Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из актуальных проблем современной онкоурологии, в связи со значительным распространением у мужчин пожилого и старческого возраста, являются опухоли и опухолевидные образования предстательной железы (ПЖ) [Лоран О.Б. с соавт.1999; Матвеев Б.Б. с соавт.,1999]. Среди них преобладают гиперпластические процессы и рак простаты. По статистическим данным за 2000 год в этой возрастной группе рак предстательной железы (РПЖ) вышел в России на 2-е место после рака легкого в структуре смертности от онкологических болезней [Самсонов В.А., 1985; Кушлинский Н.А. с соавт., 2002]. Почти у 70% больных он впервые выявляется в 3-4 стадии.
Проблема новообразований ПЖ содержит ряд нерешенных вопросов, связанных с ранней диагностикой рака и предраковых состояний простаты, имеющих как теоретическое, так и практическое значение [Пушкарь Д Ю., 2003; Honn K.V. et al.,1996].
Гистологическая диагностика предраковых поражений и РПЖ нередко представляет значительные трудности, особенно в биопсийном материале. Поэтому для морфологической диагностики РПЖ и предраковых процессов большое практическое значение приобретают поиски новых четких дифференциально-диагностических критериев [Медведев В.Л., 1999]. Основным направлением при этом становится изучение молекулярных основ патологических изменений ПЖ и внедрение в практику микроспектрофотометрических и иммуногистохимических методов диагностики.
Обнаружены различные биомаркеры опухолей, которые с помощью методов иммуноморфологии выявляются в клетках простаты при ее неопластических изменениях. Среди биомаркеров опухолевого роста во многих опухолях выделяется антионкоген р53 [Carson DA., 1995; Копнин Б.П. с соавт.,2000]. Отмечена огромная роль этого антионкогена во внутриклеточной "охранной системе", предотвращающей пролиферацию и накопление в организме аномальных клеток.
Другим фактором, обеспечивающим стабильность клеточной популяции, является система апоптоза. Вс1-2 обладает способностью ингибировать процесс апоптоза, а Вах-сго индуцировать [Коган Е.А., 1997]. Особое место занимает белок HDLF, запускающий процесс апоптоза.
РОС. НАЦИОНАЛЬНА» БИБЛИОТЕКА I
Одпой из наиболее важных характеристик новообразования является потенциал его роста, определяемый с помощью маркера пролиферации антигена Ki-67 [Brown D.O , Garter К.С., 1990].
Простатспецифический антиген (ПСА) - опухолевый маркер, получивший широкое распространение в клинической практике в целях диагностики и мониторинга РПЖ. Секреция ПСА в кровь зависит от состояния секреторного эпителия желез простаты и имеет в связи с этим прогностическое значение [Fortier А Н etal ,1999]
Развитие неоплазий начинаются с нарушения генетической регуляции и усиленной пролиферации клонов клеток. Одним из следствий нарушения прохождения фаз клеточного цикла в опухолевых клетках является изменение содержания ДНК. Превышение средних показателей плоидности клеток выше значений 2с (диплоидный набор ДНК) отражает физиологическую или патологическую пролиферативную активность клеток и может свидетельствовать об опухолевой прогрессии [Автандилов Г.Г., 1996;2002]. Микроспектрофотометрическое определение содержания ДНК методом компьютерной плоидометрии в ядрах клеток делает возможным количественную оценку плоидности их ядер.
Однако, несмотря на обилие иммуногистохимических исследований ПЖ с выявлением разнообразных биомаркеров при диагностике опухолевых и предопухолевых процессов, в том числе при раках разной степени дифференцировки, полученные результаты часто оказываются противоречивыми и даже противоположными. Результаты микроспектрофотометрического исследования содержания ДНК при предраковых состояниях ПЖ и раке разной степени дифференцировки также характеризуются разными данными.
Между тем, сравнительное исследование экспрессии различных биомаркеров в комплексе с изучением содержания ДНК в ядрах клеток в ткани ПЖ при ее гиперпластических и неопластических изменениях, позволило бы выявить наиболее характерные молекулярно-биологические особенности таких изменений. Значение выявления нарушения экспрессии различных биомаркеров в диагностике предопухолевых и опухолевых процессов ПЖ пока не оценено и не имеет математически обоснованных диагностических рекомендаций Не производилось сопоставления результатов гистологического, иммуноморфологического и плоидометрического исследования гиперпластических и неопластических изменений ПЖ для выработки оптимального алгоритма их морфологической дифференциальной диагностики.
<1 *ч
5 Цель и задачи исследования
Цель работы - изучение плоидности и экспрессии р53, ПСА, маркеров пролиферации Ki-67 и апоптоза Вс1-2,Вах и HDLF в эпителии предстательной железы для объективизации морфологической диагностики доброкачественной железистой гиперплазии, простатической интраэпителиальной неоплазии и рака простаты
Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:
изучить гистологические дифференциально-диагностические особенности гиперпластических, предраковых процессов и рака предстательной железы;
изучить экспрессию маркеров апоптоза и пролиферации (Bcl-2, Вах, Ki-67, HDLF), р53 и простат-спсцифического антигена эпителиальными клетками простаты при гиперпластических, предраковых процессах и раке предстательной железы (разной степени дифференцировки);
определить плоидность ядер эпителиальных клеток простаты при гиперпластических, предраковых процессах и раке предстательной железы (разной степени дифференцировки);
- 'выявить коррелятивные связи между показателями плоидности эпителиальных
клеток простаты и особенностями экспрессии ими маркеров апоптоза и пролиферации
Bcl-2, Вах, Ki-67, р53, простат-специфического антигена при гиперпластических,
предраковых процессах и раке предстательной железы (разной степени
дифференцировки);
- разработать критерии морфологической дифференциальной диагностики
гиперпластических, предраковых процессов и рака простаты (разной степени
дифференцировки) с использованием методов компьютерной плоидометрии и
иммуноморфологии.
- уточнить морфологические критерии прогноза при раке предстательной железы.
Научная новизна
- микроспектрофотомстрически методом компьютерной плоидометрии выявлены
объективные критерии дифференциальной диагностики гиперпластических процессов,
предраковых состояний и рака простаты;
- получены дифференциально-диагностические критерии по экспрессии маркеров
пролиферации и апоптоза, р53 и ПСА при гиперпластических процессах, предраковых
состояниях ираке простаты;
выявлены особенности экспрессии нового биомаркера (IIDLF) как маркера неопластических изменений эпителия простаты;
установлена коррелятивная связь между показателями плоидности эпителиальных клеток простаты и иммуногистохимической экспрессией маркеров р53, Ki-67, bcl-2 при гиперпластических процессах, предраковых состояниях и раке простаты разной степени дифферепцировки,
- на основании выявленных иммунофенотипических и плоидометрических
показателей получены данные о гетерогенности злокачественных опухолей
предстательной железы, которые могут быть использованы при оценке их прогноза.
Практическая значимость работы
Выявленные при микроспектрофотометрии закономерности распределения ядер
различной плоидности могут быть использованы в качестве объективного критерия
дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, предраковых состояний и
рака простаты Результаты экспрессии ряда биомаркеров пролиферации и апоптоза,
полученные при иммуногистохимическом исследовании патологических изменений ПЖ,
отражают выраженность молекулярных изменений эпителия простаты при
гиперпластических процессах, предраковых состояниях и раке простаты Наличие или отсутствие экспрессии р53, bcl-2, Ki-67 и ее выраженность могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических критериев при исследовании биопсий простаты.
Разработанные дополнительные критерии морфологической диагностики
патологических процессов в простате, включающие комплексное
микроспсктрофотометрическое и иммуногистохимическое исследование, обладая достаточно высокой точностью и надежностью, дают возможность при подозрении патогистолога на наличие неопластических изменений. Предложенные дифференциально-диагностические признаки аденокарцином разной степени дифферепцировки позволяют более объективно проводить их диагностику и судить о прогнозе заболевания.
7 Внедрение результатов в практику
Результаты работы применяются при диагностике злокачественных опухолей предстательной железы в патологоанатомическом отделении Госпиталя ветеранов войн №2; в Московском городском центре патологоанатомических исследований при Городской клинической больнице № 33 им.проф А.А.Остроумова, в патологоанатомическом отделении Городской клинической больницы № 50, используются в лекционном курсе для врачей-патологоанатомов на кафедре патологической анатомии Российской медицинской академии последипломного образования.
Основные положения, выносимые ла защиту
Ггиперпластические, предраковые и опухолевые процессы в простате характеризуются определенным разбросом плоидометрических показателей ядер эпителиальных клеток Плоидометрическое исследование ядер железистого эпителия простаты выявило достоверные различия показателей плоидности и прогрессирующее увеличение индекса накопления ДНК при доброкачественной гиперплазии, предраковых процессах и раке разной степени дифференцировки.
Плоидометрическое исследование выявляет доминирующий модальный класс клеток, характерный для гиперпластических, предраковых процессов и рака простаты. Доброкачественная железистая гиперплазия характеризуется диплоидным модальным классом, атипические железы (атипическая мелкоацинарная пролиферация) -триплоидным и тетраплоидным набором, простатическая иитраэпителиальная неоплазия тераплоидным набором, рак простаты - анеуплоидией Тетра - и анеуплоидия характеризуют злокачественный характер процесса.
Иммуногистохимическое исследование маркеров пролиферации и ашгатоза выявило молекулярно-биологические особенности гиперпластических, предраковых процессов и рака предстательной железы. Увеличение экспрессии р53, Ki-67, Bcl-2, Вах, ПСА в эпителиальных клетках простаты наблюдается по мере нарастания неопластической тарнсформации Выраженная экспрессия биомаркеров пролиферации и ингибиции апоптоза являются неблагоприятным прогностическим признаком. Внутриклеточная экспрессия маркера апоптоза HDLF является показателем злокачественности процесса.
Выявлена достоверная прямая корреляция между нарастанием плоидности эпителиальных клеток и экспрессией р53, Ki-67,Bcl-2 при гиперпластических и
неопластических изменениях предстательной железы Увеличение плоидности и
пролиферативной активности опухолевых клеток аденокарцином простаты
сопровождается усилением экспрессии Ki-67, р53, Bcl-2 .
На основании плоидометрического и иммуногистохимического исследования вьмвлены неблагоприятные прогностические факторы аденокарцином К ним относятся выраженность анеуплоидии опухолевых клеток, гиперэкспрессия р53, Ki-67, Bcl-2,Bax, ПСА.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на 6-й Всероссийской конференции по патологии клетки (28-30 ноября 2000 г.); 19-й и 20-й научно-практических конференциях «Морфометрия в диагностике болезней» (2001 и 2003 гг.); заседании Московского научного общества патологоанатомов (2003 г), научно-практической конференции «Современные возможности диагностики и лечения рака предстательной железы» (2004 г.); 3-й Московской ассамблее «Здоровье столицы» ( 16-17 декабря 2004 і, г.Москва.)
Публикации
Но теме диссертации опубликовано 23 печатных работы, 9 из которых в центральных медицинских журналах, 3 - в зарубежных журналах Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав и выводов, иллюстрирована 39таблицами, 48 рисунками и 16 графиками. Библиография включает 43 отечественный и 304 зарубежный источника литературы.
Материал исследования
В диссертационное исследование включен операционный материал от 300 пациентов (средний возраст 76,2±0,98) с железистой гиперплазией простаты (32 наблюдения), микроацинарной гиперплазией(12 наблюдений), атипическими железами (атипической мелкоацинарной пролиферацией)(14 наблюдений), простатической интраэпителиальной неоплазией (84 наблюдения) и карциномами различных степеней дифференцировки (148 наблюдений). Материал получен при биопсиях простаты, при ТУР
9 и аденомэктомиях. Контрольной группой являлся секционный материал неизменной простаты от 5 умерших от заболеваний, не связанных с онкологической патологией.
Методы исследования
Гистологические. Для гистологического исследования полученный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимические. Для иммуногистохимического исследования
использовали материал, фиксированный в 10% нейтральном формалине и залитый в парафин. Исследования проводили с применением моно-и поликлональных антител к p53,Bcl-2,Bax, КІ67, ПСА (компании Daco corporation), HDLF(cmrre3HpoBaH в Институте биоорганической химии им. Шемякина), авидин-биотиновым методом. При постановке иммуногистохимичексой реакции использовали универсальный DAC - LSAB+kit пероксидазный (Daco corporation). При определении ядерных антигенов возникают определенные трудности, так как при фиксации ткани простаты и заключении в парафин происходит изменение стереоструктуры белков и наблюдается так называемое маскирование антигенов. В связи с этим, в качестве демаскирующего приема использовали общепринятое нагревание стекол со срезами в микроволновой печи. Срезы докрашивали гематоксилином Майера. Продукты иммунологических реакций проявлялись в виде гранул разных оттенков коричневого цвета либо в ядрах клеток [р53, Kj-67, Bcl-2, HDLF], либо в цитоплазме клеток [Вах, ПСА], либо в цитоплазматической мембране или внутриклеточно [HDLF].
Продукты реакций оценивали полуколичественным методом в баллах от 0 до ++ (сильно выраженпая реакция) с определением процента окрашенных клеток на 100 клеток.
Статистические. При решении дифференциально-диагностических задач статистическую обработку полученного цифрового материала производили на персональном компьютере с использованием статистической программы «Статистика -6,0» на основании выделения коэффициента корреляции (г), точного критерия Фишера (двухстороннего), а также методов вариационной статистики [2] с использованием t критерия Стьюдента. Достоверными считали различия с вероятностью р< 0,05
Плоидометрические.
Для проведения микроспектрофотометрического исследования удаленные фрагменты ПЖ фиксировали в 10% растворе формалина или в жидкости Карнуа.
10 Содержание ДНК исследовали в ядрах эпителиальных клеток ПЖ в препаратах, окрашенных по Фельгену в строго стандартных условиях.
Работа производилась на компьютерном анализаторе изображений «Имаджер-ЦГ» с использованием версии программы для гшоидометрии «Avtan-San» по методу Г.Г.Автандилова. Условия освещения и порог яркости измеряемых объектов были одинаковыми для всех измерений. При увеличении микроскопа в 400 раз измеряли интегральную яркость окрашенных ядер, которая представляла собой сумму яркости всех точек (пикселей) ядра, отражающих содержание в них Фельген-ДНК. При проведении компьютерной плоидометрии плоидность ядер клеток визуализируется разными цветами (синий цвет обозначает диплоидный набор, зеленый - триплоидный, красный -тетраплоидный, оранжевый - анеуплоидный), что дает возможность судить о «профиле» клеток патологически измененной ткани.
Условный тканевой стандарт плоидности получен по данным исследования ядер 396 малых лимфоцитов (с диплоидным набором ДНК) в срезах изучаемой ткани ПЖ.. За стандарт плоидности (1 с) принимали половину показателя интегральной яркости, равного 40000 единиц.
Для вычисления плоидности ядер исследуемых эпителиальных клеток предстательной железы в единицах «с», средние показатели интегральной яркости их ядер делили на тканевой стандарт Для общей оценки пролиферативного клона эпителиальных клеток вычисляли «индекс накопления ДНК - ИНДНК»[Г.Г.Автандилов, 1996], приходящийся на «условное ядро» (средне-взвешенное значение измерений ядер определенной клеточной популяции). Анализу плоидности подвергли 1210 ядер эпителиальных клеток предстательной железы.
Все измерения и вычисления были автоматизированы. На экран монитора компьютера и в печать выводили результаты измерений площадь оптического сечения ядер клеток [в условных единицах - «пикселях»]; их плоидность [в единицах «с»]; показатели значений лимитов, средних арифметических [М], среднеквадратических отклонений [о] и ошибок выборок [т], а также гистограммы распределения указанных показателей. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием средней арифметической М, «индекса накопления ДНК» - взвешенной средней арифметической содержания ДНК на ядро, определяемой путем суммирования произведений плоидности выбранных для исследования ядер клеток на их число с последующим делением на общее количество изучаемых ядер