Введение к работе
Аістуальность проблемы
Одной из ключевых задач современной эволюционной биологии является выяснение
генетических причин и механизмов формирования биоразнообразия. Приспособляемость к различным условиям среды путём занятия доступной экологической ниши приводит к дивергенции популяций и впоследствии к образованию новых видов. Очевидно, что независимая эволюция адаптивно дивергировавших близкородственных линий одного и того же вида является следствием естественного отбора. Поскольку отбор действует в конечном итоге на генотип, выявление генов, ассоциированных с параллельными эволюционными изменениями среди популяций, существенно для идентификации кандидатных генов, вовлечённых в адаптивную фенотипическую дивергенцию. Обнаружение этих генетических изменений и их функциональная значимость являются фундаментальной проблемой молекулярной эволюционной биологии.
Среди наиболее интересных модельных организмов эволюционной биологии выделяются Сиговые (Coregonidae). Для этого рода рыб описано множество всевозможных форм, морф, популяций, экотипов и межвидовых гибридов (Попов, 2003; Решетников, 1980). В качестве объектов исследования нами была выбрана пара озёрный сиг (С. lavaretus baicalensis Dyb.) и байкальский омуль (С. aulumnalis migratorius Georgi). Байкальский озерный сиг (С. lavaretus baicalensis Dyb.) - глубоководный бентофаг, обитающий в основном на глубинах 30 -100 м и нерестующий в самом озере. Байкальский омуль (С. autumnalis migratorius Georgi) -пелагический планктофаг, обитающий на глубинах до 350 - 400 м.
Долгое время по морфологическим признакам этих рыб относили к различным видам. Так, омуля считали подвидом ледовитоморского омуля С. autumnalis (Pallas) (Nikolsky et al, 1970; Решетников, 1980). Однако проведенные анализ вариабельности мтДНК и изоферментный анализ показали близость байкальского омуля к истинным сигам и, прежде всего, к виду С. lavaretus L. (Politov et al, 2000, 2002; Sukhanova et al, 2000, 2002). Последующий детальный филогеографический анализ структуры мтДНК Палеоарктических и Неоарктических
сиговых (Politov et a), 2004), а также генеалогические реконструкции байкальских сиговых (Суханова, 2004) позволили сделать окончательный вывод о принадлежности байкальского омуля к виду С. lavaretus L.. Таким образом, байкальский омуль и озёрный сиг являются ближайшими родственниками, их дивергенция от общего предка произошла всего 10-20 тыс. лет назад, по-видимому, в связи с освоением разных трофических ниш (Sukhanova et al, 2004; Скрябин, 1969,1977,1979; Решетников, 1980; Смирнов, 1974; Карасёв, 1987).
Очевидно, пара сиг - омуль хорошо подходит в качестве модели эволюционной биологии. Можно полагать, что довольно короткий срок дивергенции байкальского омуля и сига в масштабе эволюционного времени позволит выявить именно те генетические факторы, которые в данном случае играют определяющую роль при дивергенции популяций и, в конечном итоге, в видообразовании.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлось проведение поиска элементов генома (как кодирующих, так
и некодирующих), различных по структуре в геномах омуля и сига, и выяснение их
функциональной значимости; а также проведение сравнительного анализа транскриптомов
мозга байкальских сига и омуля и выявление генов, вовлеченных в адаптивную дивергенцию
исследуемых рыб.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
С помощью метода вычитающей гибридизации провести геномное сравнение байкальских сига и омуля. Получить и проанализировать ранжированные библиотеки дифференциальных геномных фрагментов.
Провести количественное сравнение геномных последовательностей, транскрибирующихся в мозге байкальских сига и омуля, для чего получить библиотеки коротких репрезентативных последовательностей кДНК мозга этих рыб с использованием метода SAGE. Провести сравнительный анализ этих библиотек.
Выявить мРНК, соответствующие количественно различающимся коротким репрезентативным последовательностям кДНК в библиотеках сига и омуля.
Подтвердить дифференциальную экспрессию найденных мРНК методом ПЦР в режиме реального времени (RealTime PCR).
Научная новизна и прастическая ценность работы
В ходе данной работы впервые было проведено геномное сравнение байкальских сига и омуля с использованием модифицированного нами метода вычитающей гибридизации. В результате, не было выявлено протяженных последовательностей, специфичных только для одного из геномов. Все найденные дифференциальные фрагменты различаются
однонуклеотиднымн заменами и короткими (до 35 нукл.) делециями/инсерциями и относятся к некодирующим геномным участкам: интронам, микро- и мини-сателлитам, транспозоноподобным структурам. Полученные нами данные подтверждают близкое родство байкальских омуля и сига и их эволюционно недавнюю дивергенцию от общего предка.
Практическую ценность представляют полученные нуклеотидные последовательности фрагментов геномных ДНК и кДНК мозга байкальских сига и омуля, депонированные в международную базу данных GenBank. Эти последовательности могут быть использованы как при изучении непосредственно геномов этих рыб, в популяционной генетике, так и в межвидовых эволюционных исследованиях при сравнении различных видов.
Впервые нами были получены библиотеки коротких репрезентативных кДНК последовательностей (тагов) мозга байкальских сига и омуля с использованием метода Serial Analysis of Gene Expression (серийный анализ генной экспрессии). Сравнительный анализ библиотек показал количественные различия 3.9% тагов у исследуемых рыб. На основании сходства этих тагов с кДНК известных организмов, были выявлены кандидатные гены, участвующие в адаптивной дивергенции байкальских сига и омуля. Большинство из них относится к генам клеточного метаболизма, нервной и иммунной систем, белкового синтеза и регуляторным генам.
Многие дифференциальные фрагменты сига, обнаруженные нами с помощью метода вычитающей гибридизации, сходны с широко распространенными среди рыб Тс1-подобными транспозонами. Дифференциальную экспрессию транспозонов этого семейства мы обнаружили в тканях мозга исследуемых рыб. Не исключено, что высокая фенотипическая пластичность сиговых (и вообще рыб) отчасти обеспечивается активностью многочисленных транспозонных копий в их геноме, особенно при активации их в стрессовых условиях окружающей среды, например, при резком похолодании климата. Полученные нами данные еще раз подтверждают имеющееся в научной литературе мнение о важной роли мобильных элементов в эволюции геномов живых организмов.
Таким образом, результаты проведённого сравнительного анализа транскриптомов близкородственных рыб расширяют современное представление о влиянии окружающей среды на формирование фенотипов организмов. Очевидно, существует непосредственная связь между поведенческими различиями сиговых и транскриптомными вариациями в их мозге.
Структура диссертации
Диссертация изложена на //элистах машинописного текста, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части,
изложения результатов работы и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего ^^сылки, и ^ приложений.
