Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль молекул межклеточной адгезии в патогенезе язвенного колита (обзор литературы) 13
1.1. Молекулы межклеточной адгезии - ICAM-1, ICAM-2, L-селектин в механизмах воспаления 13
1.2. Молекула межклеточной адгезии: ICAM-1 19
1.3. Молекула межклеточной адгезии: ICAM-2 20
1.4. Молекула межклеточной адгезии: L-селектин 22
1.5. ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин при язвенном колите 26
1.6. Новая стратегия в терапии воспалительных заболеваний кишечника
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика больных 36
ГЛАВА 3. Методы исследования 56
3.1. Получение биологических образцов для специального исследования 58
3.2. Методы исследования молекул адгезии в сыворотке крови
3.2.1. Определение в сыворотке крови ICAM-1 59
3.2.2. Определение в сыворотке крови ICAM-2 59
3.2.3. Определение в сыворотке крови L-селектин 60
3.3. Определение воспалительной активности в слизистой оболочке толстого кишечника
3.4. Статистический анализ полученных результатов 63
ГЛАВА 4. Показатели молекул межклеточной адгезии при язвенном колите (собственные данные) 65
4.1. Содержание молекул межклеточной адгезии ICAM-1,
ICAM-2, L-селектин в периферической крови больных язвенным колитом 65 75
4.2. Взаимосвязь между молекулами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин и уровнем воспалительной реакции в слизистой оболочке толстого кишечника у больных язвенным колитом
4.3. Содержание молекул межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в сыворотке крови больных язвенным колитом в динамике лечения 78
4.4. Влияние фармакологических препаратов на уровень ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в периферической крови и слизистой оболочке толстого кишечника 81
4.5. Прогнозирование клинического течения и эффективности терапии язвенного колита 91
Обсуждение 100
Выводы 110
Практические рекомендации 112
Список сокращений 113
Список литературы
- Молекула межклеточной адгезии: ICAM-2
- Методы исследования молекул адгезии в сыворотке крови
- Взаимосвязь между молекулами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин и уровнем воспалительной реакции в слизистой оболочке толстого кишечника у больных язвенным колитом
- Влияние фармакологических препаратов на уровень ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в периферической крови и слизистой оболочке толстого кишечника
Введение к работе
Актуальность проблемы. Язвенный колит (ЯК) представляет собой одну из наиболее серьзных и нерешнных проблем в современной гастроэнтерологии. Заболеваемость ЯК во всм мире возрастает с каждым годом (приблизительно в 6 раз за последние 40 лет), а пик заболеваемости приходится на молодой, работоспособный возраст – 20-30 лет, что обусловливает социальную значимость этой патологии (Белоусова Е.А., 2015; Халиф И.Л., 2015).
Постоянный интерес к язвенному колиту обусловлен прежде всего тем, что, несмотря на многолетнюю историю изучения, его этиология остатся неизвестной. Итоги последних научных достижения укрепили убеждение исследователей в том, что язвенный колит – многофакторное заболевание с генетической предрасположенностью и молекулярными нарушениями регуляции клеток иммунной системы – главных эффекторов воспалительной реакции в толстой кишке (Павленко В.В., 2016; Baumgart D., 2007; Viazis N., 2015).
Одним из приоритетных направлений в изучении патогенеза ЯК является уточнения роли молекул межклеточной адгезии в механизмах воспаления: суперсемейство иммуноглобулинов (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3), семейство интегринов, семейство селектинов (L-, P-, E-селектин), семейство кадгери-нов. Показано, что молекулы адгезии играют значительную роль в развитии воспаления при язвенном колите, в частности, они обеспечивают миграцию лейкоцитов из сосудистого русла в очаг воспаления, потенцируя воспалительную инфильтрацию слизистой оболочки толстой кишки, причем L-селектин играет ведущую роль в осуществлении быстрых и эффективных иммунных ответов, опосредуя взаимодействия лейкоцитов с сосудистым эндотелием. Этот процесс приводит к разрушению микросреды и, в конечном счете, к развитию воспалительно-деструктивного процесса, наблюдаемого в толстой кишке в фазе активного ЯК: крипт-абсцессы, нейтрофильная инфильтрация слизистой, эрозии, изъязвления (Vainer V. et al., 2005, Hamaguchi Y., Nishizawa Y., 2012).
Степень разработанности темы. Недостаточная эффективность суще
ствующей базисной терапии язвенного колита обусловила необходимость
создания новой таргетной стратегии в лечении этой патологии. Высокосе-
лективная блокада молекул, участвующих в привлечении лейкоцитов в очаг воспаления, включая суперсемейство иммуноглобулинов, интегринов и се-лектинов, представляется одной из наиболее перспективных альтернатив существующим методам лечения ЯК (Colombe J.F., 2015). При этом существующие в настоящее время клинические и лабораторные критерии оценки эффективности фармакотерапии ЯК не всегда приемлемы в разных клинических ситуациях, а в отношении прогноза заболевания являются весьма малоинформативными (Секачва М.И., 2005; Rutgeerts P.J. et al., 2015). В связи с этим изучения содержания ICAM-1, ICAM-2, L-селектина в плазме крови и
СОТК во взаимосвязи с уровнем воспалительной реакции в слизистой оболочке толстой кишки в разные фазы заболевания и в динамике лечения, представляет определнный теоретический и практический интерес.
Цель исследования: определить клинико-патогенетическое и прогностическое значение адгезивных молекул ICAM-1, ICAM-2, sL-селектина при язвенном колите.
Задачи исследования:
1. Проанализировать продукцию ICAM-1, ICAM-2, sL-селектина в перифери
ческой крови больных язвенным колитом в период обострения заболевания.
2. Установить взаимосвязь между содержанием ICAM-1, ICAM-2, sL-
селектина в плазме крови больных язвенным колитом – с одной стороны, и,
длительностью заболевания, стадией, клиническими формами заболевания,
полом, возрастом, плотностью воспалительного инфильтрата в слизистой
оболочке толстой кишки, с другой.
-
Проследить динамику продукции ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в плазме крови в ходе лечения больных язвенного колита в сопоставлении с его результатами.
-
Разработать математическую модель прогностических критериев течения язвенного колита и эффективности проводимой терапии на основе данных о продукции ICAM-1, ICAM-2, sL-селектина в периферической крови.
Научная новизна работы. Впервые на достаточном клиническом материале проведено комплексное изучение особенностей содержания молекул клеточной адгезии (ICAM-1, ICAM-2, sL-селектин) в периферической крови у пациентов с различными клиническими формами язвенного колита.
Установлено повышение продукции ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в сыворотке крови в период острых клинических проявлений ЯК. Впервые установлена зависимость продукции ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в периферической крови от тяжести течения, распространенности деструктивного процесса в толстой кишке, уровня воспалительной реакции в СОТК, наличия системных внекишечных проявлений, индекса клинической и эндоскопической активности ЯК. Показано, что при тяжелом течении ЯК с тотальным поражением толстой кишки и максимальной степенью активности воспалительно-деструктивного процесса, с системными внекишечными проявлениями, острым характером течения, наблюдались предельно высокие значения сывороточных форм ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина. Не установлено зависимости уровней изучаемых показателей от половой принадлежности, возраста больных и длительности заболевания ЯК.
Установлена прямая зависимость между показателями индекса клинической активности (DAI), плотностью воспалительного инфильтрата в СОТК и содержанием ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в сыворотке крови.
Впервые определено содержание ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в сыворотке крови у больных ЯК в динамике стационарного этапа лечения и в течение 12 месяцев наблюдения за больными. Впервые показано, что стойкой клинической ремиссии ЯК свойственна нормализация продукции молекул клеточной адгезии в периферической крови. Проведена оценка влияния основных групп препаратов на динамику содержания молекул адгезии в периферической крови. Установлено, что ингибитор ФНО- - инфликсимаб обладает наибольшим контролем в отношении избыточной продукции ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина. Впервые, с использованием многофакторной логистической регрессии и ROC-анализа определена вероятность эффективности предстоящего лечения и формирования стойкой клинико-эндоскопической ремиссии больных с ЯК.
Практическая значимость работы. Комплексный подход к изучению роли клеточных молекул адгезии при язвенном колите дает возможность расширить теоретические представления о патофизиологических механизмах формирования различных клинических форм. Результаты диссертационного исследования имеют существенное значение для клиники внутренних болезней и практического здравоохранения в целом. Установленные взаимосвязи ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в периферической крови больных ЯК с фазой болезни, локализацией воспалительного процесса, клинической активностью, характером течения заболевания, системными проявлениями могут использоваться в качестве дополнительных клинико-диагностических тестов при язвенном колите. Изучена динамика продукции молекул адгезии у больных ЯК на фоне базисной терапии через 6 и 48 недель наблюдения. Показано, что в случае положительного ответа на проводимую терапию и формирования стойкой клинико-эндоскопической ремиссии содержание изучаемых молекул адгезии в периферической крови нормализуется. В случае отсутствия признаков формирования клинической ремиссии, но при положительной динамике течения болезни отмечена лишь тенденция к снижению содержания молекул адгезии в периферической крови. Использование биологического препарата инфликсимаба у больных с тяжелыми формами ЯК способствует снижению уровней изучаемых молекул адгезии в крови уже в начальный период формирования клинической ремиссии ЯК. Установлено, что сохранению стойкой клинико-эндоскопической ремиссии ЯК в течение года свойственно сохранение нормальных показателей ICAM-1, ICAM-1, sL-селектина в периферической крови. На основании полученных результатов исследования разработаны дополнительные прогностические критерии возможного ответа на терапию и формирования клинической ремиссии у больных ЯК.
Методология и методы диссертационного исследования. Научная методология исследования основывается на системном подходе и комплексном рассмотрении проблемы патогенеза, диагностики и лечения язвенного коли-
та. Методологической базой послужили труды зарубежных и отечественных авторов по вопросам, касающимся возможной роли адгезивных молекул в механизмах формирования и течения язвенного колита.
Диссертационная работа представляет собой прикладное научное исследование, решающее задачу оптимизации лечебно-диагностических мероприятий при язвенном колите, путем разработки неинвазивных методов диагностики активности воспалительного процесса и дополнительных прогностических критериев возможного ответа на терапию и формирования клинической ремиссии.
Исследование проводилось на базе гастроэнтерологических отделений Городской клинической больницы №2 г. Ставрополя и Ставропольской краевой клинической больницы, а также на кафедре пропедевтики внутренних болезней Ставропольского государственного медицинского университета.
Объектом исследования явились 110 пациентов с различными клиническими формами язвенного колита в динамике лечения. Программа сбора материала включала в себя подписание информированного согласия, опрос пациентов, изучение и анализ медицинской документации, результатов лабораторных и инструментальных методов исследования, анализ и интерпретацию данных с целью выявления имеющихся закономерностей. Специальные методы исследования: определение в сыворотке крови молекул межклеточной адгезии методом иммуноферментного анализа и морфометрическое изучение биопсийного материала для изучения воспалительных процессов в слизистой оболочке толстой кишки.
С целью поиска новых возможностей разработки диагностических и прогностических критериев течения и эффективности лечения язвенного колита была построена математическая модель с использованием метода многофакторной логистической регрессии и ROC-анализа.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
высокое содержание ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в периферической крови в активной стадии ЯК;
зависимость уровня ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в периферической крови от пола, возраста пациентов, возраста начала заболевания, активности воспалительного процесса, локализации, тяжести, системных проявлений и характера течения ЯК;
наличие особенностей продукции ICAM-1, ICAM-2 и sL-селектина в сыворотке крови в динамике лечения ЯК в зависимости от результатов лечения различными группами базисных препаратов;
возможность использования показателей исследуемых молекул адгезии в сыворотке крови с целью прогнозирования характера течения и эффективности лечения ЯК.
Степень достоверности. Достоверность исследования подтверждается достаточным объемом и корректным формированием изучаемых выборок, высокой информативностью современных методов исследования, адекватностью методов математической обработки данных поставленным задачам. Для статистической обработки полученных результатов исследования использовались компьютерные программы «Microsoft Office Exсel 2007» с встроенной подпрограммой «Attestat 10.5.1», программа Statistica 6.0 и SPSS 21.0. Достоверными считали различия при значениях р<0,05. Сформулированные выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из результатов исследования.
Практическое использование полученных результатов. Результаты исследования внедрены и используются в практике работы гастроэнтерологического отделения Городской клинической больницы №2 г. Ставрополя и Ставропольской краевой клинической больницы, в учебном процессе кафедры пропедевтики внутренних болезней, кафедр факультетской и госпитальной терапии Ставропольского государственного медицинского университета.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работах, в том числе 6 работ в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных работ.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 8-й Всероссийской гастроэнтерологической неделе Юга России (Ессентуки, 2009), на 14-й, 15-й, 17-й, 18-й, 20-й Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2009, 2010, 2012, 2013, 2015); на международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, 2010); на 13-м, 14-м Международных Славяно-Балтийских научных форумах «Санкт-Петербург-Гастро-2011, 2012»; на II Съезде терапевтов Северо-Кавказского Федерального округа (Ставрополь, 2014); на XX Всемирном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, 2014); на VII Латвийском международном конгресса гастроэнтерологов (Рига, 2015), на совместном заседании кафедр пропедевтики внутренних болезней, госпитальной терапии, терапии с курсом диетологии Ставропольского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 странице компьютерного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 29 рисунками и 3 клиническими примерами, состоит из обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 29 отечественных и 146 иностранных литературных источников.
Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом научных исследований Ставропольского государственного медицинского университета. Номер государственной регистрации 01200801277.
Молекула межклеточной адгезии: ICAM-2
Воспаление – это реакция организма, возникающая в ответ на внедрение инфекционного агента, потенциальных антигенов, таких как эндотоксины, вирусы, компонентов пищи, протеогликаны бактериальной оболочки и протеины или физическое повреждение тканей [21, 72, 96]. К основным проявлениям воспаления относятся: повышение кровенаполнения капилляров и проницаемости для сывороточных молекул, а также усиленная миграция лейкоцитов в направлении воспалительного очага через эндотелий сосудов [21,128, 139]. Помимо усиления клеточной миграции, воспаление вызывает приток растворимых молекул различных классов и хаметоксических агентов из плазмы крови в очаг воспаления.
В последние годы при иммуновоспалительных заболеваниях вс больше внимания уделяется молекулам межклеточной адгезии (МКА). Молекулы межклеточной адгезии - это связанные с плазматической мембраной белки, обеспечивающие механическое взаимодействие клеток друг с другом. Обычно это молекулы -пронизывающие мембрану и присоеденннные к цитоскелету. С помощью молекул адгезии клетки могут передвигаться по внеклеточному мат-риксу, или подтягиваться к другим клеткам. [93, 128, 140, 175].
В зарубежных исследованиях показано, что многие межклеточные взаимодействия, играющие ключевую роль в эмбриогенезе, в поддержании местного гомеостаза и в развитии патологических процессов, осуществляются с помощью молекул клеточной адгезии [20, 85, 108, 100]. Повышение адгезии имеет большое значение в патогенезе дисфункции эндотелия при развитии воспаления и других патологических состояниях. Доказана роль определнных молекул межклеточной адгезии при сахарном диабете, атеросклерозе, при ревматоидном артрите, васкулопатии [13, 14, 121, 112, 167].
Под влиянием молекул межклеточной адгезии происходит миграция лейкоцитов в очаг повреждения из сосудистого русла, что приводит к высвобождению новых медиаторов воспаления, усиливая воспалительную инфильтрацию слизистой оболочки. Накопление и рециркуляция лейкоцитов в очаге воспаления зависят от сложного взаимодействия между эндотелиальными и лейкоцитарными молекулами межклеточной адгезии, поверхностная экспрессия которых регулируется цитокинами и воспалительными медиаторами [118,128, 93, 110].
В физиологическом состоянии анти - и протромботические, анти- и про-воспалительные реакции сбалансированы и взаимосвязаны. Эндотелиальные клетки играют значительную роль в этапах развития острого и хронического воспаления, в механизмах начальной вазодилатации, увеличение сосудистой проницаемости, прилипание, трансмиграции и активация лейкоцитов [15, 16,127]. Под влиянием циркулирующих в крови провоспалительных медиаторов и цитокинов или при физическом повреждении сосудов происходит активация ЭК и смещение баланса в сторону воспалительно-деструктивных изменений. [13, 91]. Активация эндотелия ведет к синтезу и экспрессии молекул адгезии, с помощью которых ЭК взаимодействуюя с клетками крови способствует миграции лейкоцитов в очаг воспаления [100, 109, 108, 117].
Миграция клеток - это сложный процесс, в котором на разных стадиях принимают участие несколько классов молекул межклеточной адгезии. В физиологических условиях эндотелиальная клетка не экспрессирует молекулы межклеточной адгезии или экспрессирует в малых количествах. Увеличение концентрации молекул адгезии на поверхности эндотелиальных клеток возникает при действии различных повреждающих факторов [123, 148, 165]. Молекулы межклеточной адгезии обеспечивают трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов из сосудистого русла в воспалительный очаг, запускают механизм усиления лейкоцитарной адгезии и продвижение лейкоцитов в ткань. Бо 15 лее того, некоторыми исследователями показано, что ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин функционируя совместно, обеспечивают оптимальное лейкоцитарно-эндотелиальное ваимодействие и в синергизме опосредуют миграцию лейкоцитов в зону воспаления [80, 149].
Миграция лейкоцитов из кровотока происходит только через стенки высоких эндотелиальных венул (ВЭВ). Именно через стенки клеток высоких эн-дотелиальных венул выходит из кровотока до 25% лейкоцитов, тогда как через обычный эндотелий венул, проникает лишь малая часть циркулирующих в крови лейкоцитов. Однако, некоторыми исследователями было показано, чрезвычайно важная роль этой слабой миграции, так как позволяет лимфоцитам осуществлять « иммунный надзор» за всеми тканями организма, а при развитии воспалительного процесса она многократно усиливается. На высоком эндотелии венул экспрессированы молекулы межклеточной адгезии, хемокины, а также расположены лиганды к селектинам [117, 127, 78, 89, 114].
Таким образом, венулы с высоким эндотелием выполняют важную роль в рециркуляции лимфоцитов. Как правило, на миграцию лейкоцитов через эндотелий влияют: 1. Величина поверхностного заряда взаимодействующих клеток; 2. Сила гемодинамического смыва в сосудистом русле; 3. Экспрессия комплементарного набора молекул адгезии на поверхности, как лейкоцитов, так и эндотелиальных клеток [21, 117, 70].
Таким образом, лейкоциты мигрируют из кровяного русла через стенку именно эндотелиальных венул, где поверхностный заряд эндотелиальных клеток низкий, гемодинамический смыв незначительный, а молекулы межклеточной адгезии экспрессируются избирательно [70, 169]. Циркулирующие активированные лейкоциты узнают эндотелий сосудистого русла, останавливаются у стенки сосуда, мигрирует между клетками эндотелиальной выстилки, и переходят в экстраваскулярное пространство в течение приблизительно 10 мин [57, 21, 77].
Методы исследования молекул адгезии в сыворотке крови
Как следует из рисунка, наиболее часто стречалось рецидивирующее течение заболевания (в 50,1% случаев). Менее часто встречалась острая форма заболевания 27,2% случаев и непрерывная форма ЯК (21,8%).
По протяжнности воспалительно-деструктивного процесса в толстой кишке больные разделились на 3 группы: 38 (28,1%) больных с дистальным колитом с вовлечением прямой и сигмовидной кишки (проктит, проктосигмои-дит), 47 (45,4%) больных с левосторонним колитом с поражением левых отделов толстого кишечника до середины поперечно-ободочного отдела, и 25 (32,7%) больных с тотальным поражением толстого кишечника (рис. 2.5). 32,7 (субтотальное) Левостороннее Дистальное (проктит, проктосигмоидит) 45,4%
Анализ данных приведнных на рис. 2.5 показывает, что воспалительно-деструктивный процесс локализовался во всех отделах толстого кишечника, с поражением преимущественно его левых отделов 45,4% случаев, дистальный колит выявлялся в 21,8% случаев, тотальное поражение регистрировалась у 32,7% больных. В фазе стихания обострения, всем больным выполнялось рентгенологическое исследование толстой кишки с бариевой клизмой, которое в совокупности с результатами эндоскопического исследования позволяло верифицировать диагноз язвенный колит, провести диференциальную диагностику с другими воспалительными заболеваниями кишечника. При тяжлых формах ЯК приоритет отдавался рентгенологическому методу, так как эндоскопия при тяжлых формах (острое течение, риск перфорации кишки) была противопоказана.
При ирригоскопии обычно определялось равномерное сужение просвета кишки на поражнном участке, отсутствие или неравномерность гаустр, при наличии множественных язв контур кишки имел зубчатый характер, при наличии глубоких язв выявлялось депо бария с образованием двойного контура кишки. После опорожнения толстой кишки выявлялся изменнный рельеф слизистой оболочки: складки неправильной формы, располагаются продольно, видны псевдополипы и пятна бария на месте язв. С целью определения активности воспалительного процесса в толстой кишке (индекс Мейо) [175, 224], всем больным выполнялось эндоскопическое исследование (ректороманоскопия, сигмоскопия, колоноскопия), с последующим гистологическом изучении ректобиоптатов.
Эндоскопическая картина в ткани толстой кишки характеризовалась следующими показателями: выраженностью складок и наличием грануляций в СОТК, чткость сосудистого рисунка, наличием контактной или спонтанной кровоточивости, наличием наложений (слизь, гной, экссудат, фибрин), наличием эрозий и/или язв. При морфологическом исследовании биоптатов СОТК определялась картина неспецифического воспаления разной степени выраженности. Пациенты с индексом Мейо от 6 баллов и более выявлялся активный ЯК средней и тяжлой степени.
По эндоскопической картине выделяют три степени активности воспаления в кишке при ЯК : минимальная, умеренная, и выраженная (табл. 2.1).
Норма или не активное заболевания Гиперемия, смазанный сосудистый рисунок. Контактная ранимость отсутствует. Отк, выраженная гиперемия, отсутствие сосудистого рисунка, контактная ранимость, наличие эрозий. Спонтанная кровоточивость, и иъязвления множественных сливающихся эрозий и язв При 0-ой активности заболевания гистологически обнаруживаеться нормальная слизистая толстой кишки, или минимальные изменения, характеризующие заболевание, находящиеся в стадии ремиссии. 1-я степени активности характеризуется наличием отка, лгкой зернистости и гиперемией слизистой, смазанный сосудистый рисунок, лгкой контактной кровоточивостью, мелкототечными геморрагиями.
При гистологическом исследовании биоптатов СОТК воспалительный инфильтрат собственной пластинки слизистой состоял из плазматических клеток, лимфоцитов, лейкоцитов, и эозинофилов. Структура железистых и бокаловидных клеток была сохранена, с некоторым уменьшением их количества в криптах.
При 2-й степени активности процесса обнаруживался выраженный эксуда-тивный отк и гиперемия слизистой толстого кишечника, контактной кровоточивостью отсутствием сосудистого рисунка, множественными сливными эрозиями и язвами, фибринозным налтом на стенках, кровянистая или гноевидная слизь. В микропрепаратах СОТК определялось клетки воспалительного инфильтрата, которые кроме локализации в собственной пластинке, располога-лись и межэпителиально, внутри пласта эпителия. При этом обнаруживаются повреждения клеток эпителия, появление вакуолей в их цитоплазме, вплоть до баллонной дистрофии, гибель и десквамация эпителия с образованием микроэрозий. В капиллярах СОТК отмечались полнокровия сосудов и кровоизлияний в строму, в стенках мелких вен обнаруживались тромбы. Происходили изменения и в железистом аппарате такие, как перестройка желз, их расширение, нарушение архитектоники и гиперплазия либеркюновых крипт, местами встречались крипты-абсцессы.
3-я степень активности характеризуеться, на фоне описанных выше изменений слизистой наличием множественных сливных язв и эрозий различной глубины и формы. Поверхность слизистой оболочки кишки сплошь покрыта фибринозно-гнойным налетом, после удаления, которого обнаруживается зернистая диффузно кровоточащая поверхность слизистой толстой кишки. В про 43 свете кишки кровянисто-гнойное содержимое. Часто обнаруживались псевдополипы.
При гистологическом исследовании в микропрепаратах выявлялись геморрагии, расширение капилляров, некроз эпителия. Скопление клеточного воспалительного инфильтрата межэпителиально в стенках крипт, с последующим выходом их в просвет крипт в результате лейкопедеза или частичной деструкции эпителия, ведет к образованию, так называемых крипт-абсцессов проникающие в подслизистый слой. Наблюдалось уменьшение бокаловидных клеток или их отсутствие, выраженная лимфо-плазматическая инфильтрация собственной пластинки слизистой толстой кишки.
В фазе ремиссии заболевания, эндоскопическая картина характеризовалась в зависимости от глубины поражения: для поверхностного поражения, ограничивающимся собственной пластинкой слизистой, без нарушения аппарата крипт, было характерно уменьшения кровоточивости, гиперсекрецией эпителия, эпителизация эрозий, частичным восстановлением сосудистого рисунка, развитие склероза стенки кишки и атрофии СОТК. При глубоком поражении слизистой толстой кишки определялось пышная грануляционная ткань и руб-цовое втяжение на месте язв. Морфологическими критериями начала ремиссии были: утолщение СОТК, сужение просвета кишки и изчезновение гаустр. В результате деструктивных и репаративных изменений, изменяеться рельеф слизистой с появлением псевдополипов. Чаще всего псевдополипы встречались на месте бывших язв. Более чтко выявляется соединительная ткань, гиперсекреция слизи эпителием, определялось уменьшения количества крипт, которые были деформированы, ветвисты и образовывали кисты. Во всех фазах заболевания, обращало на себя внимание сохранение высокой способности эпителия к регенерации, к их признакам относиться появление выростов эпителия внутри желез («железа в железе») и сосочковые разрастания эпителия.
Взаимосвязь между молекулами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин и уровнем воспалительной реакции в слизистой оболочке толстого кишечника у больных язвенным колитом
В некоторых случаях с целью дифференциальной диагностики внекишеч-ных проявления ЯК, и подбора терапии, больных консультировали специалисты смежных специальностей, такие как эндокринолог, ревматолог, дерматолог, а также психотерапевт.
Эндоскопическое исследование толстой кишки являеться основным методом диагностики язвенного колита. Наиболее характерными признаками являються: равномерное сужение просвета кишки на поражнном участке, непрерывное воспаление с чткой границей, отк, зубчатый контур кишки, при наличии множественных язв, и изъязвления слизистой оболочки, наличие воспалительных полипов, утолщение кишечной стенки, отсутствие гаустр, иногда – стриктуры, преимущественно в дистальном отделе. Контактная ранимость (выделение крови при контакте с эндоскопом), наилучшим образом отражает эндоскопическую активность ЯК. При стойком сужении просвета толстой кишки, обязательным являлось исключение колоректального рака.
В случае тяжлого состояние больного, когда возникала угроза токсической дилатации, кишечного кровотечения, перфорации кишки с развитием перитонита, эндоскопическое исследование ограничивалось ректороманоскопией. Переход от острой фазы к затиханию обострения определяется по уменьшению общих симптомов заболевания, в этой фазе болезни, проводили рентгенологическое исследование кишечника с введением контрастной бариевой клизмы. В некоторых клинических ситуациях, с целью подтверждения диагноза язвенного колита проводили биопсию слизистой оболочки толстой кишки и морфологическое исследование биоптатов СОТК, что позволяло дифференцировать данную патологию вначале с заболеваниями не относящиеся к ВЗК, это такие поражения толстой кишки как, токсические, медикаментозные, радиационные, а также с другими формами колита (псевдомембранозный, лимфоци-тарный и др.), с дивертикулитами. На следущем этапе верификацию диагноза проводили с заболеваниями, которые относяться к группе ВЗК, в частности с болезнью Крона. Биопсия слизистой толстой кишки была необходима так же для выявления дисплазии эпителия СОТК, являющейся маркром возникновения рака толстого кишечника [38].
Для реализации цели и задачи исследования, применялись специальные методики исследования больных с язвенным колитом: определения в сыворотке крови молекул клеточной адгезии (ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин) методом иммуноферментного анализа и морфометрическое изучение биопсийного материала для изучения воспалительных процессов в СОТК.
Забор крови у всех больных и у лиц контрольной группы производили из кубитальной вены, натощак в утренние часы в первые дни поступления. В пробирку собирали кровь (5 мл), центрифугировали в течение 20 минут для получения сыворотки. Полученную сыворотку хранили в морозильной камере при температуре -40 С. Образцы крови размораживали непосредственно перед исследованием.
Повторный забор крови, для определения молекул клеточной адгезии в динамике лечения был проведн через 6 и 48 недель. 3.2. Методы исследования молекул межклеточной адгезии в сыворотке крови
Содержание ICAM-1 в сыворотке крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Bender MedSystems», Австрия) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы плазмы, стандарты и контроль, разведнные в 10 раз, вносились в лунки планшета, сорбированные моноклональными антителами специфичными к молекуле ICAM-1. Вслед за этим добавляли коньюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена, который связывает молекулы адгезии и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубации и промывки из ячеек удаляли не связавшийся ферментный коньюгат, и добавляли субстратный раствор тетраметилбензидина, который взаимодействует с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора. Интенсивность окраски раствора измеряли на автоматическом фотометре при длине волны 450 нм.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые уровни молекул адгезии в образцах плазмы, полученный результат умножали на 10. Минимально определяемая концентрация ICAM-1 была равной 0,75 нг/мл.
В контрольной группе содержание ICAM-1 составило 213,6±10,7 нг/мл Содержание ICAM-2 в сыворотке крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Bender MedSystems», Австрия) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы плазмы, стандарты и контроль, разведнные в 20 раз, вносились в лунки планшета, сорбированные моноклональными антителами спецефичны-ми к молекуле ICAM-2. Вслед за этим добавляли коньюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена, который связывает молекулы адгезии и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубации и промывки из ячеек удалили несвязавшийся ферментный коньюгат и добавили субстратный раствор тетраметилбензидина, который взаимодействует с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора. Интенсивность окраски раствора измеряли на автоматическом фотометре при длине волны 450 нм.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые уровни молекул адгезии в образцах плазмы, полученный результат умножали на 20. Минимально определяемая концентрация ICAM-2 была равной 0,019 Е/мл.
В контрольной группе содержание ICAM-2 – составило 195,8±2,6 Е/мл. Содержание L-cелектина в сыворотке крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Bender MedSystems», Австрия) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы плазмы, стандарты и контроль, разведнные в 200 раз вносились в лунки планшета, сорбированные моноклональными антителами спецефичны-ми к молекуле L-селектин. Вслед за этим добавляли коньюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена, который связывает молекулы адгезии, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.
После инкубации и промывки из ячеек удалили несвязавшийся ферментный коньюгат и добавили субстратный раствор тетраметилбензидина, который взаимодействует с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора. Интенсивность окраски раствора измеряли на автоматическом фотометре при длине волны 450 нм.
Влияние фармакологических препаратов на уровень ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в периферической крови и слизистой оболочке толстого кишечника
В то же время, в группе больных с тяжлой формой ЯК и c изначально высокими показателями ICAM-1, ICAM-2 и L-селектина в сыворотке крови, рефрактерных к традиционной базисной терапии после трехкратного внутривенного введения инфликсимаба (Ремикейда) отмечалась нормализация изучаемых молекул адгезии (до контрольных значений), сочетавшаяся с началом формирования клинико-эндоскопической ремиссии.
Полученные данные иллюстрирует следующее клиническое наблюдение: Пациент Л., 52 г., находился на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении Ставропольского краевого клинического центра организации специализированных видов помощи (ГБУЗ СК СККЦ СВМП) с 23.03.12 по 03.04.2012 г.
Диагноз: Язвенный колит, дистальный, хроническое рецидивирующее течение, лгкая форма, 1-й степени активности, стадия обострения.
Жалобы на общую слабость, частый, до 3-4 раз в сутки стул с примесью слизи, режущую боль в животе во время акта дефекации, быструю утомляемость, потеря аппетита и веса.
Считает себя больным с 2004года, когда участился стул до 3-4 раз в сутки, с прожилками крови и примесью слизи. Обратился в поликлинику по месту жительства, после чего был направлен в гастроэнтерологическое отделение ГБУЗ СК СККЦ СВМП. Назначен сульфасалазин 3 г/сут., свечи Салофальк. Последнее обострение в августе 2011 года.
Объективно: Обшее состояние ближе к удовлетворительному. Кожные покровы бледно-розовые. Нормостеник, рост 162 см., вес 56 кг, пониженного питания. Над легкими дыхание везикелярное, хрипы не выслушиваються. Тоны сердца приглушены, ритм правильный. АД 120/80 мм рт. ст., ЧСС 90 уд./мин. Живот обычной формы, пальпируеться плотная, болезненная, сигмовидная кишка ограниченная в подвижности. Печень и селезенка не пальпируються. Общий анализ крови: эр .- 3,7x1012/л, Нв 108 г/л; лейкоциты - 8,7x109/л; н. - 3%; сегменты - 57%; мон. - 4%; лимф. - 34%; СОЭ - 13 мм/ч. Общий анализ мочи без видимой патологии.
Биохимическое исследование: общий белок - 60 г/л; альбумины - 37%; глобулины: а-17%; /3-12%; у-26%; фибриноген- 7,0 г/л, билирубин общ. - 13,8 мкмоль/л; сывороточное железо- 5,4 мкмоль/л, сиаловые к-ты- 172 ед/л, СРБ-18 мг/л, глюкоза 4,2 ммоль/л;
УЗИ органов брюшной полости: печень правая доля - 156 мм, левая доля-83 мм, эхогенность умеренно повышена, ткань диффузно неоднородна. Воротная вена не увеличена 11 мм; селезеночная вена - 5 мм; холедох - 4 мм. Желчный пузырь грушевидной формы размерами 72x23 мм, стенки повышенной эхогенности, утолщены 3,5 см, уплотнены; Поджелудочная железаэхогенность повышена, дифузно неоднородная, размерами 331825 мм, контуры неровные. Селезенка структура однородная размерами 120x53 мм, обычной эхогенности.
Копрограмма: консистенция-кашецеобразная, слизь в виде комков, лейкоциты 6-7 в поле зрения, дрожжевые клетки, яйца глистов, патогеные простейшие, - отрицательные. Присутсвует непереваренная клечтатка, мышечные волокна. Кровь отсутствует. Иммунограмма: снижение NK- клеток на 33%, снижение СD8 на 27%; увеличение lg G и ЦИК; увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов; спонтанный НСТ - тест - 23,5%. Ирригоскопия: Язвенный колит, дистальный
Колоноскопия: в проктосигмоидном отделе толстой кишки слизистая с единичными геморрагическими участками, контактная кровоточивость умеренная. Сосудистый рисунок умеренно смазан. В просвете кишки значительное количество комковидной слизи. Остальные отделы кишки без видимой патологии. Заключение: Дистальный язвенный колит , 1-й степени активности.
Гистология: фрагменты слизистой оболочки толстой кишки с обрывками собственной мышечной пластинки. Строма с нейтрофильной, лимфоци-тарной воспалительной инфильтрацией. Умеренное полнокровие сосудов. Количество бокаловидных клеток умеренно снижено. Структура желз не изменена.
Проведено лечение: Салофальк 3 г/сутки, свечи Салофальк 1 г/сутки, трихопол, креон. Результаты изучения показателей молекул адгезии у больного: 1САМ-1 - 488нг/мл, 1САМ-2 - 385 Е/мл, sL-слектин - 1370 нг/мл.
Наблюдение в динамике: на фоне проведенного лечения состояние с положительной динамикой , стул нормализовался, оформленный, 1 раз в 2 дня, без крови. Сигмоскопия в динамике лечения (через 6 недель): На всем протяжении слизистая бледно-розовая, сосудистый рисунок умеренно обеднен, умеренная кровоточивость. Закл.: Дистальный язвенный колит акт. 0 (ремиссия). Содержание 1САМ-1, 1САМ-2 и sL-слектин в динамике лечения: 380 нг/мл, 275 Е/мл и 1268 нг/мл соответственно. Данное наблюдение демонстрирует умеренное повышение молекул адгезии в периферической крови, у больного язвенным колитом с минимальными клиническими и гистологическими проявлениями в толстом кишечнике и нормализацию клинико-лабороторных показателей при формировании клинико-эндоскопической ремиссии. Больной продолжает лечение ректальными формами препаратов 5 АСК.
Больная В. 51 год, находилась на лечении в гастроэнтерологическом отделении Ставропольского краевого клинического центра организации специализированных видов помощи с 05.06.10 по 22.0б.2010г.
Диагноз: Неспецифический язвенный колит, рецидивирующее течение, тяж-лая форма с поражением прямого и сигмовидного отдела толстой кишки, активность 3-й степени, обострение