Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Хеликобактер-ассоциированные заболевания: современное состояние проблемы 14
1.1. Инфекция H. pylori. Общие вопросы 14
1.2. Роль H. pylori в патогенезе хронического гастрита 16
1.3. Роль H. pylori в патогенезе язвенной болезни 23
1.4. Роль мелатонина и эндотелинов в регуляции клеточного гомеостаза эпителиоцитов СОЖ при заболеваниях, ассоциированных с H. pylori 28
1.5. Перспективные направления использования эрадикационной терапии 37
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Объект исследования 40
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клинические методы исследования 43
2.2.2. Лабораторные методы исследования 43
2.2.3. Инструментальные методы исследования 44
2.2.4. Морфологические методы исследования 44
2.2.5. Специальные морфологические методы исследования 45
2.2.6. Методы морфометрии 47
2.2.7. Методы психологического исследования и оценки качества жизни 48
2.2.8. Фармакоэкономическое исследование коэффициента «затраты-эффективность» 50
2.2.9. Методы оценки эффективности лечения язвенной болезни 51
2.2.10. Методы статистического анализа 52
ГЛАВА 3. Клинико-эндоскопические, психологические морфологические и иммуногистохимические параметры групп сравнения 53
3.1. Клинические, психологические, лабораторные, инструментальные, морфологические и иммуногистохимические параметры группы практически здоровых лиц 53
3.2. Клинические, инструментальные, гистологические и иммуногистохимические параметры группы пациентов с хроническим неатрофическим гастритом 57
3.3. Клинико-эндоскопические, морфологические и иммуноморфологические параметры пациентов с хроническим атрофическим гастритом 67
ГЛАВА 4. Особенности клинико-эндоскопических, морфологических, иммуногистохимических и фармакоэкономических параметров у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в динамике заболевания 83
4.1. Клиническая характеристика язвенной болезни двенадцатиперстной кишки в периоде обострения 83
4.2. Эндоскопические и морфологические параметры слизистой оболочки желудка у пациентов в фазе обострения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки 90
4.3. Оценка иммуногистохимических показателей в периоде обострения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки 96
4.4. Клинико-эндоскопическая характеристика пациентов с ЯБДК
в фазе ремиссии заболевания 103
4.5. Эндоскопические и морфологические параметры слизистой
оболочки верхних отделов желудочно-кишечного тракта у
больных с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в фазе ремиссии 108
4.6. Характеристика End-1-, МТ-иммунопозитивных клеток и апоптоза эпителиоцитов СОЖ в фазе ремиссии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки 112
ГЛАВА 5. Сопоставление фармакоэкономических показателей при использовании различных схем эрадикации h. Pylori и терапии обострения ябдк 114
Заключение 121
Выводы 126
Практические рекомендации 128
Список использованной литературы
- Роль H. pylori в патогенезе язвенной болезни
- Методы психологического исследования и оценки качества жизни
- Клинические, инструментальные, гистологические и иммуногистохимические параметры группы пациентов с хроническим неатрофическим гастритом
- Оценка иммуногистохимических показателей в периоде обострения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки
Роль H. pylori в патогенезе язвенной болезни
В антральном отделе желудка пролиферативная активность эпителиоцитов во многом индуцируется воспалительным процессом, уменьшающимся и даже исчезающим при резком уменьшении степени обсемененности H. pylori в СОЖ. В теле желудка пролиферация эпителия, в основном, инициируется лимфоцитарной инфильтрацией, которая медленно сокращается после элиминации H. pylori [25,26,27,180,181,193]. В ряде работ продемонстрировано, что при гастрите, ассоциированном с H. pylori, происходит значительное увеличение численности рецепторов к эпидермальному фактору роста, что во многом обусловливает нарастание клеточной пролиферации [155,156,159]. Показано, что ускоренная пролиферация эпителия СОЖ у пациентов с хроническим H. pylori ассоциированным гастритом лежит в основе возникновения и прогрессирования атрофических изменений СОЖ, что связано с более скорым перемещением не полностью созревших эпителиальных клеток из генеративной зоны желез в места дислокации зрелых клеток. Это ведет к невозможности формирования полноценных желудочных желез, в результате чего их количество начинает уменьшаться [4,109, 239,240]. Существуют данные, что возникновение и прогрессирование атрофии слизистой оболочки при ХГ, в большей мере, характерно для лиц, инфицированных Cag+ - и, особенно, CagА+VacA+ подтипа s1a штаммами H. pylori. Данные штаммы H. pylori обладают наибольшей способностью усиливать пролиферативную активность эпителиальных клеток СОЖ при незначительном влиянии на их апоптозный потенциал [54,137,138]. Высокая степень пролиферации и относительно невысокая апоптозная активность создают повышенный риск возникновения атрофии, мутаций, дисплазии эпителия и рака желудка (РЖ) кишечного типа [5,8,9,111, ,195,196,212 ,229]. Существуют данные, что H. pylori способен напрямую изменять экспрессию молекул, регулирующую процессы клеточного обновления, изменяя, тем самым, соотношение пролиферации и апоптозной активности [163]. Особенно значимым фактом, подтверждающим участие высокой степени пролиферации эпителиоцитов СОЖ, при относительно низкой апоптозной активности эпителия в патогенезе H. pylori-ассоциированного атрофического гастрита, является отсутствие нормализации показателей пролиферативной активности эпителия СОЖ после выполнения эрадикационной терапии. При этом апоптоз не достигает физиологического уровня, что, как считается, обусловливает редкость обратного развития атрофии [93,187,188,191,199]. Доказано, что при атрофическом гастрите клетки СОЖ приобретают иные морфофункциональные свойства и обладают способностью экспрессировать антиапоптозную молекулу Bcl-2 и блокируют запуск апоптоза [48,100,142,143,191,204]. Наличие значительных изменений генетического аппарата клеток эпителия СОЖ у пациентов с хроническим атрофическим H.pylori-ассоциированном гастритом подтверждается обнаружением в эпителиоцитах повышенного уровня цитокератина – 1, не встречающегося в нормальной ткани [83]. Нарушения клеточного генотипа имеют необратимый или частично обратимый характер, что и обусловливает стойкость атрофических и метапластических изменений.
В настоящее время существуют публикации, свидетельствующие о возможности обратного развития как атрофии [141,150], так и кишечной метаплазии [251], однако все же это не является общепризнанным фактом [168,201]. В любом случае обратное развитие атрофии и кишечной метаплазии процесс, занимающий десятилетия человеческой жизни, никогда не приводит к полной нормализации СОЖ [35,36].
Апоптозная активность эпителиоцитов СОЖ при H. pylori инфекции усиливается благодаря нескольким механизмам. Во-первых, H. pylori способен взаимодействовать с молекулами МНС II большого комплекса гистосовместимости на поверхности эпителиальных клеток, что индуцирует запуск апоптоза. Во-вторых, высокая степень пролиферации, создает большое количество неполноценных в морфологическом и функциональном плане клеток, что также инициирует апоптоз [144,145,233]. Незрелые клетки в большей степени подвержены повреждающему действию свободных радикалов, образующихся в больших количествах клетками воспаления [108,10,167,217]. В-третьих, для H. pylori свойственна антигенная мимикрия, которая запускает образование аутоантител, способных индуцировать процесс апоптоза в специализированных клетках эпителия [129,140,141,180,183].
В настоящее время описаны факторы патогенности H. pylori. Первый из них протеин CagA с молекулярной массой 120кДа, ассоциирующийся с язвенной болезнью, РЖ и лимфомой. Протеин CagA экспрессируется соответствующим геном cagA+, называющимся цитотоксин ассоциированным, являющимся маркером островка патогенности.
Проникновение в эпителиальные клетки СОЖ протеина СagA вызывает индукцию ростковых факторов, мобилизацию и реорганизацию актина, синтез различных цитокинов. Наличие CagА фактора способствует интенсивной колонизации H. pylori СОЖ и - возникновению интенсивного воспалительного процесса [1,2,82,254,255,256]. Все выше перечисленное, повышает риск возникновения атрофического гастрита в 3 раза, а кишечной метаплазии в 12 раз у пациентов, инфицированных CagА+ штаммами H. pylori [103,104,164]. Существуют также данные, что генотип CagА+ часто ассоциируется с гастродуоденальной язвой [80,81,82,245,246].
Методы психологического исследования и оценки качества жизни
Иммуногистохимические и электронно-микроскопические исследования морфологического материала СОЖ выполнялись на базе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН при научном консультировании руководителя отдела клеточной биологии и патологии З.Д.Н. РФ, д.м.н. профессора И.М. Кветного.
Иммуногистохимический метод применялся для определения эпителиальных клеток антрального отдела желудка, продуцирующих МТ, End-1. Иммуногистохимическое исследование проводилось с применением моноклональных мышиных антител к End -1 (Sigma, St. Louis, USA ,титр 1:200), поликлональных кроличьих антител к МТ (1:100, CIDtech Res. Comp.).
В качестве вторичных антител применяли универсальный набор с биотинилированными антимышиными и антикроличьими иммуноглобулинами. Визуализацию окрасок выполняли при помощи комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой, с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra).
Для выполнения иммуногистохимической реакции применяли стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена в 0,01 М цитратном буфере при рН 7,6. Методология визуализации иммуногистохимической реакции реализовывалась по схеме, предложенной Петровым СВ. и соавт. в 2004 году: 1) биопсийные срезы, прогретые в термостате при температуре в 56С в течение 10 минут, депарафинировали через этанол, ксилол и доводились до метки дистиллированнной водой; 2) в течение 10 минут выполнялась блокирование эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода; 3) морфологические срезы обрабатывали в растворе трипсина с кальцием хлоридом в термостате при температуре +37С в течение 15 минут и промывали в трис-NaCl-буфере при рН 7,6 в течение 5 минут; 4) морфологические срезы помещали в холодильник при температуре + 4С на 20 минут, а затем дополнительно промывали в трис NaCl-буферепри рН 7,6 в течение 5 минут; 5) морфологические срезы инкубировали с нормальной неиммунной сывороткой в течение 30 минут при комнатной температуре; 6) на морфологические срезы наносили первичные антитела (против выявляемого гормона) и ставили их во влажную камеру и инкубировали в течение часа в термостате; 7) после инкубации в термостате с первичными антителами морфологические срезы промывались в 2 сменах трис-NaCl-буфера. Далее наносились вторичные биотинилированные антитела к иммуноглобулинам животного – донора первичных антител. Затем выполнялась инкубация в течение 30 минут при комнатной температуре; 8) морфологические срезы промывались в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут. Затем наносили комплекс авидина с биотинилированной пероксидазой и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре; 9) морфологические срезы промывались в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут, маркерный фермент (биотинилированная пероксидаза) проявлялся в инкубационной смеси с диаминобензидином и перекисью водорода в течение 10 минут (DAB liquid substrate dropper system, Sigma); 10) полученные препараты промывались в 2 сменах дистиллированной воды по 5 минут и далее последовательно обезвоживались в спиртах, просветлялись в ксилоле и заключались в синтетической среде (Novomount Permanent Slide, Novocastra). Окраска клеток в коричневый цвет свидетельствовало о положительной иммуногистохимической реакции. Исследуемые иммуногистохимические маркеры верифицировались до проведения эрадикационой терапии и через 6 недель. Определение апоптозных ядер проводилось по методу Б. Мозера (1995).
Для электронно-микроскопического исследования было отобрано 19 пациентов: 4 - практически здоровых лиц, 5 лиц с ХНХГ, 6 - с ХАХГ и 8 - с ЯБДК. Для проведения электронно-микроскопического исследования морфологический материал фиксировался в 2,5% глутаральдегиде с дальнейшей дофиксацией 4% осмием, затем заливался в смесь эпонов. Морфологические срезы (толщина 250-300 А), полученные на ультратоме LKB-7A (марка LKB, Malmo, Sweden) окрашивали уранил-ацетатом и цитратом свинца с дальнейшим изучением и фотографированием в электронном микроскопе JEM-100S (марка JEOL, Tokyo, Japan).
Клинические, инструментальные, гистологические и иммуногистохимические параметры группы пациентов с хроническим неатрофическим гастритом
Полученные данные, характеризующие качества жизни, показывают зависимость факторов, характеризующих физическую активность, от психического статуса, чем и объясняется значительное снижение модуля активности больных с ЯБДК, по сравнению с группой практически здоровых лиц и пациентами с хроническими гастритами.
Из патологических примесей при копрологическом исследовании у 9% (9) человек обнаруживался лейкоцитоз, у 11% (11) признаки креатореи, у 7% (7) диагностировалась амилорея и у 6% (6) человек стеаторея. Реакция Грегерсена была положительной у 8% (8) человек. Определение патологических примесей в кале у части пациентов с ЯБДК объяснялось наличием хронического панкреатита и хронического неязвенного колита.
Исследование общего анализа крови у больных с ЯБДК констатировало наличие несколько меньшие показателей ЦП, по сравнению с пациентами с ХНХГ и ХАХГ (р0,05), однако вписывающегося в критерии нормы. Также у пациентов с ЯБДК отмечались более высокие цифры нормы СОЭ, по сравнению с практически здоровыми и больными с ХНХГ. У пациентов с ЯБДК определялись более низкие значения концентрации эритроцитов, по сравнению с группой больных с ХАХГ. Однако во всех обследованных группах пациентов все показатели общего анализа крови соответствовали общепризнанным стандартам нормы.
При ФГДС, у всех обследованных пациентов определялись язвенные дефекты слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, располагающиеся на фоне характерных признаков хронического дуоденита (гиперемия и отек слизистой оболочки луковицы двенадцатиперстной кишки). Также у пациентов с ЯБДК определялись эндоскопические признаки хронического антрального гастрита.
Практически у всех пациентов с ЯБДК при ФГДС диагностировались одиночные язвы, располагающиеся в луковице двенадцатиперстной кишки. Они верифицировались у 92 (92%) человек. У 8 (8%) пациентов определялись 2 язвенных дефекта, находящиеся также в луковице двенадцатиперстной кишки. У 4 (4%) обследованных лиц язвенные дефекты находились в залуковичном отделе двенадцатиперстной кишки. Размеры язв варьировали от 3 мм до 1,5 см (в среднем 10,0±0,94 мм). Язвенные дефекты имели различные очертания в виде линейной, полигональной или овальной форм, покрытые сероватым или желтоватым налетом. Край язвенных дефектов был в значительной мере отечным, неровным и легко кровоточил. Все это свидетельствовало в пользу диагноза ЯБДК [61].
У 89 (89%) больных верифицировалась очаговая атрофия слизистой оболочки антрального отдела желудка и, тем самым, подтверждалось общепринятое мнение о взаимосвязи хронического атрофического антрального гастрита и ЯБДК. Воспалительные и атрофические изменения в фундальном отдела желудка не определялись ни у одного из обследованных больных, что также доказывает существующий взгляд на обратную связь между ЯБДК и атрофическим процессом слизистой оболочки дна желудка.
В ходе ФГДС у 14 (14%) пациентов диагностировался рефлюкс-эзофагит: у 9 (9%) катаральный и у 5 (5%) эрозивный. У 76 (76%) определялся дуодено-гастральный рефлюкс. В целом эндоскопическая картина верхних отделов ЖКТ соответствовала, описанной в литературных источниках у пациентов с язвенной болезнью [60]. При рН-метрическом исследовании тела желудка рН в среднем составляла 1,87±0,1 (таблица 17).
Гистологическое исследование морфологического материала слизистой оболочки тела, антрального и фундального отделов желудка у больных, страдающих ЯБДК, в основном подтверждали результаты исследований, полученных при ФГДС. В антральном отделе желудка у всех больных при морфологическом исследовании определялись признаки воспалительного процесса, характеризующегося инфильтрацией собственной пластинки и эпителия слизистой оболочки полиморфноядерными и мононуклерными лейкоцитами, формирующими, так называемые, «внутриямочные абсцессы». В соответствии с Сиднейской системой (1994), у 64 (64%) пациентов определялась умеренная гистологическая активность воспалительного процесса, у 19 (19%) – незначительная и у 17 (17%) - высокая. У 89 (89%) пациентов с ЯБДК обнаруживались атрофические изменения слизистой оболочки антрального отдела желудка: соответственно у 26 (21%) лиц – незначительная атрофия, у 41 (41%) умеренная и у 22 (22%) - выраженная атрофия. При этом атрофические изменения слизистой оболочки тела желудка определялись лишь у 10 (10%) пациентов, при этом степень выраженности их была незначительной.
На фоне существующих атрофических изменений у 44 (44%) пациентов определялась дисплазия слизистой оболочки и/или кишечная метаплазия (у 71-71% пациентов). Соответственно, у 33 (33%) пациентов диагностировалась 1 степень дисплазии эпителия СОЖ, у 11 (11%) - 2 степень дисплазии. У 42 (42%) обследованных диагностировалась кишечная метаплазия 1 степени, у 26 (26%) - метапластические изменения 2 степени и у 4 (4%) – метаплазия 3 степени. Полная кишечная метаплазия диагностировалась у 40 (40%) пациентов, а неполная – у 1 (1%) больного.
У всех пациентов при гистологическом исследовании СОЖ имела место обсемененность H. pylori. При этом у 28 (25,4%) больных - третья степень, у 51 (51%) – умеренная и у 21 (21%) – незначительная (таблица 17).
В ходе проведенных исследований показано, что развитие ЯБДК, в большинстве случаев сопровождается высокой степенью активности антрального гастрита, наличием атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка, как правило, умеренной степенью обсемененности СОЖ H. pylori, частым обнаружением кишечной метаплазии и дисплазии слизистой оболочки антрального отдела желудка, отсутствием патологического процесса в слизистой оболочке тела и фундального отдела желудка. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что у пациентов с ЯБДК достоверно чаще, чем у пациентов с хроническими гастритами определяются эзофагиты, дуодено-гастральный рефлюкс, эрозии СОЖ, высокая активность воспалительного процесса в СОЖ. У пациентов с ЯБДК диагностируется более выраженный атрофический процесс в антральном отделе желудка, но достоверно реже в теле желудка, по сравнению с больными, страдающими ХАХГ.
Оценка иммуногистохимических показателей в периоде обострения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки
Приводим наблюдение. Больной К. 24 лет, водитель, поступил в госпиталь 24 октября 2011 года с жалобами на боли в эпигастральной области натощак и ночью, купирующиеся приемом лекарственных или пищевых антацидов, изжогу, однократную рвоту желудочным содержимым.
Считает себя больным в течение двух недель, когда появились вышеуказанные жалобы. К врачам не обращался, лечился самостоятельно антацидами. Курит с 16 лет по пачке сигарет в сутки. Алкоголь употребляет умеренно. Питается нерегулярно, часто «всухомятку». Рабочий день не нормирован. Отец страдает язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.
Объективно. Телосложение правильное. Индекс массы тела 23,7. Кожные покровы и слизистые обычной окраски. Отмечается стойкий красный дермографизм. В легких выслушивается везикулярное дыхание, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритм сердца правильный. Живот при пальпации мягкий, умеренно болезненный в эпигастральной области. Симптомы раздражения брюшины отсутствуют. Печень у края реберной дуги.
Качество жизни снижено в основном по показателям: боль -54,4; общее (52,6) и психическое (47,2) здоровье. Тип отношения к болезни – тревожный.
ФГС от 25. 10.11 года. Заключение: на передней стенки луковицы двенадцатиперстной кишки определяется дефект овальной формы диаметром 7 на 8 мм. В антральном отделе желудка 2 эрозии диаметром до 3 мм. Взята биопсии для морфологического исследования из антрального и фундального отделов желудка.
При морфологическом исследовании от 25.10.11 года диагностирован поверхностный антральный гастрит, умеренной степени активности. Н.pylori (++). Данные иммуноморфологического исследования от 25.10.11 года. Количество МТ-клеток -11,8 на 0,1 мм2, число End-1-иммунопозитивных клеток – 40,3 на 0,1 мм2 слизистой оболочки антрального отдела желудка. Iапопт – 1,54%. Поставлен диагноз: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки в фазе обострения, ассоциированная с H.pylori. Проведена эрадикационная терапия в течение 7 дней: амоксициллин 2000 мг в сутки, кларитромицин 1000 мг в сутки, омепразол 40 мг в сутки и мелатонин 3 мг в сутки. В результате проводимой терапии болевой синдром в эпигастральной области был купирован через 4 суток после начала терапии. Через 2 недели 9.11. 2011 года при эндоскопическом исследовании на месте бывшей язвы определяется красный рубец. Эрозии в антральном отделе эпителизировались. Продолжена терапия омепразолом в суточной дозе 40 мг в сутки. ФГС от 09.12. 2011 года. На месте язвы определяется рубец. Тип отношения к болезни к 09.12.2011 году расценивается как гармоничный. Качество жизни по показателям: боль -78,6; общее (64,8) и психическое (75,3) здоровье приблизилось к группе сравнения. Данные морфологического исследования от 09.12. 11 года. Признаки активности гастрита отсутствуют. H. pylori в слизистой оболочке антрального отдела желудка не определяются. Данные иммуноморфологического исследования от 09.12. 2011 года . Количество МТ-клеток - 17,9 на 0,1 мм2, численность End-1-иммунопозитивных клеток 25,3 на 0,1 мм2 слизистой оболочки антрального отдела желудка. Iапопт – 0,75%.
Таким образом, у больного К. на фоне отягощенной наследственности по язвенной болезни, нерегулярного питания, ненормированного рабочего дня возникла язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Заболевание протекало на фоне тревоги и снижения качества жизни. При эндоскопическом, морфологическом и иммуноморфологическом исследовании были верифицированы признаки язвы луковицы двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с H. pylori. Язвенная болезнь протекала на фоне дефицита МТ-иммунопозитивных клеток, гиперплазии эндокринных клеток, продуцирующих эндотелин, и высокой апоптозной активности эпителиоцитов желудка. Под влиянием проведенной эрадикационной терапии с мелатонином язва зарубцевалась через 2 недели после начала лечения. Через 6 недель от начала терапии H. рylori не определяется, показатели эндокринных клеток, секретирующих мелатонин и эндотелин, и индекс апоптоза достигли контрольных значений на фоне гармонизации типа отношения к болезни и нормализации показателей качества жизни. Все вышеизложенное дает возможность высказать мнение о высокой эффективности комбинированной терапии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки с мелатонином, под влиянием которой отмечается более быстрое исчезновение клинических симптомов заболевания, более быстрое заживление пептического дефекта и достижение изучаемых показателей диффузной нейроэндокринной системы желудка до группы сравнения.
Проведенные исследования свидетельствуют о наличии средней степени силы корреляционной связи между степенью обсемененности СОЖ H. pylori и исследуемыми показателями апудоцитов и Iапопт [54]. Так, степень обсемененности H. pylori слизистой оболочки антрального отдела желудка у больных с язвенной болезнью ассоциируется увеличением числа апудоцитов, иммунопозитивных к End-1 (r=0,66), увеличением Iапопт (r=0,620) и снижением численности клеток СОЖ, иммунопозитивных к мелатонину (r=-0,641). Можно предположить, что H. pylori, как правило, колонизируют СОЖ, не обладающую достаточными защитными свойствами. Так, гиперплазия и гиперфункция End-1-иммунопозитивных клеток может способствовать нарушению микроциркуляции в тканях желудка, а снижение численности МТ-иммунопозитивных клеток и повышение Iапопт – угнетению местного иммунитета.