевьян (штамм SA И) трехкратно о интервалом 2-3 недели (для ОСО сыворотки).
При статистической обработке результатов применяли методы определения относительных величин, среднего квадратичного отклонения (О, ошибки средней (»). критерия./, коэффициента вариации 7. Достоверность результатов определяли путем вычисления критерия Стыоденга. исподьаовали метод альтернативной корреляции с применением таблиц 4-х полей (В.С.Бессмертный. 1967; Н.Веяли, 1964, Д.В.ГолуОев. 1Є89).