Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика семейства Coronaviridae 9
1.2. Основные свойства коронавирусов 10
1.2.1. Строение вириона 10
1.2.2. Физико-химические свойства 10
1.2.3. Структура генома 11
1.2.4. Гены и протеины 12
1.2.5. Репликация 17
1.2.6. Антигенные свойства 21
1.3. Характеристика семейства Reoviridae 22
1.4. Основные свойства ротавирусов 22
1.4.1. Строение вириона 22
1.4.2. Физико-химические свойства 23
1.4.3.Структура генома 24
1.4.4. Гены и протеины 24
1.4.5. Репликация 27
1.4.6. Антигенные свойства 29
1.5. Эпизоотологические данные 29
1.6. Патогенез и патологоанатомические изменения 34
1.7. Клинические признаки 37
1.8. Диагноз и дифференциальный диагноз 38
1.9. Заключение по обзору литературы 40
2. Собственные исследования 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Биологические материалы 41
2.1.2. Оборудование... 41
2.1.3. Растворы, ферменты и реактивы 42
2.2. МЕТОДЫ 42
2.2.1. Выделение вирусной РНК из патологического материала от свиней 42
2.2.2. Денатурация дцРНК 43
2.2.3. Обратная транскрипция 43
2.2.4. Мультиплексная полимеразная цепная реакция 43
3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Разработка метода мПЦР для выявления и дифференциации геномов коронавирусов и ротавируса свиней 45
3.1.1. Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС 45
3.1.2. Выбор первичной структуры праймеров 46
3.1.3. Оптимизация условий постановки мПЦР 51
3.2. Применение мПЦР для выявления геномов коронавирусов и ротавируса свиней 54
4. Обсуждение результатов исследований 64
5. Выводы 68
6. Практические предложения 70
7. Список литературы
- Основные свойства коронавирусов
- Характеристика семейства Reoviridae
- Растворы, ферменты и реактивы
- Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС
Введение к работе
Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания
новорожденных поросят наносят большой экономический ущерб странам с развитым свиноводством. Высокая патогенность возбудителей данных заболеваний, их устойчивость во внешней среде, способность к персистенции в организме хозяина приводит к быстрому распространению этих болезней.
Возбудителями желудочно-кишечных заболеваний являются инфекционные агенты различной природы: вирусной (коронавирусный, ротавирусный и энтеровирусный гастроэнтериты); бактериальной (дизентерия, сальмонеллез, колибактериоз и др.); грибковой (кандидамикоз) и паразитарной (балантидиоз, эймериоз и криптоспоридиоз) (, 2007).
К коронавирусам свиней относятся трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГЭС), эпидемическая диарея свиней (ЭДС), респираторный коронавирус свиней (РКВС) и гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней (ГВЭС). Из них только ТГЭС и ЭДС могут вызывать желудочно-кишечную патологию (64, 96).
Кроме коронавирусов к данной группе патогенов можно отнести ротавирус свиней (РВС). В настоящее время известно 7 групп ротавирусов: А, В, С, Е, D, F и G (56, 181, 211), из которых первые 4 выделяются от свиней с диарейным синдромом (82).
Для вирусных диарей характерно сходство клинических признаков, патоморфологических изменений и эпизоотологических особенностей. Поражается обычно тонкий отдел кишечника - эпителиальные клетки ворсинок и микроворсинок, что приводит к нарушению пристеночного пищеварения, транспорта ионов и всасывания. Развиваются диареи, обезвоживание, истощение, что и вызывает падеж, особенно среди новорожденных поросят (118, 150, 108). Учитывая сходство в течении
заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики.
Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия (ЭМ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации (РН), не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПНР), главным достоинством которой является специфичность, чувствительность. Кроме этого, мультиплексный вариант ПЦР является быстрым методом для выявления нескольких возбудителей в одной реакции. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов. Однако метод выявления и дифференциации вирусов этой группы не был разработан в Российской Федерации.
Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы.
Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка метода выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в вируссодержащих образцах с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести сравнительный анализ первичной структуры известных штаммов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС;
сконструировать синтетические олигонуклеотиды, позволяющие выявлять фрагменты генома указанных вирусов в мультиплексной полимеразной цепной реакции;
разработать метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции;
установить первичную структуру амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС; -
провести сравнительный анализ первичной структуры фрагментов генома полевых изолятов данных вирусов.
- изучить возможность применения разработанного метода для
выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в материалах от
естественно инфицированных или экспериментально зараженных этими
вирусами свиней, а также в культуральных вируссодержащих материалах.
Научная новизна и теоретическое значение. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней в образцах вируссодержащего материала с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Впервые определена нуклеотидная последовательность уникального фрагмента генома в полевых изолятах вируса ЭДС, выделенных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры фрагмента гена М данных изолятов вируса ЭДС. Доказано, что выявленные изоляты содержали нуклеотидные замены в трех позициях гена М. Эти замены отсутствуют у других штаммов вируса ЭДС, нуклеотидные последовательности которых депонированы в Genbank.
Нуклеотидные последовательности фрагмента гена М выявленных нами изолятов вируса ЭДС были депонированы в международной базе данных Genbank под номерами доступа: EU167541, EU179721, EU179722, EU179723, EU179724, EU179725, EU179726, EU179727, EU179728, EU179729, EU179730 иЕШ79731.
С использованием разработанного метода определена нуклеотидная последовательность фрагментов геномов полевых изолятов РВС и ТГЭС, выделенных на территории РФ.
Изучены вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами ТГЭС, РВС и ЭДС.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработана «Методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2007г.), которая позволяет выявлять и дифференцировать корона- и ротавирусы свиней в патологических и культуральных вируссодержащих материалах. Методика прошла комиссионные испытания, рассмотрена и одобрена ученым советом, утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ».
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС,
основанный на амплификации консервативных участков геномов указанных
вирусов в ПНР;
- результаты оптимизации условий проведения мультиплексной
полимеразной цепной реакции при выявлении и дифференциации
коронавирусов и ротавируса свиней;
первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов ТГЭС, ЭДС и РВС;
сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавирусов и ротавируса свиней;
- результаты применения разработанного метода выявления и
дифференциации указанных вирусов в материалах от естественно
инфицированных и экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а
также в культуральном вируссодержащем материале.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2007 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, одна из них опубликована в журнале "Ветеринарная патология", который предусмотрен перечнем ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования: материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 236 источников, в том числе 24 на русском языке и 212 зарубежных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.
Основные свойства коронавирусов
Спайковый гликопротеин S (Е2 или gpl80) - продукт гена S. Для вирусов ТГЭС и ЭДС ген S содержит одну большую ОРС. Тогда как некоторые вирусы антигенной группы 2 содержат две ОРС. Кодируемый белок состоит из 1447 а.о, 1383 а.о и содержит 32, 27-29 потенциальных сайтов N-гликозидной связи для вирусов ТГЭС и ЭДС, соответственно. Гликопротеин S - крупный поверхностный гликопротеин, образует булавовидные выступы примерно 20 нм в длину (136), в состав каждого из которых входят три молекулы этого белка (тримеры спайк-протеинов) (66). Этот гликопротеин ответствен за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника, слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки, гемагглютинирующую активность вируса и индукцию гуморального и клеточного иммунного ответа (182, 133,121).
Гликопротеин S вируса ТГЭС первоначально синтезируется как молекула, состоящая из 1447 а.о. После отщепления короткой гидрофобной аминокислотной последовательности цепь полипептида составляет 1431 а.о. с молекулярной массой 158 кД. Затем к большинству из 32 потенциальных сайтов N-гликозидной связи добавляются углеводные цепи, богатые маннозой, и образуется протеин с молекулярной массой 175 кД. После дополнительных изменений в аппарате Гольджи зрелый протеин составляет 220 кД (136).
У штаммов РКВС, выделенных в Европе (Англия, Бельгия, Франция, Голландия), отсутствует в основном одинаковый участок РНК длиной 672 п.н в гене S. Напротив, у американских штаммов РКВС делеции варьируют по размеру (621-681 п.н). Таким образом, у штамов РКВС в гликопротеине S отсутствуют 207-227 аминокислот в N-концевом участке белка S (127, 90), в связи с чем молекулярная масса гликопротеина S вируса РКВС уменьшается и составляет 170-190 кД (232,44 ).
Гликопротеин S вируса ЭДС синтезируется как молекула с молекулярной массой 151 кД. При проведении ПААГ-электрофореза с использованием меченного изотопом S35 вирусного материала взятого от инфицированных вирусом ЭДС клеток, на электрофореграмме были обнаружены два протеина с молекулярной массой 170 кД ± 5кД и 190 кД ± 10 кД (75). В результате этого анализа можно предположить, что процесс синтеза гликопротеина S вируса ЭДС может быть идентичен вирусу ТГЭС.
Исследование первичной аминокислотной последовательности гликопротеина S вируса ТГЭС привело к идентификации нескольких функциональных областей. Предпологают, что вблези С-конца распологается сегмент длинной около 20 а.о., который прикрепляет протеин в липидной мембране. Внутренный домен, рамером 35 а.о., разделяется на 2 части: участок с высоким содержанием остатков цистеина (50%), которые являются вероятными сайтами прикрепления жирных кислот, а также гидрофильный участок, вероятно, проникает внутрь вириона. Таким образом эктодомен (ectodomain) формирует важную часть протеина S. На расстоянии 1/4-1/5 от С-конца распологается амфипатик винтовая альфа-спираль (amphipatic alpha helix) длинной 8 нм, которая, как предполагают, отвечает за ассоциацию 2 или 3 субъединиц гликопротеина S через суперспиральные (coiled-coil interactions) взаимодействия (83). Амино конец молекулы S имеет полный гидрофобный профиль, который отражает существование сильно упакованного ядра (core) в глобулярной части спайки (136, 169).
С помощью моноклональных антител на молекуле гликопротеина S вируса ТГЭС обнаружено четыре основных антигенных сайта А, В, С и D или D, С, А-В (по данным мадридской или парижской номенклатуры, соответственно) и идентифицировано 11 эпитопов, 8 из которых вируснейтрализующие. По данным мадридской группы исследователей, антигенные сайты располагаются на N-концевом участке гликопротеина S в следующем порядке: С - между 49-й и 52-й, В - между 97-й и 144-й, D -между 322-й и 389-й и А - между 538-й и 591-й аминокислотами (129). Согласно данным парижской группы исследователей, антигенные сайты располагаются в другом порядке - D, С, А и В, но они перекрываются тремя антигенными сайтами - В, D и А, описанными мадридской группой исследователей (87). Все антигенные сайты являются нейтрализующими детерминантами гликопротеина S, хотя сайт А - основной индуктор вируснейтрализующих антител (78). У штаммов вируса РКВС в гликопротеине S отсутствуют два антигенных сайта или один антигенный сайт (по данным мадридской или парижской номенклатуры, соответственно).
Кроме этого, с использованием моноклональных антител, было показано, что вируснейтрализирующие эпитопы на гликопротеине S вируса ТГЭС находятся между 503-й и 715-й аминокислотами (30, 65, 66). Вероятно, что аналогичная аминокислотная область у вируса ЭДС содержит вируснейтрализирующие эпитопы. Гликопротеины S некоторых вирусов антигенной группы 2 (MHV, BCV, IBV и ГВЭС) расщепляются, чтобы привести к полипептидам S1 и S2 с молекулярной массой примерно 90 кд (46, 67, 200). Расщепление протеина S до S1 и S2 у вирусов ТГЭС и ЭДС не происходит.
Характеристика семейства Reoviridae
При исследовании методом электронной микроскопии ротавирусные частицы напоминают колесо с широкой ступицей, отходящими от него короткими спицами и четко очерченным гладким ободом (170). С использованием электронной микроскопии различают 3 типа частиц ротавирусов: трехслойные частицы (ранее называющиеся двухоболочечными); двухслойные частицы (ранее называющиеся однооболочечными) и однослойные частицы, которые наблюдаются менее часто, обычно теряют геномную РНК и агрегированы. Зрелый инфекционный вирион имеет внешний диаметр примерно 75 нм и обладает тремя концентрическими протеиновыми слоями без липидосодержащей оболочки (82).
Самый внешний слой ротавирусного капсида состоит из двух протеинов (VP4 и VP7) и необходим для сохранения инфекционности.
Двухслойная частица состоит из 780 копий протеина VP6, организованных в 260 тримерных морфологических единиц, располагающихся трехосно по икосаэдральной решетке. Этот слой образует внешнюю поверхность «двухслойной» частицы (диаметр примерно 70,5 нм) (82).
Однослойные частицы, представленные белком VP2, имеют диаметр 51 нм и толщину 3,5 нм. Слой VP2 окружает вирусный геном и два структурных протеина-VP1 (Pol) и VP3 (Сар), которые организованы в серии 12 энзиматических комплексов, прикрепленных к внутренней поверхности VP2 по пятиосной симметрии. Собранная геномная РНК вместе с энзиматическими комплексами имеет общий диаметр примерно 44 нм (82).
Согласно ранее опубликованным исследованиям, ротавирусные частицы обладают икосаэдральной симметрией, хотя ультраструктура вируса была спорна. Например, сообщали, что число триангуляции (Т), которое обозначает взаимоотношение между соседними пятикратными осями икосаэдральных поверхностей, колеблется от 3-х до 16-и (79, 25, 197). С использованием новой техники изучения структуры вирусов стало возможным разрешение этих ранних расхождений. Roseto с соавт. (197) изучали структуры однослойных частиц ротавирусов и сообщили, что два внешних слоя интактной частицы ротавируса имеют решетчатую структуру поверхности (Т13), икосаэдральную симметрию и уникальный характерный набор из 132 крупных каналов, проходящих через оба слоя и соединяющих внешнюю поверхность с самым внутренним протеиновым слоем VP2.
Физико-химические свойства. Трех-, двух- и однослойные частицы могут быть разделены центрифугированием в градиентах CsCl или сахарозы, где они обладают различной плавучей плотностью и коэффициентом седиментации. Полноценные трехслойные частицы ротавирусов имеют плавучую плотность 1,36 г/см в CsCl, тогда как двухслойные частицы с плотностью 1,38 г/см (198). Однослойные сердцевинные частицы имеют плотность 1,44 г/см (167).
Инфекционность ротавируса сохраняется при рН 3-9 (230). При стабилизации 1,5 мМ СаС12 инфекционность практически не снижается при хранении при 4С или минус 20С в течение нескольких месяцев (207). Инфекционность относительно стабильна при нагревании до 50С, но резко снижается при серии замораживаний-оттаиваний (35). У разных штаммов ротавирусов могут быть вариации по физико-химическим характеристикам и стабильности.
Структура генома. Геном ротавирусов окружен внутренним белковым чехлом. В каждой частице геном представлен одной копией дцРНК каждого из 11 сегментов. Геном ротавирусов составлен из четырех высокомолекулярных сегментов дцРНК (сегменты 1 - 4), пяти сегментов средных размеров (сегменты 5 - 9), включая отличительный триплет сегментов (сегменты 7 - 9), и двух меньших сегментов (сегменты 10 и 11). Эти сегменты варьируют по размеру от 3302 п.н. до 667 п.н. и имеют обшую длину примерно 18522 п.н. (172). Сегменты генома нумеруются с 1 по 11 в соответствии с их электрофоретической подвижностью в ПААГ. Однако электрофоретические профили сегментов (чаще 7-9) могут различаться (36, 77).
Гены и протеины. У ротавирусов обнаружено 8 структурных протеинов, которые кодируются шестью генами, составляющими вирусную частицу (VP5 и VP8 - продукты расщепления протеина VP4 под воздействием трипсина, VP1, VP2, VP3, VP6 и VP7), и 5 неструктурных протеинов (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 и NSP5 (NSP6)), обнаруживаемые только в инфицированных клетках, но не в зрелых частицах (82).
Протеины сердцевины. Сердцевина представлена белком VP2, который окружает вирусный геном и двумя структурными протеинами VP1 и VP3.
VP1 - продукт геномного сегмента 1 у всех ротавирусов с молекулярной массой 125 кД (144). Небольшое количество молекул VP1 (приблизительно 2% массы вириона) присутствует в вирионе; можно предположить, что этот белок не имеет важной структурной функции, но, скорее всего, является частью ферментативного комплекса. Согласно этой гипотезе, исследования соответствия базы данных белка показали подобие с семьей РНК- полимераз РНК-содержащих вирусов (81).
VP2 - продукт геномного сегмента 2, является самым многочисленным структурным протеином, найденным в основных частицах (128), и третий по количеству протеин в двухслойных частицах. Протеин VP2 высоко-иммуногенный, и антитела сыворотки к этому протеину - хороший индикатор предшествующей инфекции (55). VP2 является единственным структурным протеином, обладающим способностью связывать нуклеиновые кислоты (дцРНК, оцРНК, и дцДНК) (42).
VP3 - продукт геномного сегмента 3, является минорным структурным протеином, который совместно мигрирует с внешним капсидным протеином VP4 во многих гелеобразных системах (128). Данный протеин состоит из 835 а.о. с молекулярной массой 98,122 кД.
Растворы, ферменты и реактивы
Патогенез кишечных инфекций, независимо от вида этиологического агента, связан, в первую очередь, с поражением тонкого отдела кишечника, его ворсинчатого и железистого аппаратов, что приводит к повышению проницаемости, экссудации жидкости в просвет кишечника, гиперсекреции, нарушению всасывания (100, 4). Большинство вирусов не вызывают первичной инфекции желудочно-кишечного тракта, поскольку они быстро инактивируются под воздействием кислой среды, протеолитических ферментов и желчи. Ротавирусы и коронавирусы могут выжить в этих условиях и инфицировать клетки тонкого отдела кишечника.
Вирус ТГЭС размножается, в основном, в эпителиальных клетках ворсинок, которые являются пальцевидными выпячиваниями слизистой оболочки тонкого кишечника и необходимы для пищеварения и всасывания (183). Вирус ТГЭС, попадая в организм через ЖКТ или органы дыхания, проникает в эпителий тонкого кишечника. Размножаясь в цитоплазме клеток ворсинок слизистой оболочки, он вызывает дегенерацию и некроз их (227). Под влиянием продуктов распада этих клеток и токсинов происходит нарушение гемодинамики и усиливается проницаемость стенок микроциркулярного русла, что способствует проникновению части вируса в кровь (139). В первые сутки после заражения вирусом ТГЭС резко нарушаются процессы пищеварения, и всасывания, в результате чего развиваются диарея и тяжелая дегидратация (216). У зараженных поросят в первые сутки жизни наблюдается более интенсивная атрофия ворсинок, чем в 3-недельном возрасте, так как у последних замена разрушенных вирусом энтероцитов ворсинок происходит в 3 раза быстрее (137). Тяжесть заболевания связана с тем, что у новорожденных поросят вирус инфицирует все энтероциты ворсинок от их основания до вершины, и ворсинки поражаются на протяжении всего тонкого кишечника (227). Распространение вируса ТГЭС по эпителию кишечника происходит путем выделения вируса из инфицированных клеток в просвет кишечника, а затем заражаются близлежащие клетки через апикальный домен (7)
Кроме эпителиальных клеток ворсинок, вирус ТГЭС реплицируется в макрофагах дыхательных путей, не вызывая дыхательных анатомических изменений (126), хотя экспериментальные заражения поросят показали, что вирусные титры были столь же высокими как в дыхательном, так и в пищеварительном трактах (88). По патогенезу и патоморфологии ЭДС сходна с ТГЭС (118). При патологоанатомическом исследовании поросят, погибших от естественной или экспериментальной ЭДС, обнаруживают изменения, напоминающие таковые при ТГЭС, но менее выраженные. Тонкий и толстый кишечники бледны, часто заполнены жидким содержимым (64). При исследовании экспериментально зараженных поросят, убитых в разные сроки после начала заболевания, на 30-м часу обнаруживают переполнение водянистым содержимым тонкого и толстого отделов кишечника, на более поздних стадиях - различной степени дегидратацию. Тонкий кишечник пуст, толстый заполнен слизитым содержимым. Гистопатологические изменения характеризуются умеренной инфильтрацией менонуклеарами в собственной пластинке ворсинок (Lamina propria), вакуолизацией цитоплазмы эпителия, набуханием ворсинок и исчезновением их поперечной исчерченности, дистрофичностью и уменьшением числа микроворсинок (152).
Вирус ЭДС вызывает разрушение энтероцитов ворсинки и атрофии ворсинок (117, 118). Вирус ЭДС реплицируется не только в эпителиальных клетках тонкого отдела кишечника, но и в эпителиальных клетках толстого отдела кишечника (64). Вирус ЭДС не реплицируется в респираторном тракте, в отличие от вируса ТГЭС. Тонкий отдела кишечника почти пуст, толстый -заполнен слизистым содержимым (16).
Вирус РВС вызывает острое кишечное заболевание у экспериментально инфицированных поросят-гнотобионтов, которое проявляется профузным поносом, депрессией и иногда рвотой (150). У поросят с клиническими признаками ротавирусной инфекции была обнаружена атрофия ворсинок. Подобная последовательность событий была хорошо зарегистрирована и для ТГЭС (95). Вирус РВС в основном реплицируется в цитоплазме клеток реснитчатого эпителия тонкого отдела кишечника, вызывая лизис и десквамацию инфицированных клеток и атрофию ворсинок (5). In vivo преимущественным местом размножения ротавируса в организме экспериментально инфицированных поросят-гнотобионтов, по данным иммунофлуоресцентного анализа, являются клетки цилиндрического эпителия, покрывающего ворсинки тонкого отдела кишечника (149).
Патологические изменения при остром течении ротавирусной инфекции свиней, когда поросята погибают в первые 2-3 дня жизни, выражены незначительно и проявляются в виде диффузного покраснения слизистой оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. У поросят, павших в 5-7-дневном возрасте, изменения во внутренних органах более выражены: слизистая желудка покрасневшая, отечная, покрыта густой сероватой слизью, слизистая тонкого отдела кишечника в различной степени покрасневшая и отечная (193). Брыжеечные лимфоузлы увеличены, их паренхима отечная. Эти изменения приводят к расстройствам пищеварения в тонком отделе кишечника, вследствие чего начинается диарея (138). Последняя, в свою очередь, вызывает дегидратацию и нарушение баланса электролитов (5).
Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС
В результате дальнейшего анализа были выбраны шесть праймеров для каждого вируса, фланкирующие этот фрагмент генома. Четыре из них, как было установлено в ходе работы, отвечали необходимым требованиям. Были проверены различные комбинации праймеров для обратной транскрипции, амплификации и реамплификации. Для обратной транскрипции и амплификации наиболее удачной оказалась комбинация праймеров S1/S2, Р1/Р2 и М1/М2, а для реамплификации - S3/S4, РЗ/Р4 и МЗ/М4 для вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС, соответственно. На примере культуральных штаммов «Ленинградский» вируса ТГЭС и «КР-47» ротавируса свиней были оптимизированы условия постановки реакции. Размер фрагментов ДНК, полученных в мПЦР, определяли, сравнивая их электрофоретическую подвижность с маркером молекулярных весов. При этом фрагменты размером 950, 329-269, 425 и 317 п.н. в реакции амплификации и/или 792, 171-111, 291 и 208 п.н. в реакции реамплификации свидетельствовали о наличии в тестируемой пробе вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС или РВС, соответственно.
При сравнении разработанной нами «Методики выявления и дифференциации вирусов трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и эпидемической диареи свиней с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» с аналогичным ранее опубликованным методом Song с соавт. (141), было показано, что для выявления и дифференциации вирусов ЭДС и РВС они использовали праймеры, фланкирующие участок генов S и VP6, соответственно, нуклеотидные последовательности которых обладают меньшей степенью консервативности (96% и 80%) для указанных генов, соответственно), чем гены М и NSP5 (98,5%) и 93% ), которые нами были использованы в мПЦР для выявления указанных вирусов. Эти же авторы при исследовании патологических материалов от естественно инфицированных поросят вирусом ТГЭС выявляли геном данного вируса только в фекалиях, но не в кишечнике. В наших опытах мы использовали более чувствительный метод, который позволяет выявлить геном вируса ТГЭС в кишечнике экспериментально инфицированных поросят, хотя аналитическая чувствительность нашего метода (2,0 lg ТЦД5о/мл) немного меньше, чем метода Song с соавт. (1,0 lg ТЦД5о/мл) для данного вируса.
Кроме того, Song с соавт. не проводили дифференциации вируса РКВС от вируса ТГЭС. Тогда как наш метод мПЦР позволяет с высокой специфичностью выявлять и дифференцировать эти вирусы.
Чувствительность разработанного нами метода не изменилась как при использовании в реакции одной пары праймеров, так и при проведении ПНР в варианте мультиплекс. Song с соавт. показали, что разработанный ими метод мПЦР с тремя парами праймеров менее чувствительный, чем ПЦР с одной парой праймеров.
С помощью разработанного нами метода исследованы пробы патологического материала от свиней. Для анализа использовали фекалии, кишечник, легкие и селезенку. Всего с использованием разработанного метода мы исследовали 127 образцов патологического материала как от свиней с клинической картиной заболевания, так и от здоровых свиноматок, а также материал от экспериментально инфицированных поросят на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, РВС и ЭДС.
Геном РВС был выявлен в 48 случаях, что составляет 37,8% всех исследованных материалов. Вирус выявляли в фекалиях, кишечнике, селезенке и легких поросят. Геном РВС выявляли у свиней всех возрастных групп как при диареином синдроме, так и у клинически здоровых свиноматок. Это объясняет тот факт, что одним из основных источников инфекции для новорожденных поросят могут являться свиноматки, поскольку они могут длительное время быть носителями вируса. Полученные нами данные согласуются с раннее опубликованными результатами исследований (208,24).
Геном вируса эпидемической диареи свиней был выявлен в 23 пробах (около 18%), вирус выявляли в фекалиях, кишечнике, не удалось выделить вирус ЭДС в селезенке и легких, есть данные, что репликации этого вируса в легких не происходит (117). В материале, который поступал к нам на исследование, геном вируса ЭДС выявляли у животных в возрасте от одного до 60-ти дней, хотя, по данным литературы, к возбудителю чувствительны все возрастные группы свиней (155, 218). Вероятно, в ряде случаев у животных более старших возрастов инфекция протекает без проявления клинических признаков (112).
Смешанную инфекцию, когда в образцах одновременно выявляли геном вирусов ЭДС и РВС, регистрировали как в кишечнике, так и в фекалиях. Данные вирусы были выявлены в 7 случаях у животных в возрасте от одного до 60-ти дней.
В ходе исследования были установлены нуклеотидные последовательности фрагментов генов NSP5 и М в 15 и 12 выявленных нами изолятов вирусов РВС и ЭДС, соответственно. Мы сравнили полученные и ранее опубликованные данные о нуклеотидных последовательностях этих участков генома, при этом отмечена высокая стабильность первичной структуры геномов.
