Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. Нейробластомы 10
1.1. Нервный гребень 11
1.2. Диагностика и терапия нейробластом 13
1.2.1. Гистология нейробластом 13
1.2.2. Классификация нейробластом 14
1.2.3. Терапия и прогноз 17
1.3. Генетические факторы, определяющие развитие нейробластом 18
1.3.1. Хромосомные аберрации и плоидность 18
1.3.2. N-Myc и NCYM 19
1.3.3. Генетическая предрасположенность 20
1.3.4. Мутации в других генах 21
2. Сигнальные каскады нейротрофинов в норме и в нейробластомах 23
2.1. Нейротрофины 23
2.2. Рецепторы нейротрофинов 24
2.3. Взаимодействие рецепторов нейротрофинов с p75NTR 25
2.4. Лиганд-независимая активация рецепторов нейротрофинов 27
2.5. TrkA в нейробластомах 30
2.5.1. Влияние TrkA на сигнальные каскады Ras-Erk и PI3K-Akt 30
2.5.2. Изоформа TrkAIII 31
2.6. TrkB в нейробластомах 31
2.6.1. Сигнальные каскады активируемые TrkB 32
2.6.2. Изоформы TrkB 32
2.7. TrkC и p75NTR в нейробластомах 33
3. Влияние ростовых факторов на прогрессию нейробластом 35
3.1. Инсулиноподобные факторы роста 35
3.2. EGF и VEGF 36
3.3. PDGF 37
4. Рецепторная тирозинкиназа KIT 38
4.1. Фактор роста стволовых клеток SCF 40
4.2. Структура гена и белка KIT 40
4.2.1. Изоформы KIT 41
4.2.2. Растворимая форма KIT 42
4.3. Активация и регуляция активности KIT 43
4.4. Сигнальные каскады активируемые KIT 46
4.4.1. PI3K/Akt 46
4.4.2. Семейство Src киназ 48
4.4.3. RAS/MAPK 49
4.4.4. Другие сигнальные каскады активируемые KIT 53
4.5. Взаимодействие с рецепторами 54
4.6. KIT в злокачественных заболеваниях 58
4.7. Особенности активации мутантных форм KIT 60
4.8. KIT в нейробластомах 62
Материалы и методы 65
Результаты и обсуждение 74
1. Подбор клеточных линий для исследования роли KIT 74
2. Конструирование лентивирусных векторов, направляющих экспрессию shРНК 75
3. Подавление экспрессии KIT в клетках нейробластом SK-N-AS и SH-SY5Y 76
4. Подавление экспрессии KIT ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз в клетках нейробластомы SH-SY5Y 78
5. Подавление экспрессии KIT приводит к аресту клеточного цикла в клетках SH-SY5Y 80
6. Подавление экспрессии KIT приводит к активации промитотических сигнальных путей 83
7. Нейротрофины NGF и BDNF могут компенсировать потерянную активность KIT 89
8. Измерение активности Erk на уровне индивидуальных клеток 91
9. Клетки SH-SY5Y-shKIT становятся более чувствительными к действию ростовых факторов 10. Erk является важным компонентом компенсаторных механизмов в клетках нейробластомы 95
11. Иматиниб и FR180204 обладают синергическим действием на рост клеток нейробластом 98
12. FR180204 блокирует способность клеток нейробластом адаптироваться к действию иматиниба 101
Заключение 104
Список сокращений и условных обозначений 106
Список литературы: 108
- Классификация нейробластом
- Взаимодействие с рецепторами
- Подавление экспрессии KIT приводит к активации промитотических сигнальных путей
- FR180204 блокирует способность клеток нейробластом адаптироваться к действию иматиниба
Классификация нейробластом
Критерии диагностики и определения стадии нейробластом основаны на международной системе INSS (International Neuroblastoma Staging System), впервые сформулированной в 1986 году и позже дополненной в 1988 году. Диагноз нейробластома ставится в случае выявления неробластных клеток в образце опухоли или костного мозга, при наличии повышенного содержания катехоламинов или их метаболитов (дофамин, ванилилминдальная кислота и гомованилиновая кислота) в моче пациента. Критерии INSS основаны на возможности полной резекции опухоли (удаление всей опухоли без удаления жизненоважных органов или повреждения важных сосудов), распространения опухоли на лимфатические узлы и наличии метастазов в костях, костном мозге, печени, кожных тканях или других органах (Таблица 1, стр.16). У новорожденных (до 18-ти месяцев) выделяют особую стадию заболевания- стадию 4S. Она отличается от стадии 4 тем, что метастазы ограниченны только печенью или кожными тканями, а также отсутствием значительных метастазов в костном мозгу. У больных со стадией 4S обычно благоприятный прогноз лечения заболевания, более того опухоли 4S могут спонтанно регрессировать
Определение стадии нейробластомы и её гистологического подтипа всё же не является достаточным для прогнозирования течения заболевания и определения успешности терапии. Существует международная утверждённая система критериев, согласно которой пациенты с нейробластомой могут быть разделены на три группы по прогнозу их лечения:
низкого риска ( 50% пациентов, выживаемость 85-95%)
среднего риска ( 10% пациентов, выживаемость 50-75%)
высокого риска ( 40% пациентов, выживаемость 30-40%)
В критерии разделения на эти группы входят следующие факторы:
возраст пациента на момент обнаружения опухоли
стадия нейробластомы
тип опухоли по гистологии согласно INPC
генетические факторы нейробластных клеток
Возраст пациента является важным критерием при определении прогноза лечения нейробластомы и при подборе схемы лечения31. По результатам последних исследований считается, что пациенты моложе 18-ти месяцев имеют в целом более благоприятный прогноз, и в некоторых случаях лечение на 3-ей и 4-ой стадиях может ограничиваться хирургическим удалением опухоли с последующим наблюдением32, 33.
Поскольку нейробластомы обладают крайне высокой гетерогенностью по агрессивности и росту опухоли, то терапия и успешность лечения сильно зависят от правильной диагностики и определения группы риска. После определения клинических параметров, гистологии опухоли и генетических нарушений принимается решение о необходимости хирургического удаления опухоли, назначения химиотерапии или радиотерапии. Так как нейробластома является эмбриональной опухолью и наиболее часто выявляется у детей до пяти лет, то интенсивная терапия часто приводит к осложнениям и нарушениям в развитии ребёнка. Поэтому важно определить к какой группе риска относится пациент и возможно ли свести к минимуму воздействие химиотерапии и радиотерапии.
Нейробластомы группы низкого риска
Выживаемость пациентов с первой стадией по критериям INSS, вне зависимости от биологических факторов, имеет высокие показатели при хирургическом удалении опухоли. Химиотерапия назначается только при рецидиве опухоли после её удаления34, 35. Химиотерапия также может не применяться для большинства пациентов со стадиями 2A и 2B, в случае благоприятного прогноза по остальным критериям. Пятилетняя выживаемость для таких пациентов составляет более 95%. Нейробластомы стадии 4S без амплификации гена MYCN в большинстве случаев претерпевают спонтанную регрессию36. В целом терапия для пациентов группы низкого риска заключается в хирургическом удалении опухоли и последующем наблюдении без назначения химиотерапии.
Нейробластомы группы среднего риска
В эту группу входят различные стадии и типы нейробластом. Например, к группе среднего риска относятся больные со стадиями 2A и 2B, но либо с недифференцированными или плохо дифференцированными опухолями и старше 18-ти месяцев, больные младше 18-ти месяцев, но с наличием хромосомных аберраций, а также больные с 3-ей и 4-ой стадиями, но с благоприятным прогнозом по остальным критериям. В целом пятилетняя выживаемость в этой группе составляет 50-75%. Терапия включает в себя хирургическое удаление опухоли и умеренную химиотерапию с использованием цисплатина, доксорубицина, этопозида и циклофосфамида37, 38.
Взаимодействие с рецепторами
Кроме активации своих сигнальных каскадов, рецептор KIT может взаимодействовать с другими рецепторами цитокинов и ростовых факторов. Известно, что активация KIT синергически усиливает действие интерлейкинов IL-3, IL-7, IL-33, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF и эритропоэтина (EPO) на пролиферацию гемопоэтических клеток. При этом KIT может напрямую взаимодействовать с рецепторами цитокинов IL-3, IL-7, IL-33, GM-CSF и EPO.
KIT может формировать комплекс с рецепторами интерлейкинов IL7R (рецептор IL-7), IL3R и IL3R (субъединицы рецептора IL-3), IL1RAP (IL-1 receptor accessory protein) и IL33R (рецептор IL-33) Активация KIT с помощью SCF приводит к фосфорилированию IL7R в отсутствие IL-7388. В результате фосфорилирования IL7R активируется сигнальный каскад JAK3/STAT5, таким образом, SCF может активировать JAK3/STAT5 опосредованно через KIT-индуцируемое фосфорилирование IL7R. KIT образует комплекс и с двумя субъединицами IL3R: -субъединицей, которая является общей субъединицей рецепторов IL-3, IL-5 и GM-CSF, и -субъединицей, которая входит в состав только IL3R 389. Добавление IL-3 приводит к более интенсивному фосфорилированию KIT при связывании с SCF, а также вызывает слабое фосфорилирование KIT и в отсутствие SCF. Интересно, что при этом гиперэкспрессия IL3R блокирует фосфорилирование KIT при добавлении только SCF, и для фосфорилирования в этом случае необходимо совместное добавление SCF и IL3 389. IL-33 приводит к SCF-независимому фосфорилированию KIT, при этом фосфорилирование KIT существенно усиливает IL-33-индуцируемую активацию STAT3, Erk1/2, протеинкиназы PKB и JNK1 390. Активация KIT также необходима для IL-33-зависимой секреции цитокинов тучными клетками. Взаимодействие KIT и IL33R (рецептор IL33) происходит в результате формирования комплекса, в который входят KIT, IL33R и акцессорный белок IL1RAP (IL1 receptor accessory protein). При этом KIT и IL1RAP взаимодействуют постоянно, а IL33R входит в этот комплекс только при связывании с IL-33 390. Интерлейкины IL-2/IL-15 и SCF синергически стимулируют пролиферацию NK-клеток 391. Хотя неизвестно, взаимодействуют ли напрямую их рецепторы и KIT, IL-2 и IL-15 индуцируют экспрессию KIT, а совместно добавление IL-2/IL-15 и SCF синергически активирует MAPK сигнальные каскады. Формирование комплекса KIT с IL3R обуславливает его взаимодействие и с GM-CSFR (рецептор GM-CSF). В отличие от IL3, GM-CSF сам по себе не индуцирует фосфорилирование KIT, но в комбинации с SCF может усиливать фосфорилирование KIT 392. GM-CSF и SCF синергически стимулируют пролиферацию мегакариотических клеток, а также вызывают более интенсивную и продолжительную активацию Erk1/2 при участии PI3K 393. Интересно, что ингибирование киназной активности KIT не препятствует синергическому эффекту на пролиферацию клеток, тогда как блокирование связывания с SCF полностью ингибирует синергический эффект. Таким образом, синергическое действие GM-CSF и SCF может быть связано с взаимодействием рецепторов при конформационных изменениях, вызванных связыванием KIT с SCF. Кроме того GM-CSF, как и IL-2 и IL-15, индуцирует экспрессию KIT 392. Другим примером синергического взаимодействия является сочетание SCF и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора G-CSF. Показано, что SCF и G-CSF синергически действуют на пролиферацию мегакариотических клеток, индуцируют экспрессию стволовых факторов и маркёров в клетках рака простаты, а также увеличивают количество эндотелиальных клеток при ишемии головного мозга 394-396. Механизмы синергическое действия SCF и G-CSF малоизучены, однако показано, что оба фактора участвуют в активации STAT3. G-CSF приводит к фосфорилированию STAT3, которое необходимо для это димеризации и транспорту в ядро, тогда как активация KIT приводит к фосфорилированию STAT3 по остатку серина Ser-727, что увеличивает его транскрипционную активность. Сигнальные пути по которым G-CSF и SCF воздействуют на STAT3 являются независимыми, но вместе приводят к более сильной активности STAT3394.
Наиболее изучено совместное действие и взаимодействие рецепторов эритропоэтина и SCF в эритропоэзе. Эритропоэтин и SCF необходимы для нормального эритропоэза и на различных стадиях эритропоэза и действуют либо поодиночке, либо совместно, причём на поздних стадиях дифференцировки эритроидные клетки утрачивают экспрессию KIT 397, 398. SCF в присутствие EPO стимулирует пролиферацию эритроидных предшественников, но снижает их дифференцировочный потенциал, и для окончательной дифференцировки необходимо наличие только EPO 399. В некоторых случаях SCF может заменять EPO и поддерживать пролиферацию и выживание клеток зависимых от EPO, но для этого требуется наличие и KIT и EPOR (рецептор EPO) 400. Однако по другим данным SCF обладает ограниченным потенциалом к поддержанию роста эритроидных клеток, хотя совместное действие SCF и EPO обладает синергическим эффектом на рост эритроидных клетки401, 402. EPOR и KIT взаимодействуют напрямую и связывание KIT с SCF приводит к активации EPOR через фосфорилирование цитоплазмотических доменов EPOR, но не через его димеризацию400, 403. При этом EPO не влияет на степень фосфорилирования KIT, а SCF вызывает фосфорилирование EPOR только в отсутствие EPO, тогда как при наличии EPO SCF не усиливает фосфорилирование EPOR401. Следует отметить, что синергизм EPO и SCF проявляют не только в эритроидных клетках, но также вместе могут стимулировать миграцию клеток рака шейки матки in vitro404.
Синергическое действие EPO и SCF связано в основном либо с усиленной активацией Erk1/2, либо с активацией JAK2/STAT5 сигнальных каскадов. Совместное действие EPO и SCF приводит к синергической активации Erk1/2, при этом они предположительно задействуют различные сигнальные каскады ведущие к активации Erk1/2 401, 404. Синергическое действие SCF и EPO также связано с одновременным активированием нескольких сигнальных каскадов, необходимых для эритроидной дифференцировки. EPO предпочтительно активирует JAK2/STAT5, SCF активирует PI3K/Akt, и оба запускают Erk1/2, причём ингибирование любого из этих сигнальных путей ингибирует пролиферацию проэритробластов405. Кроме того JAK2 может поддерживать способность к самообновлению мультипотентных гемопоэтических клеток только при активации KIT или FLT3 406. В клетках острого миелоидного лейкоза AML активность JAK2/STAT5 также может быть вызвана стимулированием KIT или FLT3385. В ряде работ показано, что KIT может активировать STAT5, возможно через трансфосфорилирование EPOR или в кооперация с другими рецепторами цитокинов, и таким образом SCF поддерживает выживание и пролиферацию ранних предшественников эритроцитов 407, 408. Синергическое действие EPOR и KIT на пролиферацию эритроидных сильно зависит от активности остатка тирозина Tyr-343, который находится в цитоплазматическом домене EPOR и активирует преимущественно STAT5. Однако совместная активация мутантной формы EPO, у которой активен только сайт Tyr-343, и KIT не приводит к усилению транскрипционной активности STAT5409. Тем не менее, предварительная инкубация эритроидных клеток с SCF существенно усиливает активацию STAT5 под действием EPO. Причём совместное действие SCF и EPO на активность STAT5 является CREB-зависимой. Добавление EPO после инкубирования клеток с SCF приводит к активации протеинкиназы PKA и её мишени- транскрипционного фактора CREB. Неизвестно каким образом CREB влияет на активность STAT5, но ингибирование PKA или активности CREB блокирует совместное действие EPO и SCF на STAT5 410. Приведённые данные указывают, на то, что активация KIT может усиливать определённые компоненты сигнального каскада JAK2/STAT5.
Кроме того, возможны и другие механизмы кооперации KIT и EPOR, т.к. мутантная форма EPOR, у которой отсутствуют сайты фосфорилирования в тирозинкиназных доменах, проявляет синергизм с KIT409, 411. Тем не менее, наличие у EPOR остатка тирозина Tyr-343 (ответственного за активацию STAT5) существенно усиливает синергическое действие KIT и EPOR. Интересно, что взаимодействие KIT и EPOR сильно зависит от активности семейства Src киназ и наличия остатков тирозина Tyr-567 и -569 у KIT409, 412. Инактивация этих сайтов KIT, ответственных за активацию Src киназ, полностью блокирует синергическое действие с EPOR по стимулированию пролиферации эритроидных предшественников. В свою очередь инактивация сайтов, ответственных за запуск других сигнальных каскадов KIT, снижает совместное действие EPO и SCF, но не блокирует его полностью. Наличие у KIT только сайтов связанных с активацией Src поддерживает синергическое действие EPO и SCF (даже при инактивации всех остальных киназных сайтов KIT)412. Интересно, что восстановление каталитических сайтов KIT, активирующих фосфолипазу PLC-, одновременно с сайтами активации Src блокирует синергизм между KIT и EPOR413. При этом KIT-зависимая активация Src киназ необходима для стрессового эритропоэза и эта функция не может быть полноценно заменена сигнальными каскадами EPO 353. Одной из Src киназ, участвующих в взаимодействии KIT и EPOR может быть киназа Btk. Эта киназа фосфорилируется KIT и JAK2, а также участвует в активации сигнальных каскадов EPO, в том числе она активирует STAT5, PLC- и способствует фосфорилированию самого EPOR. Инактивация Btk снижает способность эритроидных предшественников к самообновлению под действием SCF и EPO414. Предположительно KIT может взаимодействовать и с рецепторами глюкокортикоидов опосредованно через связывание с EPOR. Синтетический глюкокортикостероид дексаметазон увеличил пролиферативный потенциал эритроидных клеток в присутствии SCF и EPO 415. EPOR в свою очередь взаимодействует с рецепторами глюкокортикоидов, что снижает его способность активировать STAT5, однако наличие KIT, возможно, изменит характер взаимодействия EPOR с глюкокортикоидными рецепторами416.
Взаимодействие KIT и EPOR происходит и за счёт их взаимного влияния на экспрессии друг друга. Причём влияние EPO на экспрессию KIT, по-видимому, сильно зависит от степени дифференцированности эритроидных клеток и активности транскрипционных факторов. Активация KIT поддерживает транскрипцию генов EPOR и STAT5 в отсутствие транскрипционного фактора GATA-1 и стимулирует выживание и пролиферацию проэритробластов407. Транскрипция EPOR может при это осуществляться транскрипционным факторов Sp1417. При восстановлении активности GATA-1 происходит репрессия транскрипции гена KIT, а также ингибирование основных сигнальных каскадов, связанных c KIT, при этом проэритробласты полностью дифференцируются под действием EPO398. Кроме того, в негативной регуляции экспрессии KIT под действием EPO могут принимать участие киназы из семейства Src. Активация EPOR под действием EPO может одновременно снижать экспрессию KIT и активировать Lyn киназу. Гиперэкспрессия Lyn приводит к увеличению чувствительности клеток к EPO и снижению чувствительности к SCF418.
Подавление экспрессии KIT приводит к активации промитотических сигнальных путей
Для установления активность каких сигнальных каскадов сильнее всего меняется при подавлении экспрессии KIT в клетках нейробластом и способствует гибели или выживанию клеток, мы провели профилирование транскриптома клеток SH-SY5Y и SK-N-AS с подавленной экспрессией KIT. Чтобы выявить, какие именно изменения ассоциированы с развитие токсического эффекта от подавления KIT, анализ проводился на 3-ий день (когда ещё не было ингибирования роста клеток SH-SY5Y) и на 6-ой день (ингибирование роста клеток и высокий процент апоптотических клеток). Предполагалось, что сравнение этих временных точек позволит определить, какие изменения в активности сигнальных путей ведут к индукции апоптоза и ингибированию роста клеток. Кроме того, была проанализирована популяция SH-SY5Y, которая смогла выжить в течение месяца при подавлении экспрессии KIT. Сравнение этой временной точки с более ранними может помочь определить активность каких сигнальных каскадов связана со способностью этих клеток выживать. Профилирование транскриптома проводили с помощью кастомизированных микрочипов, которые позволяют измерить экспрессию 3706 генов, данные по экспрессии в клетках SH-SY5Y-shKIT и SK-N-AS-shKIT нормировали на экспрессию генов в SH-SY5Y-shSCR и SK-N-AS-shSCR соответственно, для каждой временной точки. Данные по экспрессии 3706 генов, полученные с микрочипов, были затем обработаны с помощью алгоритма OncoFinder, и посчитаны активности 271 сигнальных путей (Рисунок 17А, стр.86). Вкратце, активность каждого сигнального пути оценивалась как взвешенная сумма логарифмов изменения экспрессии генов, входящих в данный сигнальный путь. Таким образом, активность сигнального пути отражает суммарную активность большого числа генов, что позволяет определить комплексные изменения во внутриклеточных процессах, а не только изменения в экспрессии конкретных генов.
Однако анализ активности сигнальных путей показал, что в ответ на подавление экспрессии KIT в клетках SH-SY5Y происходит не активация про-апоптотических сигнальных каскадов, а наоборот активируются сигнальные пути, ответственные за передачу сигналов (внутриклеточные киназы) и сигнальные пути, связанные с активностью ростовых факторов и цитокинов (Рисунок 17Б, стр.86). Более того, эти про-митотические сигнальные пути активируются сильнее на 6-ой, когда как раз проявляется максимальный токсический эффект от подавления KIT. Наиболее активными оказались сигнальные пути, отражающие активность основных протеинкиназ, в частности, Akt, Erk, RAS, cAMP, GSK3, mTOR, ILK и PAK (Рисунок 17Б). Среди активированных сигнальных путей, связанных с действием ростовых факторов можно отметить следующие: сигнальные каскады EPO, Wnt, NGF, TGF, семейство рецепторов ErbB и сигнальный каскад IGF1R. Следует отметить, что несмотря на активацию про-митотических сигнальных путей, сигнальные пути, ответственные за прогрессию клеточного цикла, не активируются в той же мере. Активность сигнального пути ответственных за переход из метафазы в анафазу, одной из контрольных точек клеточного цикла, значительно снижается (Рисунок 17В, стр.86).
Поскольку KIT сам по себе является активатором Akt, Erk, RAS и mTOR, то подобная активация сигнальных каскадов в ответ на его подавление выглядит необычно. Однако аналогичной активации сигнальных путей в клетках SK-N-AS после подавления KIT не происходит, и более того изменения активности сигнальных путей даже уменьшаются к 6-ому дню (Рисунок 18А и Б, стр.88). Т.е. активация сигнальных путей не связана с самим фактом введения shKIT и её возможными побочными мишенями. Отсутствие эффектов от подавления KIT в SK-N-AS и тот факт, что увеличение активности про-митотических сигнальных каскадов коррелирует с усилением токсического эффекта от подавления KIT в SH-SY5Y, говорит о том, что наблюдаемые эффекты связанны именно с подавлением KIT в SH-SY5Y, и, как следствие, индукцией апоптоза и ареста клеточного цикла. Мы предположили, что подобная высокая активность про-митотических сигнальных путей в клетках SH-SY5Y-shKIT может быть связана с запуском механизмов, которые могут компенсировать сниженную активность KIT. То, что изменение активности про-митотических сигнальных путей происходит в ответ на стресс, подтверждается и тем, что активируются киназы p38 и JNK, которые в первую очередь связаны с ответом на стресс (Рисунок 17Б, стр.86). Также активируются механизмы репарации ДНК, которые тоже чаще всего запускаются в ответ на стресс и апоптоз (Рисунок 17В, стр.86). Анализ активности сигнальных путей в популяции клеток SH-SY5Y, которые смогли выжить на протяжении 30ти дней после трансдукции, показал, что активность большинства сигнальных путей значительно снижается по сравнению с 6ым днём (Рисунок 17Б и В). Активность некоторых сигнальных путей, таких как mTOR, GSK3 и ILK даже стала пониженной. Среди сигнальных путей, которые остались активированы, можно отметить Erk, Akt и p38 (Рисунок 17Б, стр.86). Причём сигнальный путь Erk активирован в выживших клетках сильнее всего.
Тепловая карта активности сигнальных путей в клетках SH-SY5Y и SK-N-AS на 3-ий и 6-ой дни после подавления экспрессии гена KIT. Б. Активность сигнальных путей протеинкиназ, передатчиков внутриклеточных сигналов, ростовых факторов и цитокинов в клетках SH-SY5Y на 3-ий, 6-ой и 30-ый дни после подавления экспрессии гена KIT. В. Активность сигнальных путей, связанных с транскрипцией, трансляцией, прогрессией клеточного цикла, репарацией ДНК, активностью каспаз, клеточным цитоскелетом и активностью теломераз в клетках SH-SY5Y на 3-ий, 6-ой и 30-ый дни после подавления экспрессии гена KIT. Активность сигнальных путей отражает суммарные изменения экспрессии генов, ассоциированных с сигнальным путём, в клетках SH-SY5Y-shKIT по сравнению с SH-SY5Y-shSCR.
Активность сигнальных путей протеинкиназ, передатчиков внутриклеточных сигналов, ростовых факторов и цитокинов в клетках SK-N-AS на 3-ий, 6-ой и 30-ый дни после подавления экспрессии гена KIT. В. Активность сигнальных путей, связанных с транскрипцией, трансляцией, прогрессией клеточного цикла, репарацией ДНК, активностью каспаз, клеточным цитоскелетом и активностью теломераз в клетках SK-N-AS на 3-ий, 6-ой и 30-ый дни после подавления экспрессии гена KIT. Активность сигнальных путей отражает суммарные изменения экспрессии генов, ассоциированных с сигнальным путём, в клетках SK-N-AS-shKIT по сравнению с SK-N-AS-shSCR.
FR180204 блокирует способность клеток нейробластом адаптироваться к действию иматиниба
Помимо краткосрочного действия комбинации FR180204 и иматиниба мы проверили и их долгосрочное действие. Исходя из данных по анализу синергии для этих экспериментов мы использовали иматиниб в концентрации IC50, посчитанной без добавления FR180204 для каждой клеточной линии (Таблица 3). FR180204 был использован в максимальной нетоксичной концентрации для каждой клеточной линии. Клетки сажали в указанных количествах за день до добавления ингибиторов. Каждый из ингибиторов по отдельности, или в комбинации добавляли каждые три дня в течение 12-ти дней, при этом старую культуральную среду отбирали и добавляли свежую с ингибиторами. Подсчёт количества клеток также проводили каждые три дня. Интересно, что 5 из 7 линий нейробластом (SH-SY5Y, SK-N-BE, IMR-32, LAN-1, Kelly) смогли адаптироваться действию концентрации IC50 иматиниба и начали расти в присутствии иматиниба (Рисунки 25В и 26В, стр.102 и 103). Действие нетоксических концентраций FR180204 в свою очередь блокирует способность 4-х клеточных линий нейробластом (кроме Kelly) приобретать резистентность к действию иматиниба. Причём, в образцах клеточных линий SH-SY5Y, LAN-1 и IMR-32, которые обрабатывали совместно иматинибом и FR180204, к концу эксперимента не было выявлено живых клеток. Интересно, что, несмотря на низкую синергию для клеток LAN-1, FR180204 всё же заблокировал способность этих клеток адаптироваться к действию иматиниба (Рисунок 26В, стр.103). Суммируя результаты по подсчётам IC50, синергии и способности клеток нейробластомы приобретать резистентность к иматинибу, FR180204 существенно усилил действие иматиниба в 5 из 7 клеточных линий нейробластом: SH-SY5Y, IMR-32, SK-N-BE, SK-N-SH и LAN-1. Для клеточной линии SK-N-AS эффект от комбинированного действия был выражен слабо, кроме того эти клетки не смогли адаптироваться к действию иматиниба в использованной концентрации (Рисунок 26В, стр.103). Единственной клеточной линией, для которой комбинация FR180204 и иматиниба не показала никакого эффекта, была клеточная линия Kelly. Однако все использованные концентрации FR180204 оказались нетоксичными для клеток Kelly, в отличие от остальных клеточных линий (Рисунок 24, стр.99). Возможно, что эффективность совместного действия ингибиторов Erk и иматиниба на клетки конкретных линий нейробластом зависит от того, насколько Erk необходима для выживания этих клеток. Тем не менее, следует отметить, что большинство клеток, изученных нами линий нейробластом, чувствительны к ингибированию Erk, и ингибитор Erk снижает способность этих клеток к выживанию.
Зависимость процента живых клеток SH-SY5Y, IMR-32, SK-N-BE и SK-N-SH от концентрации иматиниба без добавления FR180204, и при добавлении максимальной нетоксичной концентрации или минимальной токсичной концентрации FR180204. Количество клеток измеряли через 72 часа после добавления ингибиторов, ингибиторы добавляли одновременно. За 100% принято количество клеток без добавления ингибиторов (только ДМСО). Б. Тепловые карты синергического действия иматиниба и FR180204, рассчитанные с помощью программного обеспечения SynergyFinder. Synergy score- усреднённое значение показателя синергии для всех комбиниций ингибиторов. Красным цветом отмечены участки, где препараты проявляют синергию, зелёным- где препараты действуют как антагонисты. В.
Динамика роста клеточных линий нейробластом при длительном действии иматиниба, FR180204, а также их комбинации.
Зависимость процента живых клеток LAN-1, SK-N-AS и Kelly от концентрации иматиниба без добавления FR180204, и при добавлении максимальной нетоксичной концентрации или минимальной токсичной концентрации FR180204. Количество клеток измеряли через 72 часа после добавления ингибиторов, ингибиторы добавляли одновременно. За 100% принято количество клеток без добавления ингибиторов (только ДМСО). Б. Тепловые карты синергического действия иматиниба и FR180204, рассчитанные с помощью программного обеспечения SynergyFinder. Synergy score- усреднённое значение показателя синергии для всех комбиниций ингибиторов. Красным цветом отмечены участки, где препараты проявляют синергию, зелёным- где препараты действуют как антагонисты. В. Динамика роста клеточных линий нейробластом при длительном действии иматиниба, FR180204, а также их комбинации.
В данной работе было показано, что подавление экспрессии рецепторной тирозинкиназы KIT вызывает индукцию апоптоза и ингибирование роста клеток нейробластом, в которых экспрессия гена KIT была изначально повышена. При этом, подавление экспрессии KIT в клетках нейробластомы приводит к повышению активности про-митотических сигнальных путей. Эти изменения коррелируют с усилением цитотоксического действия вызванного подавлением KIT. Мы показали, что такие изменения активности сигнальных путей во многом связаны с активацией компенсаторных механизмов. Действительно, мы обнаружили что, несмотря на цитотоксическое действие shKIT на клетки нейробластомы SH-SY5Y, небольшая часть этих клеток всё же выживает и адаптируется к сниженной экспрессии KIT. Одним из возможных компенсаторных механизмов при подавлении экспрессии KIT является усиление активности сигнальных каскадов нейротрофинов. Эти механизмы реализуются через повышение экспрессии самих нейротрофинов NGF и BDNF, и их рецепторов TrkA/TrkB, что приводит к усиленной активации Erk и CREB сигнального пути. При чём, клетки нейробластомы SH-SY5Y с подавленной экспрессией гена KIT обладают повышенной чувствительностью к действию нейротрофинов.
Мы обнаружили, что ключевым компонентом компенсаторных механизмов, позволяющих клеткам адаптироваться к подавленной экспрессии гена KIT является Erk. Игнибирование Erk не только блокирует протективное действие NGF и BDNF, но и усиливает токсическое действие shKIT на клетки SH-SY5Y. Важно, что клетки SH-SY5Y, в которых подавление экспрессии KIT индуцирует гибель, являются более чувствительными к действию ингибитора Erk, чем клетки SH-SY5Y, в которых экспрессия KIT не подавлена, или чем клетки SK-N-AS, в которых подавление KIT не приводит к гибели клеток. Т.е. выживание клеток, которые находятся в состоянии стресса, индуцированного подавлением экспрессии KIT, зависит от активации Erk. При этом в клетках SH-SY5Y для снижения способности клеток к выживанию достаточно даже неполного ингибирования активности Erk, а только ингибирования Erk в небольшом проценте клеток, которые имеют наибольшую активность Erk.