Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Клинические особенности течения аутоиммунных заболеваний печени 9
1.2. Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени 16
1.3. Роль цитокинов при аутоиммунных заболеваниях печени 24
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1. Общая клиническая характеристика больных 30
2.2. Общая характеристика методов исследования 32
2.3. Статистическая обработка материалов исследования 38
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 39
3.1. Клинические особенности аутоиммунных заболеваний печени 39
3.2. Изучение кишечной проницаемости у пациентов с аутоиммунными заболеваниями печени 3.2.1. Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени 43
3.2.2. Особенности кишечной проницаемости у пациентов 50
с аутоиммунным гепатитом 50
3.2.3. Исследование кишечной проницаемости у пациентов с синдромом перекреста 55
3.2.4. Особенности кишечной проницаемости у пациентов с первичным билиарным циррозом 59
3.3. Оценка уровня цитокинов у пациентов с аутоиммунными заболеваниями печени 62
3.3.1. Изменения цитокинового профиля у пациентов с аутоиммунным гепатитом 69
3.3.2. Состояние цитокинов у пациентов с синдромом перекреста
3.3.3. Оценка уровня цитокинов у пациентов с первичным билиарным циррозом 77
3.3.4. Связь клинико – лабораторных показателей при аутоиммунных заболеваниях печени и цитокинового профиля 82
3.4. Связь между кишечной проницаемостью и уровнями цитокинов при аутоиммунных заболеваниях печени 85
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 87
Выводы 99
Практические рекомендации 101
Список сокращений 102
Список использованной литературы 103
Список иллюстративного материала 118
- Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени
- Общая характеристика методов исследования
- Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени
- Связь клинико – лабораторных показателей при аутоиммунных заболеваниях печени и цитокинового профиля
Введение к работе
Актуальность проблемы. В структуре хронических заболеваний печени аутоиммунные заболевания печени (АЗП) устойчиво занимают одно из ведущих мест. Этиология вирусного, алкогольного, лекарственного поражения печени достаточно ясна. Однако, причины возникновения, особенности клинического течения и факторы прогрессирования АЗП в настоящее время углубленно изучаются.
Известна гетерогенность клинических проявлений аутоиммунного гепатита (АИГ), первичного билиарного цирроза (ПБЦ), синдром перекреста (сочетания двух аутоиммунных заболеваний печени у одного пациента) и прогрессирования хронических поражений печени аутоиммунного генеза, что приводит к их поздней диагностике.
Активно изучается вопрос о пусковых механизмах развития АЗП. Важная роль отводится внешним факторам, которые у генетически предрасположенных лиц вызывают прогрессирующие воспалительно-некротические изменения печени и нарушения ее функции – печеночной недостаточности [Ивашкин В.Т. и др.,2012, Широкова Е.Н. и др., 2012, Czaja A.J., 2016].
Известна тесная взаимосвязь между печенью и кишечником, которая влияет на развитие и прогрессирование паренхиматозных заболеваний печени. Rui Lin и соавторы (2015) предположили, что изменение кишечного барьера и нарушение микробиома, могут быть вовлечены в патогенез АИГ и других АЗП за счет бактериальной транслокации, эндотоксемии портальной системы и увеличения экспозиции бактериальных продуктов из кишечника в печень.
У пациентов с хроническими паренхиматозными заболеваниями печени, в том числе и на стадии цирроза печени (ЦП), описаны изменения плотных контактов клеток слизистой кишечника, увеличение парацеллюлярной проницаемости, выброс провоспалительных белков, что приводит к активации иммунной системы, вызывая нарастание воспалительного процесса, тем самым усиливая повреждение тканей [ et al., 2016]. Состояние цитокинового звена на хроническое аутоиммунное воспаление печени мало
изучено. Известно, что дисфункция плотных контактов может возникать и при воздействии цитокинов (ЦК), что приводит к активации иммунной системы и воспалительному процессу в тканях и обсуждается как пусковой фактор в развитии ряда кишечных и системных заболеваний [Baier J.L., et al., 2014].
Таким образом, можно предположить, что изменение функции кишечного барьера может быть частью инициации аутоиммунной атаки при АЗП и актуальным представляется изучение особенностей течения АЗП в зависимости от изменения кишечного барьера и цитокинового статуса.
Цель работы: Выявить связь клинических особенностей аутоиммунных заболеваний печени с состоянием кишечной проницаемости и цитокиновым профилем.
Задачи исследования.
-
Оценить в сравнительном аспекте клинические особенности аутоиммунных заболеваний печени – аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, синдром перекреста.
-
Определить проницаемость кишечника «тройным сахарным тестом» у пациентов с аутоиммунными заболеваниями печени.
-
Изучить уровень цитокинов у пациентов с различными клиническими особенностями течения аутоиммунных заболеваний печени.
-
Изучить корреляционную связь между клиническим течением аутоиммунных заболеваний печени с кишечной проницаемостью и цитокиновым статусом.
Научная новизна. Впервые при АЗП было проведено комплексное изучение степени выраженности синдрома астении и выявлено, что по опроснику «Шкала усталости» изменения носили умеренный характер (45,4±25,2), по «Опроснику когнитивных нарушений» – слабовыраженный характер (27,6±13,7), по опроснику «ПБЦ–40» тяжелый характер (95,2±31,9). Пациенты с ПБЦ имели максимально выраженную степень астении по всем трем опросникам. В результате корреляционного анализа связи астении и кишечной
проницаемости (КП), астении и концентрации IL-8 сыворотки крови обнаружено не было.
Впервые проведено комплексное изучение КП «тройным сахарным тестом» при различных АЗП. При АИГ, ПБЦ, синдроме перекреста (АИГ/ПБЦ) вне зависимости от длительности, активности, наличия внепеченочных проявлений, стадии заболевания (гепатит или цирроз) было выявлено повышение отношения лактулоза/маннитол. При прогрессировании АИГ и синдрома перекреста в ЦП было установлено повышение всех показателей «тройного сахарного теста». У пациентов АИГ с тяжелыми проявлениями ЦП -синдромы портальной гипертензии и печеночно-клеточной недостаточности, было выявлено максимальное изменение КП - повышение проницаемости тонкой и толстой кишки. Впервые была проведена оценка КП при различных режимах терапии АЗП: было показано, что у пациентов с АИГ на терапии глюкокортикостероидами (ГКС) тонкокишечная проницаемость была в пределах нормы, при этом при другой терапии тонкокишечная проницаемость была повышена.
Впервые проведен множественный логический регрессионный анализ связи АЗП и концентрации ЦК в сыворотки крови (IL-6, TNFa, IL-8), который в скорректированной модели выявил высокую ассоциацию IL-8 с АЗП (отношение шансов для АЗП - 51,63 (4,21-636,72)).
Впервые у пациентов с АЗП показана положительная корреляционная связь между повышением тонкокишечной проницаемости и повышением уровня IL-8 в сыворотке крови.
Практическая значимость. На основании полученных результатов предложены ранние маркеры перехода АИГ и синдрома перекреста в ЦП: одновременное повышение отношения лактулоза/маннитол и повышение сукралозы в моче. У пациентов с АИГ и синдромом перекреста на стадии ЦП и при тяжелом течении (наличие синдромов ПГ и ПКН) повышены показатели «тройного сахарного теста», что следует учитывать при их лечении.
У пациентов с АИГ, получавших терапию ГКС, проницаемость тонкой кишки не изменялась в отличие от пациентов, находившихся на другой терапии, что дает возможность использовать показатель отношения лактулоза/маннитол в моче для оценки контроля эффективности терапии.
При проведении дифференциальной диагностики заболевания печени наличие повышенного IL-8 может свидетельствовать в пользу АЗП (отношение шансов – 51,63 (4,21 – 632,72)).
Результаты исследования могут быть широко использованы в работе терапевтических отделений поликлинических учреждений и терапевтических, гастроэнтерологических отделений стационаров.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследования внедрены в практическую работу терапевтичеcкого отделения консультативной поликлиники ГАУЗ «РКБ МЗ РТ», отделения гастроэнтерологии ГАУЗ «РКБ МЗ РТ», терапевтического отделения ГАУЗ «Клиника медицинского университета», в учебный процесс на кафедре госпитальной терапии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: 89-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2015) – диплома III степени, III Всероссийский научный медицинский форум студентов и молодых ученых с международным участием «Белые цветы», (Казань, 2016) доклад по материалам диссертации был удостоен диплома II степени, конгрессе «2nd Prague European Days of Internal Medicine», (Прага, 2016), заседании научной проблемной комиссии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России (Протокол № 6 от 21 июня 2017).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 – в иностранной печати.
Личный вклад автора. Весь объём кинических наблюдений и специальных методов исследования осуществлен при непосредственном личном
участии диссертанта. Автором, исходя из определенной цели были
сформулированы задачи, разработан дизайн, выбраны методы, проведен обзор
отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме.
Самостоятельно проведен анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При аутоиммунных заболеваниях печени повышена проницаемость тонкой кишки. Аутоиммунный гепатит – заболевание с наиболее выраженным изменением кишечной проницаемости.
-
При аутоиммунном гепатите и синдроме перекреста на стадии цирроза печени, при присоединении тяжелых проявлений – синдромов портальной гипертензии печеночно-клеточной недостаточности, кишечная проницаемость характеризуется одновременным повышением проницаемости тонкой и толстой кишки.
-
При аутоиммунных заболеваниях печени выявленное достоверное повышение IL-8 в сыворотке крови, которое коррелировало с повышением тонкокишечной проницаемости.
Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени
Существует тесная связь между кишечником и печенью из-за анатомической конструкции и ее уникального сосудистого строения. Печень получает около 75% своих запасов крови из кишечника [42]. Через воротную вену в печень поступают различные вещества, такие как питательные вещества, так и бактерии, и их производные. Эти производные антигены кишечника стимулируют клетки печени и приводят к иммунному ответу через Тoll-подобные рецепторы (TLRs). Так как этиология АЗП пока остается неизвестной, патогенез объясняется в настоящее время следствием нарушения иммунологической толерантности; генетической предрасположенности и экологических факторов, запускающих аутоиммунные процессы, которые, в содружестве с Т-клетками, могут вызывать опосредованный ответ к антигенам печени для развития от воспаления до разрушения ткани печени [100]. Jordan J. Feld [65] было предложено, что хроническое бактериальное воздействие может инициировать развитие антител, которые затем вступают в перекрестную реакцию с человеческими антигенами. Uibo и соавторы [138] было высказано предположение, что генетическая предрасположенность, факторы окружающей среды и потеря иммунной толерантности может быть жизненно важным значением в стимулировании развития ПБЦ.
TLRs играют ключевую роль во врожденном иммунитете, вызывая воспалительные ответы на основные лиганды TLRs. TLRs экспрессируются в печени на клетках Купфера, эндотелиальных, дендритных клетках, эпителии желчных протоков, звездчатых клетках и гепатоцитах [73, 108]. TLRs выражены в нескольких иммунокомпетентных клетках, таких как макрофаги, моноциты, и дендритные клетки [106, 135]. TLRs, действуя в качестве датчиков возбуждения, способствуют адаптивному иммунному ответу и регуляции воспаления, являясь связующим звеном между изменениями флоры кишечника, эндотоксикоза и повреждения печени [50]. Печень постоянно сталкивается с различными антигенами, TLRs предотвращают повреждения органа из-за гиперактивации иммунной системы [104].
Эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки также экспрессируют TLRs, и, следовательно, эти два типа клеток, могут играть важную роль в воспалении [106]. Активация TLRs приводит к развитию острого и хронического повреждения печени. Накопленный опыт показывает, что стимуляция TLRs инородными антигенами индуцирует выработку иммуноактивированных и иммунорегуляторных цитокинов [108]. Кроме того, иммунорегуляторный рычаг воздействия TLR может также контролировать чрезмерное повреждения тканей. С этим знанием важно уточнить двойную роль конкретных заболеваний системы TLRs как активаторов, так и регуляторов особенно в печени [108]. В здоровом состоянии только очень небольшое количество бактерий или их продуктов могут достигать печени, где они очищаются и обезвреживаются иммунной системой печени. Кишечная иммунная система состоит из кишечник-ассоциированной лимфоидной ткани, которая включает в себя четыре лимфоидных составляющих: пейеровых бляшках, собственная пластина лимфоцита, в том числе дендритные клетки, интраэпителиальные лимфоциты и брыжеечные лимфатические узлы, которые вовлечены в адаптивный и врожденный иммунные механизмы защиты [136].
Защитный механизм поддержания иммунного гомеостаза в печени во многом зависит от кишечной барьерной функции и детоксикационной способности печени в здоровом состоянии [93].
Выделяют нормальную КП, это некий постоянный уровень КП у отдельных здоровых лиц без признаков интоксикации и заболеваний ЖКТ. Нарушенная КП – длительное изменение уровня нормальной КП, приводящая к нарушению кишечного гомеостаза, функциональными нарушениями и заболеваниями [2].
Термин «кишечный барьер» и «кишечная проницаемость» описывают два разных аспекта одной и той же анатомической структуры. Кишечный барьер состоит из четырех слоев: слизистой, подслизистой, мышечной и серозной. КП в настоящее время рассматривается как измеримая функция кишечного барьера [43].
Кишечный барьер представляет собой функциональное единство трех основных компонентов [23]: внешний слой слизи, поверхностный эпителий кишечной стенки и клетки врожденной и адаптивной иммунной системы.
Внешний слой представлен слоем слизи, покрывающей эпителиальные клетки. Включает в себя муцин, вырабатываемый бокаловидными клетками, антибактериальные продукты (лактоферрин, дефенсины, лизоцим, бактериоцины и др.), продуцируемые кишечной микробиотой и специальными клетками слизистой – клетками Панета и М-клетками. Слизистый слой кишечника является эффективным барьером на пути чужеродных веществ, поступающих с пищей, внутрипросветных микробов и продуктов их жизнедеятельности. Однако, нарушение целостности кишечного барьера при различных патологических состояниях может привести к притоку большого количества токсических производных кишечника, например, липополисахариды (ЛПС) в печень, и вызвать отклонения в активации иммунной системы, которые могут спровоцировать губительные или хронические воспалительные процессы в печени [72].
Вторым компонентом кишечного барьера является поверхностный эпителий кишечной стенки. Эпителий тонкого кишечника имеет щеточную кайму, которая состоит из микроворсинок, всасывательная способность ограничена размерами молекул. Поэтому антигены, диаметр молекул которых составляет более 5-6 А, не могут проникнуть через мембрану щеточной каймы. Их абсорбция осуществляется непосредственно через матрикс мембраны – парацеллюлярные каналы [70], а также с помощью эндоцитоза. Этот процесс может характеризоваться не насыщаемостью, при котором количество всосавшихся веществ прямо пропорционально их содержанию в ЖКТ. Энтероциты соединены друг с другом с помощью соединительных комплексов, состоящие из плотных контактов, десмосом, и щелевых контактов, образующих избирательный физический барьер, который регулирует параклеточный транспорт [127, 137].
Общая характеристика методов исследования
Для пробоподготовки мочи применяли методику на основе работ Camilleri M. Et al. [48]. Размораживание образцов мочи осуществлялось при комнатной температуре, для равномерного распределения взвеси остатка пробы перемешивали. 50 мкл мочи перемещали в стерильный эппиндорф, куда вводили 200 мкл деионизированной воды и 550 мкл раствора внутреннего стандарта (таурохолевая кислота концентрации 2 10-8 моль/л) в смеси ацетонитрил – вода 85:15, содержащей 0,016 ммоль/л формиата аммония. Далее образцы перемешивались в вихревой мешалке в течение 1 минуты с последующей инкубацией при температуре -20С в течение 30 минут. Затем повторно перемешивались в вихревой мешалке в течение 1 минуты и центрифугировались при 5000 об/мин и температуре 4С в течение 10 минут. Далее в виалы отбирали по 0,5 мл надосадочной жидкости и полученные образцы анализировали методом ВЭЖХ – МС. Анализ производился на хроматографе Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., USA), сопряженной с масс – спектрометром ABSciex 5600 (AB Sciex, USA). Для калибровки тандемного хроматомасс-спектрометра использовали лактулозу (Sigma – Aldrich, USA), D – маннитол (AppliChem, Германия) и сукралозу (J.K. SukroloseInk, Китай). Отобранные и подготовленные пробы помещались в автоматический пробоотборник, который отбирал их в обьеме 5 мкл и вводил в подвижную фазу. Образцы анализировались аналитическими сериями, включающими в себя: нулевой образец (zero sample), калибровочные стандартные образцы, образцы контроля качества (QC samples) и анализируемые образцы. На протяжении анализа серии образцов стандартные растворы, образцы контроля качества и анализируемые пробы находились в автоматическом пробоотборнике, где поддерживалась температура 4С.
Концентрация исследуемых веществ в пробах определялась по площади хроматографического пика на хроматограмме по выбранному иону (XIC) и по калибровочной кривой, отражающей зависимость этих площадей от концентрации аналитов. Расчет концентраций осуществлялся на программном обеспечении MultiQuant (AB Sciex, v. 3.0.2), с использованием алгоритма MQ4. Из полученных концентраций с учетом всех разбавлений рассчитывалась концентрация. Концентрация исследуемых сахаров выражалась в нмоль/л (рисунок 1). 2. Определение уровня цитокинов: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-, IFN-. Определение уровней ЦК проводилось с помощью «Bio-Plex 200» (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Подготовка сыворотки крови включала: венепункцию срединной локтевой вены с забором 9 мл крови в апирогенные пробирки, покрытые микродисперсным антикоагулянтом К3 этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), ее выдерживание в течение 30 мин при комнатной температуре, далее центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделившуюся сыворотку отбирали стерильным шприцем и хранили в морозильнике при температуре -20С до сбора всей коллекции.
Определение уровня ЦК осуществлялся с помощью набора 8-plex фирмы Bio-Rad. Добавляли конъюгированные бидсы в каждую лунку 96 луночного планшета. Затем добавляли стандарты, сыворотка и инкубировали при комнатной температуре в защите от света 1 час. Затем, отмывали 3 раза отмывочным раствором и добавляли антитела. Так же инкубировали 1 час. После отмывки планшета добавляли стрептавидин и инкубировали 10 минут. Последним этапом было добавление 150 мкл буфера и анализ при помощи мультиплексного анализатора на платформе «Luminex 200» фирмы Bio-Rad.
Определение цитокинового профиля проводили с помощью наборов «Bio-PlexProTMAssay» (USA). Разводили в 50 мл пробирке магнитные частицы (в темноте). Магнитные частицы перемешивали на вортексе «MICROSPINFV-2400» 30 секунд. Вносили по 50 мкл в каждую лунку. Промывали на промывочной станции «Bio-PlexProTMIIWashstation» Bio-Rad (USA). Разводили стандарты согласно протоколу. Многоканальной пипеткой вносили 50 мкл исследуемых образцов сывороток и стандартов. Инкубировали 30 минут при комнатной температуре на шейкере «MiniShaiker PSU – 2Т». Разводили детектирующие антитела. Многоканальной пипеткой вносили по 25 мкл детектирующих антител и инкубировали 30 минут при комнатной температуре на шейкере «MiniShaiker PSU – 2Т». Промывали на промывочной станции «Bio-PlexProTMII Washstation» Bio-Rad (USA). Добавляли стрептавидин по 50 мкл в лунку и инкубировали в темноте при комнатной температуре. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре на шейкере «MiniShaiker PSU – 2 Т». Промывали на промывочной станции «Bio-PlexProTMIIWashstation» Bio-Rad (USA). Вносили по 125 мкл анализирующего буфера. Инкубировали 30 секунд при комнатной температуре на шейкере «MiniShaiker PSU – 2 Т». Анализ исследуемых цитокинов производили на мультиплексном анализаторе «Bio-Plex 200» Bio-Rad (USA) на платформе «LuminexxMAPTMTechnology».
Состояние кишечной проницаемости при аутоиммунных заболеваниях печени
При изучении отношения лактулоза/маннитол у 20 пациентов с ПБЦ нами было обнаружено повышение тонкокишечной проницаемости – 0,106 [0,07; 0,22] (р 0,001) по сравнению с группой контроля 0,013 [0,01; 0,025], уровень сукралозы 380,8 [180,8; 1176] нмоль/л не отличался от группы контроля – 785,6 [408; 1027,2].
При анализе длительности заболевания нами было выявлено, что вне зависимости от длительности ПБЦ, как у пациентов с коротким анамнезом от 1 до 6 месяцев, так у пациентов с более длительным течением ПБЦ (до 5 лет) тонкокишечная проницаемость была повышена (таблица 11).
У пациентов с наличием артралгий и у пациентов без суставного синдрома проницаемость тонкой кишки была достоверно повышена вне зависимости от наличия внепечёночного проявления.
При анализе тяжелых проявлений ПБЦ – синдрома ПГ и ПКН было выявлено, что у 7 пациентов (35%) с ПГ была достоверно повышена как тонкокишечная проницаемость – 0,076 [0,036; 0,23] (р 0,05), так и толстокишечная проницаемость – 1091,2 [480; 2176] (р 0,001). У 4 (20%) пациентов с ПКН была повышена только тонкокишечная проницаемость – 0,09 [0,07; 0,24] (р 0,001), толстокишечная проницаемость была сопоставима с группой контроля – 741,6 [170,5; 1559,2].
У пациентов с наличием артралгий и у пациентов без суставного синдрома проницаемость тонкой кишки была достоверно повышена вне зависимости от наличия внепечёночного проявления.
При анализе тяжелых проявлений ПБЦ – синдрома ПГ и ПКН было выявлено, что у 7 пациентов (35%) с ПГ была достоверно повышена как тонкокишечная проницаемость – 0,076 [0,036; 0,23] (р 0,05), так и толстокишечная проницаемость – 1091,2 [480; 2176] (р 0,001). У 4 (20%) пациентов с ПКН была повышена только тонкокишечная проницаемость – 0,09 [0,07; 0,24] (р 0,001), толстокишечная проницаемость была сопоставима с группой контроля – 741,6 [170,5; 1559,2].
Таким образом, у пациентов с ПБЦ вне зависимости от длительности, наличия внепеченочных проявлений было выявлено повышение тонкокишечной проницаемости. Тогда как при синдроме ПГ было выявлено повышение тонкокишечной и толстокишечной проницаемости.
Пациентка В., 1968 г.р., поступила с жалобами на сильный кожный зуд по всему телу, больше стопы, зуд более выраженное в вечернее время, пожелтение склер и кожных покровов, сухость кожных покровов, чувство дискомфорта в правом подреберье слабость, быструю утомляемость. Anamnesis morbi: считает себя больной с 2010 года, когда появился сильный кожный зуд, сопровождавшийся гиперемией кожи. С данной жалобой обратилась к дерматологу, был выставлен диагноз: атопический дерматит. Лечение: мазь с ГКС, гипоаллергенная диета. На фоне местной терапии гиперемия прошла, зуд стал меньше, но не прошел. В декабре 2011 года появилась тошнота, изжога независимо от приема пищи, стала отмечать быструю утомляемость и снижение памяти, кожный зуд в вечернее время. При прохождении диспансерного обследования была обнаружена повышенная СОЭ, остальные показатели были не изменены: Hb 12,6 г/л, Er 4,54х1012/л, Ley 7х109/л, СОЭ 49 мм/ч; в биохимическом анализе крови – цитолиз, холестаз, гиперхолестеринемия: АЛТ 93 е/л, АСТ 77 е/л, щелочная фосфотаза 326 ед/л, ГГТП 672 ед/л, общий билирубин 16,7 мкмоль/л, общий холестерин 8,99 ммоль/л; повышение IgG 27 ед/мл, повышение ЦИК 762 ус.ед. Аутоантитела - повышение: АМА 154, AНA отрицательный, АГМА отрицательный.
Объективно: состояние удовлетворительное. Кожные покровы – легкая иктеричность, расчесы по всему телу, сухость кожных покровов. Видимые слизистые – краевая иктеричность. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧДД – 16/мин. Тоны сердца ясные, ритмичные. ЧСС и пульс 78 уд в минуту. АД 116/70 мм рт. ст. Язык чистый, влажный. Живот симметричен, при пальпации дискомфорт в правом подреберье. Размеры печени по Курлову 9х8х6 см, печень плотная, край подострый. Селезенка не пальпируется, перкуторно 6х8см. Симптом Щеткина -Блюмберга отрицательны. Для дальнейшего обследования и назначения терапии госпитализирована с диагнозом: Хронический гепатит, аутоиммунного генеза, не исключается дебют ПБЦ. Лечение: диета № 5 по Певзнеру, УДХК по 250 мг 3 раза в день.
Во время госпитализации лабораторно: в ОАК: Hb 11,7 г/л, Er 4,21х109, Ley 4900, СОЭ 27 мм/ч; в биохимическом анализе крови – синдром цитолиза, холестаза, гиперхолестеринемия, билирубин не изменён: АЛТ 46 е/л, АСТ 47 е/л, щелочная фосфотаза 348, ГГТП 50,8, общий билирубин 11,7, общий холестерин 6,09; IgG 18, ЦИК 216.
УЗИ органов брюшной полости выявило изменения структуры печени, признаки портальной гипертензии (расширение портальной и селезеночной вен, спленомегалия): печень – контуры бугристые, паренхима диффузно – неоднородная, эхогенность смешанная, V.p. – 14 мм. Желчный пузырь – частично сокращен, размер 60х20 мм. Поджелудочная железа прикрыта петлями кишечника. Селезенка – размер 130х55 мм, паренхима однородная, эхогенность повышена, селезеночная вена 8 мм. Брюшная полость – кишечник вздут. В брюшной полости свободной жидкости не визуализируется.
ФГДС: пищевод без особенностей. Зубчатая линия не смещена. Кардия смыкается. Желудок содержит слизь. Складки обычные. Слизистая во всех отделах несколько отечна, местами гиперемирована, больше в антруме. Привратник проходим. Слизистая луковицы 12-ти перстной кишки и постбульбарных отделов местами гиперемирован, деформаций нет. Взята биопсия на НР. Заключение: поверхностный гастродуоденит. Биопсия на НР: отрицательный. Был установлен диагноз: ПБЦ 3 степени (АМА+) с синдромом портальной гипертензии (спленомегалия). Портальная гастропатия. Поверхностный гастродуоденит в стадии обострения, не ассоциированный с НР. Был назначен прием УДХК по 250 мг 3 раза в день длительно, плазмоферез. Изучение проницаемости кишечника «тройным сахарным тестом» выявило повышение тонкокишечной проницаемости – отношение лактулоза/маннитол было 0,27, повышение толстокишечной проницаемости – содержание сукралозы в моче составило 5712 нмоль/л. Таким образом, у пациентки с ПБЦ и наличием тяжелого клинического течения – присоединения синдрома ПГ была повышена проницаемость тонкой и толстой кишки.
Связь клинико – лабораторных показателей при аутоиммунных заболеваниях печени и цитокинового профиля
У пациентов с АЗП на стадии ЦП был выявлен более широкий спектр повышения уровней ЦК – IL-6 (р 0,05), IL-8 (р 0,05) и TNF- (р 0,05) при сопоставлении с пациентами на стадии гепатита – IL-6 (р 0,001), IL-8 (р 0,001). У пациентов с ЦП отмечалась тенденция к увеличению уровней ЦК в зависимости от тяжести ЦП: наиболее высокие уровни ЦК наблюдались у пациентов с ЦП класс С по Чайлд-Пью – IL-6 1,04 [0,45; 2,47] (р 0,05), IL-8 2,33 [1,18; 5,16] (р 0,05) и TNF- 3,2 [2,5; 4,3] (р 0,05). При анализе тяжелого течения ЦП с наличием синдромов ПГ и ПКН было выявлено, что у этих пациентов сохранялось повышение IL-6 (p 0,001), IL-8 (p 0,001) и TNF- (p 0,001) по сравнению с группой контроля.
При анализе проводимой терапии было выявлено, что у пациентов, принимающих АЗА, повышенным был только IL-8 1,66 [0,04; 1,94] (р 0,001). Известно, что АЗА является препаратом, применяемым для поддержания ремиссии у пациентов с АИГ и синдромом перекреста. Вероятно, что достижение ремиссии у пациентов с АЗП сопряжено с нормализацией других ЦК, кроме IL-8.
У пациентов с АИГ были повышены уровни IL-6 (р 0,001), IL-8 (р 0,001) по сравнению с группой контроля. У пациентов с АИГ в активной фазе заболевания, также как, при АЗП было выявлено повышение более широкого спектра ЦК – IL-6 (p 0,001), IL-8 (p 0,001), IL-10 (p 0,001) и TNF- (р 0,001), чем у пациентов с неактивной фазе – повышение только IL-8 (p 0,001). У пациентов с ЦП было выявлено повышение IL-6 (p 0,001), IL-8 (p 0,001) и TNF- (p 0,001), по сравнению с пациентами с гепатитом, у которых было выявлено повышение только IL-6 (p 0,001), IL-8 (p 0,001). У пациентов с ЦП и наличием синдрома ПКН были максимальные уровни ЦК – IL-6 1,13 [0,5; 1,9] (p 0,001), IL-8 1,56 [0,62; 3,4] (p 0,001). У пациентов с синдромом ПКН IL-6 (р 0,001) и IL-8 (р 0,001) были не только выше чем в группе контроля, но и выше, чем у пациентов без ПКН IL-6 0,7 [0,4; 1,9] (р 0,001), IL-8 1,16 [0,88; 1,94] (р 0,001).
При проведении оценки уровня ЦК у пациентов с синдромом перекреста нами было выявлено аналогичное повышение спектра ЦК, как при АИГ. Так, были повышены IL-6 (р 0,001), IL-8 (р 0,001) и TNF- (р 0,001) пo сравнению с группой контроля. У 82,2% пациентов с синдромом перекреста в активнoй фазе было выявлено пoвышение широкого спектра ЦК – IL-6 (p 0,001), IL-8 (p 0,001) и TNF- (р 0,001) при сопоставлении с пациентами в неактивной фазе, у которых было выявлено только повышение IL-8 (p 0,001). При оценке уровня ЦК у пациентов с формированием ЦП в исходе синдрома перекреста было выявлено повышение IL-8, IL-6, при нарастании тяжести ЦП в виде ПГ, кроме IL-6 (р 0,001) и IL-8 (р 0,001), было отмечено повышение TNF- (р 0,001) по сравнению с группой контроля. При сравнении с пациентами без ПГ, при наличии ПГ уровень IL-8 (р 0,001) и TNF- (р 0,001) был выше.
При анализе цитокинового статуса у пациентов с ПБЦ было выявлено повышение IL-6 (р 0,001), IL-8 (р 0,001), TNF- (р 0,001) по сравнению с группoй контроля. У самой тяжелoй категории пациентов с ПБЦ с присоединением ПГ и ПКН сохранялось повышение IL-6 (р 0,001), IL-8 (р 0,001), TNF- (р 0,05). V. Barak [30] и соавторы показали высокие уровни провоспалительных ЦК - IL-1, IL-6, TNF- по сравнению с контролем у пациентов с ПБЦ. Другое исследование X Bo [44] и соавторов показало возможную связь между измененными функциями Т-клеток и усилением тканевого уровня TNF- у пациентов с ПСХ.
Следует отметить, что как при АЗП в целом, так и при разделении на нозологии у всех пациентов, вне зависимости от клинических особенностей был повышен IL-8. В то время как, IL-6 и TNF- чаще повышались при активности заболевания, при прогрессировании в ЦП и присоединении его осложнений. IL-8 синтезируется большим количеством клеток. Потенциально, любая клетка, способная к экспрессии TLR, способна продуцировать IL-8, особенно это касается моноцитов и макрофагов. Экспериментальными работами было показано, что IL-8 может функционировать не только как белок-хемоатрактант в печени, но и обладать профибриногенными функциями [147]. Так, у пациентов с прогрессированием фиброза печени (вирусной, алкогольной и аутоиммунной этиологии) основными клетками, на которые воздействовал IL-8, были моноциты/макрофаги в большей степени, чем нейтрофилы. При аутоиммунном воспалении основными клетками воспаления являются лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, что может в некоторой степени объяснить выявленное нами повышение именно IL-8 при АЗП. Учитывая сложность взаимодействия сети ЦК, у пациентов с АЗП мы провели корреляционный анализ Спирмана между показателями активности процесса и повреждения печени – печеночных ферментов, альбумина и билирубина, СОЭ и уровнем -глобулина и уровнями ЦК. Большинство корреляций наблюдалось у IL-8, который имел положительную прямую корреляцию с уровнем СОЭ (0,41 (0,002)), АСТ (0,32 (0,018)), ЩФ (0,45 (0,001)) и общим билирубином (0,42 (0,001)) и отрицательно обратно коррелировал с уровнем сывороточного альбумина (-0,33 (0,026)). У IL-6 наблюдалась отрицательная обратная корреляция с уровнем сывороточного альбумина (-0,30 (0,044)). При разделении на нoзоологии сохранялась максимальная корреляционная связь клинико-лабораторных параметров и IL-8. Так, при АИГ наблюдалась корреляционная связь IL-8 с АСТ (0,40 (0,032)) и общим билирубином (0.43 (0,017)). У пациентов с ПБЦ IL-8, который имеет положительную корреляцию с урoвнем СОЭ (0,39 (0,358)), АСТ (0,14 (0,319)), ЩФ (0,55 (0,458)) и сывороточным альбумином (0,02(-0,269)) и отрицательно коррелировал с уровнем общего билирубина -0,34 (0,275)). При СП не наблюдалось корреляционных связей с IL-8. Однако была выявлена полoжительная корреляционная связь IL-6 с уровнем СОЭ (0.49 (0.014)) и -глобулином (0.46 (0.046)). У TNF- наблюдалась положительная корреляционная связь с oбщим билирубином (0.56 (0.002)).
Проведенный нами множественный логический регрессионный анализ выявил связь АЗП и IL-8 сыворотки крови. В нескорректированной модели отношение шансов у пациентов с АЗП составило для IL-6 – 3,626 (1,023-12,857), для IL-8 – 56,712 (6,012 – 534,995) и для TNF- – 1,55 (1,059- 2,293).