Введение к работе
Актуальность темы. Высококонтагиозное заболевание ящур по-прежнему представляет угрозу для некоторых регионов мира, в том числе и нашей страны. Совершенствование мер борьбы с ящуром невозможно без всестороннего изучения его возбудителя. Особого внимания заслуживает выяснение взаимосвязи структуры и функции вирусного генома. Наиболее информативным подходом в подобных исследованиях служит сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей вариантов или мутантов одного и того же вируса, различающихся по биологическим свойствам. На протяжении ряда лет во ВНИИЗЖ проводились работы по изучению трех близкородственных вариантов природного изолята вируса ящура А22 Азербайджан/65, отличающихся патогенностью для крупного рогатого скота (КРС): эпителиотропного А:2550, миотропного А22550/4, аттенуированного А22645. Развитие методов секвенирования позволило вплотную подойти к выяснению молекулярных основ патогенности и аттенуиции. Мутации в любом гене могут привести к ослаблению вирулентности или аттенуации, если они ограничивают функции, важные для репродукции вируса. Объектом нашего исследования стал ген РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура. Интерес к данной области генома вызван исключительной значимостью РНК-полимеразы в размножении вируса.
РНК-зависимая РНК-полимераза является ключевым ферментом репродукции всех РНК-содержащих вирусов, за исключением ретровирусов. Ее структура тесным образом связана с выполняемыми функциями и стратегией транскрипции и репликации генома вируса, которому она принадлежит. Знание структуры и механизма функционирования РНК-полимераз' открывает перспективу возможности вмешательства в процесс репродукции рибовирусов с целью предотвращения развития вирусной инфекции путем непосредственного воздействия на этот фермент. Уникальной особенностью всех РНК-зависимых РНК-полимераз служит полимеразный домен, который обеспечивает полимеразную функцию фермента и, благодаря своей консервативности, является единственным общим для всех рибовирусов генетическим элементом, позволяющим восстановить степень филогенетического родства между вирусами.
В вирусе ящура 3D ген, кодирующий РНК-полимеразу, относится к наиболее консервативным участкам генома, что делает его удобным объектом для разработки современного высокочувствительного и специфичного способа выявления всех семи серотипов вируса ящура
без уточнения типовой принадлежности, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Цели и задачи исследований имели научный и практический характер. В научном плане основной целью нашей работы было определение нуклеотидной и аминокислотной последовательностей РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура А2іб45, а также выяснение генетических изменений в этой области генома, произошедших в процессе аттенуации. Практическая цель исследований заключалась в разработке способа выявления вируса ящура всех семи серотипов (без уточнения типовой принадлежности) с помощью ПЦР на основе РНК-полимеразы. В этой связи предстояло решить следующие задачи:
-подобрать оптимальные условия секвенирования твердофазным вариантом метода химической модификации;
-определить первичную структуру гена РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура Агг645;
-провести сравнительный структурно-функциональный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК-полимеразы разных афтовирусов;
-на основе консервативных участков гена РНК-полимеразы сконструировать праймеры для ПЦР, универсальные относительно всех семи серотипов вируса ящура;
-разработать методику выявления вируса ящура в инфицированном материале с помощью ПЦР.
Научная новизна. Впервые определена нуклеотидная последовательность РНК-полимеразы аттенуированного варианта вируса ящура и проведено ее сравнение с близкородственными вирулентными вариантами природного юолята Агз Азербайджан/65.
Обнаружено, что в результате селекции вируса по патогенности в гене РНК-полимеразы произошли мутации, часть из которых привела к замене аминокислот в белковой последовательности. В аттенуированном вирусе одна из замен приходится на консервативную аминокислоту, входящую в функционально важный сайт фермента, и поэтому теоретически может иметь решающее значение в изменении биологических свойст вируса.
Впервые отмечена вариабельность в З'-нетранслируемой области генома вируса ящура на участке, непосредственно прилегающем к поли(А)-структуре.
Сконструированы универсальные праймеры на основе гена РНК-полимеразы, позволяющие выявлять все 7 серотипов вируса ящура в ПЦР.
Практическая значимость работы. В процессе исследований подобраны оптимальные условия секвенирования твердофазным
вариантом метода химической модификации. Разработана и предложена "Методика выявления вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативної! области гена РНК-полимеразы," которая утверждена директором института 14 марта 1995 года.
Апробация результатов исследований. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии я эпизоотологии" (Покров, 1992 г.), Всероссийской конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995 г.), на XXV Всемирном ветеринарном конгрессе (Йокохама, Япония, 1995 г.), атакже на заседаниях Ученого Совета ВНИИЗЖ 1992-1995 гг.
Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и 1 находится в печати. Нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура зарегистрирована в Базе данных нуклеотидных последовательностей Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL Nucleotide Sequence Database) [9].
Структура и объем работы. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 9 таблицами. Диссертация. содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 194 ссылки на первоисточники, и приложение.