Содержание к диссертации
Введение
Литературный Обзор 11
1. Генно-инженерный инсулин человека: успехи и перспективы развития 11
1.1. Структура и функции инсулина 11
1.2. Инсулин человека - основы технологии получения 16
1.3. Генно-инженерный инсулин в России 24
1.4. Готовые лекарственные формы инсулина 27
1.5. Аналоги инсулина. Свойства и применение 29
2. Гормон роста человека 35
2.1. Способы получения гормона роста человека 37
2.2. Механизмы действия соматропина 45
2.3. Терапевтическое применение соматропина 50
Результаты и обсуждение 57
1. Создание технологии получения и разработка стандарта качества активной фармацевтической субстанции генно-инженерного инсулина человека 57
1.1 Создание технологии получения активной фармацевтической
субстанции генно-инженерного инсулина человека 57
1.2. Разработка методов контроля и создание стандарта качества субстанции инсулина 93
2. Создание технологии получения и разработка стандартов качества готовых лекарственных форм генно-инженерного инсулина человека 99
2.1. Создание технологии получения быстродействующей лекарственной формы инсулина 100
2.2. Создание технологии получения пролонгированной лекарственной формы инсулина 101
2.3. Стандартизация препаратов ИНСУРАН 104
2.4. Стабильность препаратов ИНСУР АН 109
2.5. Доклиническое изучение препаратов ИНСУР АН 110
2.6. Клинические испытания препаратов ИНСУР АН 111
3. Создание технологии получения и разработка стандарта качества активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека 113
3.1. Создание технологии получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека 113
3.2. Разработка стандарта качества активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека 132
3.3. Доклинические испытания соматропина 134
3.4. Клиническое изучение лекарственной формы соматропина человека (Растан) 135
4. Организация производства инсулина и соматропина в соответствии с правилами GMP и внедрение препаратов в практику отечественного здравоохранения 138
5. Апробация разработанных методологий в смежных разделах биотехнологии 141
5.1. Технология получения биологически активных соединений растительного происхождения (культура клеток) 141
5.2. Технология получения дисахарида клеточной стенки Micrococcus Luteus (Lysodecticus) 143
Материалы и методы 145
1. Материалы 145
1.1. Реактивы 145
1.2. Непромышленные препараты 146
2. Методы исследований
2.1. Получение и культивирование штаммов продуцентов 149
2.2. Выделение и очистка активных фармацевтических субстанций 162
2.3. Производство готовых лекарственных форм инсулина человека -ИНСУРАН 181
2.4. Контроль качества лекарственных препаратов 193
Выводы 221
Список сокращений , 223
Благодарности 225
Библиография 226
- Инсулин человека - основы технологии получения
- Разработка методов контроля и создание стандарта качества субстанции инсулина
- Создание технологии получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека
- Технология получения дисахарида клеточной стенки Micrococcus Luteus (Lysodecticus)
Введение к работе
Развитие с середины 1970-х годов генной инженерии, т.е. технологии получения рекомбинантных ДНК, значительно изменило характер исследований, проводимых в области генетики, биологии развития и эволюции. Разработка методов клонирования ДНК и проведения полимеразной цепной реакции позволяют получать в достаточном количестве необходимый генетический материал, включая рекомбинантные (гибридные) ДНК. Эти методы используются для выяснения тонкой структуры генетического аппарата и отношений между генами и их специфическими продуктами - полипептидами. Вводя в клетки рекомбинантную ДНК, удалось получить штаммы бактерий, способные синтезировать важные для медицины белки, например человеческий инсулин, гормон роста человека и многие другие соединения.
Развитие современной фармакологии невозможно представить без открытия новых препаратов, получаемых с помощью методов генетической инженерии. Успехи медицины сегодняшнего дня все более базируется на активном применении белковых препаратов, полученных с помощью технологии переноса наследственной информации (генов) из одного организма в другой. Целью этой операции является, как известно, использование возможностей организма нового хозяина к считыванию этой генетической информации и трансформации ее в белковый продукт. Способность производства заданного полипептида (его экспрессия) является определяющей в выборе нового хозяина и условий его культивирования. Возможность экспрессировать чужеродные гены в клетках различных организмов (как эукариотических, так и прокариотических) стала по сути одним из революционных событий последних двух декад XX столетия, заложила основы современной биотехнологии и явилась фундаментом самостоятельной отрасли науки - молекулярной биотехнологии. Получение новых лекарств на основе рекомбинантных белков по своей значимости для
практического здравоохранения можно сравнить с успехами Дженнера и Пастера в области вакцинации и открытием в середине XX столетия эры антибиотиков. Гетерологическая экспрессия белков наряду с расшифровкой генома человека сделала принципиально возможным создание основ для «компенсирующей», или «ингибирующей» терапии белками, закодированными в геноме и произведенными в необходимых количествах другими клетками-хозяевами. Сбылась давняя мечта врачей - получение искусственным путем с помощью генной инженерии запасных «молекулярных» частей человека. Символично, что первые практические успехи, достигнутые с помощью технологии рекомбинантных ДНК, относятся к области молекулярной эндокринологии. В 80-ые годы прошлого столетия компании Genentech первой удалось получить генно-инженерный инсулин человека в новом хозяине, прокариотической клетке кишечной палочки (Escherichia coli) [1].
К сегодняшнему дню, биофармацевтическая промышленность стала одним из важнейших и быстроразвивающихся секторов high-tech индустрии. Последние 5 лет мировой рынок биофармпрепаратов демонстрирует ежегодные темпы роста в 15-33%, что позволило к 2005 году достичь объема продаж в $55 миллиардов [2]. Инсулин занимает одно из лидирующих положений в списке самых продаваемых рекомбинантных терапевтических белков и моноклональных антител, уступая лишь эритропоэтину [3]. Вместе с тем, рекомбинантные цитокины, колоний-стимулирующие факторы и рекомбинантные антитела становятся также незаменимым орудием в арсенале практического врача и уровни их продаж достигают миллиардных отметок.
В последние годы рекомбинантные белки, традиционно получаемые из плазмы крови, также стали завоевывать позиции на мировом рынке медицинской биотехнологии. Революционное продвижение рекомбинантных белков человека на фармацевтический рынок связано в большинстве случаев с невозможностью их получения из человеческого материала в достаточном
количестве, а замена их животными аналогами, применявшеяся ранее, во многих случаях приводила к нежелательным иммунным реакциям и побочным эффектам [4]. Кроме того, возникшие в последние годы ограничения на использование препаратов, полученных из плазмы крови доноров или из трупного материала, связаны с проблемами вирусных и прионных контаминации [5,6]. Первое особенно касается препаратов крови. Разработка и применение тест-систем для детекции гепатитов и ВИЧ удорожает эти относительно дешевые препараты и делает их уже сравнимыми по стоимости с белками, произведенными с помощью технологий рекомбинантных ДНК. При этом необходимо отметить, что некоторые генно-инженерные белковые препараты являются практически незаменимыми в онкологии и при лечении аутоиммунных процессов. В первую очередь это относится к антителам, цитокинам, поверхностным опухолевым антигенам, молекулам адгезии. Современные схемы лечения ревматоидного артрита, рака груди и шейки матки невозможно представить без применения таких препаратов как, например, ремикейд [7] и герцептин [8]. Тем не менее, на пути создания рекомбинантных белковых лекарственных средств стоит еще много трудностей как фундаментального, так и организационного характера. Общая стратегия развития современной молекулярной биологии, биохимии, микробиологии обеспечивает создание новых векторов для переноса генетической информации, разработку штаммов усовершенствованных прокариотических клеток, дрожжей, способов поддержания перевиваемых культур клеток млекопитающих, эффективных схем очистки рекомбинантных, белков и методов промышленной биотехнологии с использованием крупномасштабных биореакторов. На сегодняшнем этапе развития медицинской биотехнологии резервы использования прокариотических клеток-хозяев практически исчерпаны. Новые продукты, а главное - полипептиды большой молекулярной массы, трудно производить в Escherichia coli в биотехнологически оправданных количествах. Для обеспечения своей
функциональной активности они требуют адекватной посттрансляционной модификации. В этой связи на повестку дня поставлен вопрос использования эукариотических клеток млекопитающих. В частности, это относится к терапевтическим антителам, факторам свертывания крови, молекулам адгезии. Переход от микроорганизмов к культурам животных клеток удорожает производство белковых продуктов на порядки. Однако все промышленно-развитые страны мира активно включились в эту биотехнологическую гонку, и пошли по пути создания национальных и транснациональных исследовательских и промышленных центров.
Организационной составляющей отмечаемых трудностей работы с рекомбинантными белками и продвижением их на рынок являются вопросы биобезопасности и патентной чистоты. Белковая молекула, произведенная в чужеродной клетке-хозяине, может быть выделена с примесями, в том числе - с фрагментами ДНК клетки-хозяина, ее белками, полисахаридами и эндотоксинами. Применение препаратов с указанными контаминациямй чревато серьезными осложнениями в области иммунопатологии [9].
На фармацевтическом рынке присутствуют как оригинальные препараты, так и дженерики - воспроизведенные копии оригинальных препаратов. Ситуация с химически синтезированными препаратами достаточно понятная: в большинстве стран по истечению срока патентной защиты на оригинальный препарат другие компании могут предлагать препарат дженерик после стандартной демонстрации его биологической эквивалентности и безопасности. В отношении так называемых биодженериков, т.е. аналогов биосинтетических, препаратов, вопрос «оригинальности» и «воспроизведенное» препарата является более сложным. Многие такие препараты представляют собой точные биосинтетические копии обычных белков человека и тем самым не могут полностью рассматриваться как оригинальные препараты. Как правило, патентная защита биосинтетических препаратов распространяется на способ производства, но при универсальности методик, заложенных в
фундаментальные основы молекулярной и клеточной биологии, заранее предусмотренные изменения в схеме получения биодженерика обеспечивают патентную чистоту препарата. В то же время, демонстрация биоэквивалентности биодженерика является достаточно сложной задачей. В этой связи практическому врачу важно понимать возможные отличия биодженериков от оригинальных препаратов, связанные со способом их получения и реализацией системы контроля качества субстанции и готовой лекарственной формы.
Биотехнологическая промышленность России в «дорекомбинантную» эру находилась на одном из передовых рубежей. По производству фармацевтических и белковых препаратов для животноводства мы отставали лишь от США и Японии. Научный потенциал нашей страны позволял сделать эффективный переход к промышленному освоению технологии рекомбинантных ДНК чего, к сожалению, не случилось на рубеже XX столетия по известным политическим и экономическим причинам. Сегодня фармацевтические генно-инженерные белки, являясь весьма дорогостоящей составляющей страховой медицины в развитых странах, практически недоступны для населения нашей страны из-за высокой стоимости и несовершенства организационных структур национального здравоохранения. В то же время, современные позитивные тенденции к улучшению лекарственного обеспечения, в том числе рекомбинантными препаратами, обеспечивают возрастающую финансовую нагрузку на бюджет здравоохранения и также лимитируют количество пациентов, которые могут получить терапию такими препаратами. Создание отечественной технологической платформы производства этих препаратов позволит внести значительный вклад в решение проблемы биобезопасности России, а также заложить основы импортозамещения. Обеспечение «биотехнологической самостоятельности» России является первоочередной составляющей отечественной химической, медицинской и биологической науки.
Учитывая вышеизложенное, были сформулированы цель и задачи диссертационной работы: создание технологий производства рекомбинантных лекарственных препаратов инсулина и гормона роста человека, организация экономически эффективного производства и внедрение системы обеспечения качества в соответствии с требованиями GMP, апробация разработанных методологий в смежных разделах биотехнологии.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
Конструирование высокопродуктивных бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных инсулина и гормона роста человека и разработка на их основе высокоэффективных способов получения активных фармацевтических субстанций.
Создание технологии получения быстродействующей и пролонгированной инъекционных лекарственных форм инсулина человека.
Разработка методов контроля качества и создание стандартов качества фармацевтических препаратов инсулина и гормона роста человека.
Масштабирование и оптимизация опытно-промышленной технологии, проведение доклинических и клинических испытаний созданных лекарственных средств.
Организация производства в соответствии с правилами GMP и внедрение препаратов в практику отечественного здравоохранения.
Использование полученных научных и технологических решений в культивировании клеток растений и в производстве лекарственного препарата «Ликопид».
Инсулин человека - основы технологии получения
Первым методом, использованным для производства ГИЧ, был метод независимого клонирования А- и В-цепей полипептидного гормона. [29,30,32]. Схема включала химический синтез нуклеотидной последовательности цепей инсулина, при этом на 5 -конце каждого олигонуклетида находился кодон метионина. Синтетические гены цепей А и Б встраивали в Lac-ген в составе экспрессионных плазмид, которыми трансформировали клетки E.coli (рис. 4).
Уровень экспрессии оценивался в 20% от общего клеточного белка [29]. Рекомбинантный белок (РБ) синтезировался внутриклеточно в виде так называемых телец включения (Inclusion bodies, ТВ), .которые представляют собой агрегаты целевого белка и ряда бактериальных белков в денатурированном неактивном состоянии [33,34]. Благодаря этому целевой белок, будучи в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами. ТВ, содержащие РБ, растворяли в муравьиной кислоте и расщепляли по аминокислотному остатку метионина бромцианом, поскольку А- и В-цепи инсулина метионина не содержат.
Частично очищенные цепи инсулина подвергали окислительному сульфитолизу и в соотношении 2:1 в виде S-сульфонатов превращали в нативную молекулу двухцепочечного гормона в присутствии избытка меркаптоэтанола [12, 24]. Выход конечного продукта составлял не более 60% от количества В-цепи.
Принципиальным недостатком описанной стратегии получения инсулина является использование (3-галактозидазы в качестве белка-носителя, поскольку этот белок содержит 1000 аминокислотных остатков (ср. 51 аминокислотный остаток в молекуле инсулина). Таким образом, даже при 100% выходе из 1 г рекомбинантного белка, синтезируемого клеткой, можно получить только 50 мг инсулина.
Одним из способов оптимизации данного метода, явилось использование Тгр-оперона при создании рекомбинантной конструкции вместо lac-оперона (Р-галактозидазная система) [33]. Для конструкции, имеющей в качестве лидерной последовательность фрагмент триптофанового оперона Trp Е (190 аминокислотных остатков), это приводит к десятикратному увеличению экспрессии полипептида (А- или В-цепи инсулина) по сравнению с конструкцией, имеющей лидерную последовательность р-галактозидазы [35].
В последние годы продолжаются попытки оптимизировать метод раздельного конструирования цепей, так например в 1999 г. опубликована работа [27], в которой описана рекомбинантная плазмида, кодирующая химерный белок с N-концевой последовательностью редуцированного у-интерферона (133 аминокислотных остатка, pi 9,5), связанного через остаток метионина с А- или В-цепью инсулина. Экспрессия рекомбинантного белка достигает уровня в 4,6 г целевого белка с 1 л культуры, что составляет, в пересчете на сухой остаток клеток, для А-цепи 600 мг на 1 л культуры, а для В-цепи 800 мг.
Выделение индивидуальных цепей инсулина проводили из ТВ, растворяя последние в 70% муравьиной кислоте и расщепляя РБ бромцианом с последующим сульфитолизом. Очистку А-цепи в виде S-сульфоната проводили анионообменной хроматографией, а S-сульфонат В-цепи инсулина выделяли ОФ ВЭЖХ. В присутствии избытка тиолсодержащих агентов очищенные в-ёульфонаты А- и В-цепей инсулина образовывали нативную двухцепочечную молекулу инсулина человека с тремя дисульфидными связями. По мнению авторов использование термоиндуцируемого штамма позволяет обойтись при производстве без дорогого традиционно используемого индуктора экспрессии изопропил-(3-0-тиогалактозида (ИПТГ), а выделение индивидуальных цепей инсулина элиминирует стадию ферментативного расщепления рекомбинантного белка-предшественника (препро- или проинсулина, см. ниже). При этом использование высокотоксичного реагента бромциана не обсуждается, а конечный выход нативного инсулина не приводится.
Значительно перспективнее оказался способ, основанный на конструировании рекомбинантной плазмиды, экспрессирующей химерный белок, содержащий ту или иную N-концевую последовательность, соединенную с полипептидной цепью проинсулина человека (рис. 1). Необходимость наличия N-концевой вставки (fusion), связана с тем, что при экспрессии гена проинсулина, кодирующего последовательность В-цепь-С-пептид-А-цепь инсулина, в бактериях происходит внутриклеточная деградация синтезируемого белка [33]. Первые результативные эксперименты по экспрессии в Е. coli рекомбинантного белка, содержавшего последовательность проинсулина, основывались на использовании синтетического гена, кодирующего химерный белок, имевший в качестве N-концевой вставки (лидерный пептид) либо фрагмент Р-галактозидазы, либо фрагмент триптофанового оперона (Trp-LE белок) [36,37], связанные с проинсулином через аминокислотный остаток метионина (рис. 5, x=Met). Рекомбинантный белок накапливался в цитоплазме в виде телец включения.
Полученный РБ расщепляли по аминокислотному остатку метионина бромцианом, полученный проинсулин подвергали окислительному сульфитолизу с переводом SH- групп остатков цистеина в -S-S03 группы. Гексасульфонат проинсулина ренатурировали с образованием в структуре проинсулина природных дисульфидных мостиков и последующим энзиматическим выщеплением С-пептида и С-концевого аргинина получали нативную молекулу инсулина. Корпорация Eli Lilly & Со (США) реализовала технологию, основанную на описанной схеме, в крупномасштабном промышленном производстве инсулина человека мощностью более 1000 кг в год [38].
Разработка методов контроля и создание стандарта качества субстанции инсулина
Известен способ получения соматропина, состоящий в его выделении из тканей гипофиза человека [84]. Недостатками способа являются сложность с получением исходного материала и риск заражения инфекцией [85].
Способ, основанный на получении рекомбинантного соматропина в трансформированных клетках мыши линии С127 [86]. При таком подходе удается получить гормон роста человека в правильной конформации с хорошей физиологической активностью. Недостатками этого способа являются чрезвычайно низкий выход и длительное время культивации продуцирующих клеток.
Второй способ получения соматропина, включающий экспрессию в клетках Escherichia coli, заключается в достаточно быстром биосинтезе клетками бактерий рекомбинантного соматропина в виде нерастворимых телец включения [87]. При использовании данного общего способа получения рГРЧ уровень биосинтеза целевого белка может колебаться в широких пределах.
Открытие соматотропного гормона высших организмов и связанной с ним системы гормональной регуляции заложило основу многих направлений современной молекулярной биологии и молекулярной медицины, биохимии и биотехнологии. Гормон роста человека является наиболее изученным полипептидным гормоном, привлекающим внимание исследователей уже более 80 лет, с момента обнаружения воздействия гипофиза на рост организма. Выделение ГРЧ из гипофиза в 1944 г. позволило установить его основные эндокринные функции. В начале 1960 гг. природный ГРЧ был применен для лечения карликовости (гипофизарный нанизм) у детей. Клонирование гена ГРЧ и получение рекомбинантного гормона в неограниченных количествах привело к резкому расширению его применения в медицине начиная с 1985 г., что, в свою очередь, стимулировало исследования молекулярных основ действия ГРЧ и связанных с ним гормонов и рецепторов.
Аминокислотная последовательность ГРЧ была установлена в 1964 г. [88], а кодирующий участок гена ГРЧ был клонирован Питером Сибургом и соавторами в 1979 г. [89]. Ценность последней работы особенно ярко проявилась 20 лет спустя, когда компания Genentech выплатила $200 млн. Калифорнийскому Университету, поскольку Сибург воспользовался полученным им во время работы в университете клоном ГРЧ для дальнейших исследований в Genentech [90]. ГРЧ принадлежит к группе гормонов, включающей пролактины и плацентарные гормоны, и представляет собой белок, состоящий из 191 аминокислотного остатка (рис. 9) и имеющий 2 дисульфидные связи и 4 основных альфа-спирали. Согласно кристаллографическим данным [91,92] (рис.9) альфа-спиральные участки молекулы ГРЧ собраны в пучок и расположены в топологии «вверх—вверх—вниз—вниз» и включают в себя аминокислотные остатки 9—34, 72—92, 106—128 и 155—184, соответственно. Дисульфидные связи образованы между остатками 35—165 и 182— 189. Из других особенностей структуры молекулы ГРЧ можно отметить наличие гидрофобного ядра, включающего около 20 аминокислотных остатков, и трех дополнительных альфа-спиральных участков, связывающих основные альфа-спирали — двух между основными альфа-спиралями 1 и 2 и одного между 2 и 3. Изучение гена ГРЧ GH-1 (в ряде работ — GH-N) показало, что его продукт экспрессируется в двух основных изоформах вследствие альтернативного сплайсинга мРНК (М = 20 кДа и 22 кДа). Посттрансляционные модификации основной формы (М = 22 кДа) включают ацетилирование N-концевой аминокислоты, дезамидирование, олигомеризацию [93], гликозилирование и распад на протеолитические фрагменты: ГРЧ 1—43 и ГРЧ 44—191 [94]. Биосинтез полноразмерного ГРЧ стал возможен только в 1980-х гг., а химический синтез столь длинного полипептида экономически нецелесообразен. В связи с этим предпринимались попытки синтезировать его фрагменты, сохраняющие способность связывать его рецептор — ГРЧР. Были получены 8-членный пептидный фрагмент ГРЧ [95], более длинные фрагменты 95—136 [96], 1—54 [97] и 177—191 [98], не обладавшие медицински значимой активностью. После появления кристаллографических данных о пространственной структуре ГРЧ и структуре комплекса ГРЧ с рецепторами (рассмотрена ниже) были предприняты более рациональные попытки выявить небольшой участок ГРЧ, ответственный за связывание рецептора, суммированные в обзоре Д. Копчика [99]. Эти опыты, впрочем, привели к обратному результату — созданию антагониста ГРЧ полипептида В-2036. В области синтеза аналогов гипоталамических факторов, высвобождающих ГРЧ в гипофизе, был достигнут больший прогресс. Так, синтезирован 29-членный пептид, соответствующий N-концевой части GHRH (соматолиберин; гормон, высвобождающий ГРЧ; growth hormone releasing hormone). Этот синтетический пептид применили для коррекции роста в группе из 18 детей допубертатного возраста, страдающих дефицитом ГРЧ. У 12 пациентов наблюдалось увеличение линейного роста, у 8 из них — клинически значимое ускорение роста [100].
Создание технологии получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека
В хромосоме 17 находится ген гипофизарного ГРЧ GH-1, который входит в локус из пяти близкородственных генов, кодирующих, помимо ГРЧ, гормоны плаценты [136]. Накопление ГРЧ в продуцирующих его клетках гипофиза — соматотрофах, происходит в секреторных везикулах предположительно в форме димера, в котором две молекулы ГРЧ координируют ион цинка остатками Hisl8, His21 и Glul74 [137]. Выброс ГРЧ происходит импульсами под действием соматолиберина (гормона, высвобождающего ГРЧ, GHRH), который экспрессируется клетками гипоталамуса. Рецептор GHRH экспрессируется в гипоталамусе и клетках гипофиза; в условиях мышиной модели было показано, что карликовый фенотип обеспечивается мутацией в гене рецептора GHRH [138]. Не гомологичные гормону GHRH синтетические пептиды (GHRP s), высвобождающие ГРЧ, были открыты в начале 1980 гг. при синтезе производных энкефалина, не обладающих опиоидными свойствами, благодаря способности некоторых из них стимулировать гипофиз in vitro [106]. Пептиды GHRP действуют через специфические рецепторы (GHS-R) на клетках гипофиза или гипоталамуса [103]. Природным лигандом этих рецепторов, открытым сравнительно недавно, является пептидный гормон грелин, вырабатываемый в желудке [139].
Угнетение экспрессии ГРЧ обеспечивается гормоном гипоталамуса соматостатином (соматотропин-ингибирующий фактор, СИФ), антагонистом соматолиберинов. Показано, что GHRH и соматостатин используют цАМФ-зависимый путь передачи сигнала в клетке-мишени [140].
ГРЧ также инициирует петлю отрицательной обратной связи для контроля собственной экспрессии, воздействуя через ГРЧР на нейроны гипоталамуса, секретирующие соматостатин и нейропептид Y [141]. Пролиферация соматотрофов зависит от функционирования гена Pit-1, продукт которого участвует в активации транскрипции генов рецепторов GRF (фактора, высвобождающего ГРЧ, соматокринина), соматостатина и дофамина [142]. Уровень секреции ГРЧ в норме пульсирует. Большая часть ГРЧ, до 70% у мужчин среднего возраста, выбрасывается в циркуляцию вскоре после засыпания во время первого периода медленного сна [143]. Стоит отметить, что введение GHRH усиливает медленный сон одновременно со стимуляцией секреции ГРЧ [144].
Циркулируя в организме, ГРЧ воздействует на клетки-мишени через ГРЧР и рецептор пролактина. ГРЧР принадлежит к суперсемейству цитокиновых/эритропоэтиновых рецепторов типа I и состоит из одного иммуноглобулин-подобного внеклеточного домена, содержащего консервативный фрагмент Trp-Ser-Xrp-Ser, единственной трансмембранной альфа-спирали и внутриклеточной части, содержащей два функционально значимых консервативных участка Box I и Box II [145]. Структура комплексов ГРЧ с ГРЧР [92] и рецептором пролактина [146] очень схожи; в обоих случаях детерминанты связывания на поверхности рецепторов близки, хотя их аминокислотная последовательность весьма различна. В составе продуктивных комплексов белки находятся в стехиометрическом соотношении ГРЧ : рецептор 1 : 2. Оба рецептора в комплексах со стехиометрией 1:1 контактируют с одним и тем же участком поверхности ГРЧ [147]. Две трети свободной энергии образования комплекса ГРЧ с ГРЧР обусловлены гидрофобным ядром в центре связывания, образованным двумя остатками триптофана в полипептидной цепи рецептора [148]. Было показано, что прочность комплекса ГРЧ с рецептором пролактина, но не с ГРЧР, зависит от присутствия ионов цинка [149]. Для активации ГРЧР при связывании лиганда необходимо последовательное связывание ГРЧ с первой молекулой рецептора (сайт 1) и последующее связывание со второй молекулой (сайт 2) [150]; такой способ взаимодействия лиганд-рецептор непосредственно диктует способ создания антагониста —аналога лиганда с разрушенным сайтом 2, что будет подробнее рассмотрено ниже.
Передача сигнала в клетке от активированного рецептора опосредуется протеинкиназой JAK-2 (Janus type kinase 2), которая связывается с цитоплазматической частью димеризованного РГРЧ и фосфорйлирует собственные остатки тирозина и остатки тирозина внутриклеточного домена РГРЧ. С ними могут связываться белки, имеющие домены связывания фосфотирозина, в том числе факторы активации транскрипции группы STAT (семейство белков передачи сигнала и активации транскрипции), адапторный белок She и субстраты рецептора инсулина (IRS) 1 и 2. При участии этих молекул происходит активация таких ферментов, как МАР киназа, (MAP -белок, активируемый митогеном) фосфатидилинозитол-3 -киназа и фосфолипаза А2 и выброс вторичных посредников — диацилглицерина, ионов кальция и N0 [151]. Отрицательную регуляцию передачи сигнала по наиболее значимому пути JAK2-STAT5 осуществляет тирозинфосфатаза SHP-2, которая связывается с фосфорилированным остатком Туг595 ГРЧР [152].
Основная анаболическая функция ГРЧ опосредована гормоном соматомедином (инсулин-подобный фактор роста 1, ИФР-1) и сводится к усилению общего синтеза белка и замедлению окисления, но не к уменьшению скорости распада белка [153]. ИФР-1 представляет собой полипептидный гормон размером в 70 аминокислотных остатков, синтезирующийся в печени и антагонистичный ГРЧ в регуляции метаболизма липидов и секреции инсулина [154].
Технология получения дисахарида клеточной стенки Micrococcus Luteus (Lysodecticus)
В ситуации, обратной дефициту ГРЧ, — при акромегалии, так же успешно используется биосинтетический аналог ГРЧ — антагонист рецептора ГРЧ В2036. Он представляет собой генно-инженерно измененную молекулу ГРЧ, в которую введена одна замена в сайт 2 связывания рецептора, понижающая сродство, и 8 замен в сайт 1 связывания рецептора, повышающих сродство к рецептору [188]. Этот полипептид образует неактивный комплекс с димером рецептора ГРЧ, не взаимодействует с рецептором пролактина [189] и в форме конъюгата с полиэтиленгликолем (B2036-PEG) применяется для контроля уровня ИФР-1 при акромегалии [190].
Поскольку гормон роста является анаболиком, повышенная экспрессия собственного или гетерологичного соматропина в сельскохозяйственных животных может потенциально улучшить их свойства. Действительно, трансгенные по гормону роста крупного рогатого скота (bovine somatotropin, BST) свиньи росли на 11—14% быстрее, чем в контроле, и усваивали пищу на 18% лучше. Одновременно с этим наблюдалось перераспределение массы с подкожных жировых тканей в пользу мышц, кожи, костей и внутренних органов [191]. Кроме этого, общее состояние здоровья трансгенных свиней было ухудшено, основные патологии включали в себя хромоту, летаргию и язву желудка. Более позитивные результаты были достигнуты при введении молочным коровам рекомбинантного гормона BST, синтезируемого в Е. coli. Рекомбинантный BST увеличивал продукцию молока, но был относительно неэффективен при лечении мастита [192].
В настоящее время рекомбинантный BST, производимый компанией Monsanto, широко используется в США для усиления лактации коров. Безопасность рекомбинантного BST для человека была обоснована следующими выкладками: BST не взаимодействует с ГРЧР человека; ГРЧ неактивен при введении перорально; концентрация BST в мясе и молоке очень низка и сравнима с эндогенным уровнем; концентрация ИФР-1, выделяющегося при применении BST, также достаточно низка, и ИФР-1 не оказывает биологического действия при пероральном введении [193].
Поскольку было показано, что инъекции ГРЧ лягушкам, головастикам и крысам приводят к усилению роста мозга и увеличению отношения числа нейронов к клеткам глии, и, кроме того, в мозговой ткани многих млекопитающих был обнаружен гормон роста, связанные с ним гормоны и их рецепторы, предположили, что ГРЧ играет важную роль в развитии мозга [194]. Эти предположения не получили в дальнейшем ясного клинического подтверждения.
Применение ГРЧ при остеопорозе не показало заметных преимуществ; отмечалось, что рГРЧ в дозе 2 ед/день подкожно не приводит к изменению концентрации в плазме липидов и холестерина, хотя наблюдается набухание жировых тканей [195].
Применение рГРЧ у взрослых пациентов с дефицитом ГРЧ или без дефицита приводит к увеличению мышечной массы, уменьшению количества жира и общему улучшению качества жира [196]. Общая масса тела у взрослых пациентов с дефицитом ГРЧ, тем не менее, не уменьшается при терапии рГРЧ [197]. Терапия ГРЧ признана неэффективной при ожирении [198], несмотря на пониженный уровень ГРЧ у страдающих ожирением.
Вопрос о возможном злоупотреблении рекомбинантным ГРЧ в качестве допинга для подростков-спортсменов дискутировался в 1990 году [199]. Применение рГРЧ в качестве допинга контролируется Олимпийским Комитетом с 1989 г. [200]. Детекция экзогенного ГРЧ практически невозможна, однако уровень некоторых цитокинов остается значительно повышенным в течение 4-х дней после прекращения приема ГРЧ [201], что позволяет в некоторой мере контролировать его использование спортсменами. Необходимо отметить, что эффективность рГРЧ в качестве анаболического средства совершенно не очевидна. Исследования спортсменов-тяжеловесов показали, что прием ГРЧ не приводил к увеличению силы мышц по сравнению с контрольной группой, хотя уровень ИФР-1 был увеличен вдвое [202]. Перспективы применения рГРЧ у пожилых пациентов для устранения симптомов «соматопаузы» также не представляется очевидными. В обзоре Клауса фон Вердера [203] суммированы следующие сомнения, далекие в настоящий момент от разрешения. 1) рГРЧ вводится подкожно, что технически трудно в случае пожилых пациентов. 2) Трудно подобрать правильную дозировку ГРЧ, поскольку пожилые пациенты могут обладать повышенной (по сравнению с детьми) чувствительностью к рГРЧ или же могут быть резистентны к ГРЧ. 3) У пожилых пациентов могут быть более выражены симптомы диабета. 4) Подъем уровня ИФР-1 может усиливать развитие некоторых видов малигнизирующих опухолей; было показано, что уровень циркулирующего ИФР-1 коррелирует с частотой рака простаты. Более того, при акромегалии (повышенный уровень ГРЧ) отмечается высокая частота кишечных полипов и злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта. 5) Даже если вопросы дозировки, способа введения и безопасности применения ГРЧ будут решены, высокая стоимость терапии ГРЧ не позволить рекомендовать ее для всех пожилых пациентов с низким уровнем ИФР-1.
