Содержание к диссертации
Введение
2. Противовирусные свойства соединений терпенового ряда и производных на их основе (литературный обзор) 13
2.1. Введение 13
2.2. Противовирусная активность суммарных экстрактов растений 17
2.3. Монотерпеноиды как источник противовирусных агентов 19
2.4. Противовирусная активность соединений сесквитерпенового ряда 27
2.5. Противовирусные свойства дитерпеновых соединений и их производных 34
2.6. Противовирусная активность соединений тритерпенового ряда 48
2.7. Мишени противовирусной терапии 62
2.8. Механизм действия противовирусных агентов на основе терпеноидов 66
2.9. Заключение 70
3. Обсуждение результатов 71
3.1. Синтез библиотек соединений 73
3.1.1. Химические модификации монотерпенодов 73
3.1.1.1. Химические модификации (+)-камфоры 75
3.1.1.1.1. Синтез иминопроизводных камфоры 76
3.1.1.1.2. Синтез димерных производных камфоры 82
3.1.1.1.3. Модификации иминоспирта 88
3.1.1.2. Химические модификации борнеола и борниламина 94
3.1.1.2.1. Синтез алифатических N-гетероциклических производных (-)-борнеола 95
3.1.1.2.2. Синтез гетероароматических производных (-)-борнеола 98
3.1.1.2.3. Химические модификации изоборнеола и борниламина 103
3.1.1.3. Получение четвертичных аммонийных солей на основе камфоры и борнеола 105
3.1.1.4. Синтез производных -труксиловой кислоты, содержащих природный фрагмент борнильной структуры 107
3.1.1.5. Взаимодействие (+)-камфоры и (+)-фенхона с о-замещенными анилинами 111
3.1.1.6. Химические модификации (+)-камфорной кислоты 117
3.1.1.7. Химические модификации гидразона камфоры 123
3.1.2. Химические модификации соединений сесквитерпенового ряда – гумулена, кариофиллена и изокариофиллена 126
3.1.3. Синтезы на основе соединений дитерпенового ряда 132
3.1.3.1. Кислотно-катализируемые реакции изоцемброла 132
3.1.3.2. Синтезы соединений на основе дегидроабиетиламина 135
3.1.3.2.1. Получение аммониевых солей дегидроабиетиламина 136
3.1.3.2.2. Получение гетероциклических производных дегироабиетиламина 138
3.1.3.2.3. Получение мочевин и тиомочевин на основе дегидроабиетиламина 142
3.2. Изучение связи структуры синтезированных соединений с их противовирусной активностью 144
3.2.1. Активность против вирусов гриппа 144
3.2.1.1. Противовирусная активность иминопроизводных (+)-камфоры 147
3.2.1.2. Противовирусная активность производных борнеола, изоборнеола и борниламина 156
3.2.1.3. Активность против вирусов гриппа четвертичных аммонийных солей на основе монотерпенов, производных камфорной кислоты и гидразона камфоры 158
3.2.1.4. Изучение противовирусной активности соединений, синтезированных на основе сесквитерпеноидов 160
3.2.1.5. Изучение противовирусной активности дитерпеновых производных, синтезированных на основе изоцемброла и дегидроабиетиламина 162
3.2.2. Изучение активности против вируса Марбург 165
3.3. Изучение механизма действия соединений лидеров против вирусов гриппа 173
3.4. Проверка противовирусной активности на животных моделях. 177
3.5. Селекция и изучение вирусных штаммов, резистентных к камфецину 183
3.6. Молекулярное моделирование противовирусной активности камфецина и его аналогов 187
3.7. Разработка аналитических методик количественного определения камфецина в биологических средах 195
3.7.1. Валидация методики определения камфецина в плазме крови методом ГХ/МС 201
3.7.2. Разработка и валидация методики определения камфецина методом ВЭЖХ/МС 206
3.7.2.1. Разработка методики анализа камфецина в крови методом ВЭЖХ/МС 209
3.7.2.2. Валидация методики определения камфецина в плазме крови методом ВЭЖХ/МС 211
3.8. Проведение фармакокинетических исследований камфецина 219
3.9. Поиск метаболитов 221
3.10. Изучение распределения камфецина и его метаболитов по органам 228
3.11. Изучение влияния камфецина на физиологические особенности животных 235
3.11.1. Действие камфецина на поведение мышей в тесте «открытое поле» 235
3.11.2. Влияние камфецина на некоторые гомеостатические параметры системы крови крыс 238
3.11.3. Изучение влияния камфецина на морфофункциональные характеристики почки крыс 244
3.12. Оптимизация метода синтеза камфецина и разработка технологического процесса 251
4. Экспериментальная часть 253
5. Выводы 376
6. Список литературы 378
7. Приложение. 423
- Монотерпеноиды как источник противовирусных агентов
- Синтез димерных производных камфоры
- Противовирусная активность иминопроизводных (+)-камфоры
- Изучение влияния камфецина на морфофункциональные характеристики почки крыс
Монотерпеноиды как источник противовирусных агентов
С точки зрения химика-синтетика, планирующего дизайн синтеза новых агентов на основе природных метаболитов, обладающих той или иной биологической активностью, наибольшую важность представляет коммерческая доступность и нативная активность исходных соединений. Использование природных структурных блоков в синтезе биологически активных агентов – одно из самых популярных направлений современной химии природных соединений45,46. В связи с этим, химику необходимо понимание какие именно фармакофорные структурные блоки природных соединений могут отвечать за целевую активность, какие модификации природных остовов уже были описаны ранее в литературе и какие выводы на основании закономерностей структура — активность можно сделать с использованием современной литературы. В данном разделе обзора мы проведем анализ литературы по противовирусной активности монотерпеноидов и соединений на их основе.
Известно, что ключевой характеристикой противовирусных свойств исследуемых соединений является индекс селективности (SI), определяющийся как отношение концентрации вещества, которая вызывает гибель 50% здоровых клеток (CC50), к концентрации, которая необходима для достижения 50%-ного уровня ингибирования вирусной репродукции при помощи данного вещества (IC50). Это соотношение отражает эффективность и безопасность исследуемого соединения. Принято считать, что соединения, индекс селективности которых превышает 10, проявляют активность47.
Данных по противовирусной активности исходных монотерпеноидов в современной литературе не много. По-видимому, это связано с тем, что сами по себе монотерпеноиды не проявляют выраженной активности против большинства вирусов. Тем не менее, показано, что цитраль - монотерпеновый ациклический альдегид, существующий в виде смеси двух изомеров; цитронеллаль и цитронеллол (рис. 3) обладают активностью против вируса герпеса 1 типа48. Изучение активности (-)-- и (-)- пиненов в отношении вируса инфекционного бронхита было описано в работе49. Показано, что данные монотерпены проявляют активность с SI 10 и 7.5 соответственно. После проверки in vitro активности против вируса табачной мозаики 29 эфирных масел, было проведено исследование на животных 10 основных индивидуальных компонентов этих растительных экстрактов и показана высокая антивирусная активность цитронеллаля, лимонена и 1,8-цинеола50. In vitro и in vivo изучена активность против вируса герпеса 2 типа 1,8-цинеола51. На животной модели вирусной инфекции было показано, что данный бициклический эфир способен усилить защиту от гриппа, изучен дозозависимый эффект52. Показано прямое вирусингибирующее действие изоборнеола на вирус герпеса 1 типа53. Крайне высокая активность (SI 700) основного компонента эфирного масла растения Mentha suaveolens циклического эпоксида – пиперетон-оксида обнаружена в отношении вируса герпеса 1 типа (рис. 3)54. Авторами были проведены первичные исследования механизма действия природного эпоксида.
С использованием псевдовирусной системы, сконструированной на основе вируса везикулярного стоматита с поверхностными белками Е1/Е2 вируса гепатита С была обнаружена значительная противовирусная активность водного экстракта цветов растения Lamium album L. семейства губоцветных55. Далее, из метанольного экстракта были выделены гликозид ириоидного строения - ламиридозид и из него получены монотерпены ламиридозин А и В в соотношении 1:1 (рис. 4). Было показано, что гликозиды не проявляли активность в исследуемых условиях, в то время как монотерпены в смеси изомеров проявили специфическую активность в отношении входа вируса гепатита С в концентрации 2.3 мкмоль и не проявили активность на вирусе везикулярного стоматита. Авторы предполагают, что, по крайней мере частично, эти монотерпеновые соединения ответственны за проявление активности против вируса гепатита С экстракта описанного растения.
В целом, можно сказать, что наибольшую активность монотерпеноиды проявляют в отношении вирусов герпеса, при этом, за исключением предпоследнего примера, высокая нативная противовирусная активность монотерпеноидов на данный момент не выявлена.
В тоже время известно, что химическая модификация природного остова дополнительными фармакофорными группами может привести к значительному увеличению противовирусной активности. Общая стратегия синтеза новых веществ с заданной биологической активностью в современной медицинской химии активно развивается с использованием так называемой «концепции привилегированных структур»56,57,58,59,60..Вычленение общего фрагмента из молекулярной структуры известных биологически активных веществ и последующее получение на основе этого структурного блока новых производных является ключевым направлением в создании новых органических соединений, обладающих необходимым профилем физико-химических характеристик и биологической активностью.
Так, например, соединения, содержащие в своем остове адамантановый фрагмент, проявляют самый широкий спектр биологической активности61,62. Широкая известность адамантановых противовирусных средств привлекает значительное внимание химиков-синтетиков в дизайне новых противовирусных агентов63. Авторами работы64 было показано, что взаимодействие 1- и 2- адамантиламинов (1, 2) с природными альдегидами – цитронеллалем, цитралем, (+) и (-)-миртеналем, с последующим восстановлением иминогруппы боргидридом натрия приводит к соответствующим вторичным аминам (3, 4 a-d) (схема 1). Наибольшую активность против вируса гриппа H1N1 проявили соединения (3а SI-21) и (4а SI-17).
Наряду с использованием адамантановых структурных блоков в синтезе новых противовирусных агентов, в современной литературе появляются работы, когда в качестве каркасного фрагмента применяется остов азаадамантанов. Так, диазаадамантаны, содержащие природный монотерпеновый фрагмент в различных частях каркасного фрагмента описаны в работе65 (схема 2). Показано, что только соединение (6d) проявляет выраженную активность против вируса гриппа (SI 30). Схема 2.
Моно-никотинат диола с пара-ментановым остовом (10) был получен на основе доступного (-)-вербенона (8) последовательным эпоксидированием, кислотно-катализируемым раскрытием эпоксида и взаимодействием диола (9) с хлорангидридом никотиновой кислоты (схема 3). Показано, что данное соединение проявляет активность против вируса гриппа H1N1, терапевтический индекс равен 17, при этом было установлено, что абсолютная конфигурация играет критическую роль. Изомерный никотинат, синтезированный из (+)-вербенона искомую активность не проявляет вовсе66. Взаимодействием диола (9) с ароматическими альдегидами получена библиотека из 22 соединений с гексагидро-2Н-хроменовым остовом. Авторами было показано, что при взаимодействии диола (9) с альдегидами в присутствии глины К10 идет образование продуктов, содержащих спиртовую группу, в то время как проведение той же реакции в среде эфирата трехфтористого бора приводит к фтор-замещенным продуктам. Все полученные вещества были протестированы в качестве ингибиторов вируса гриппа A H1N1, наибольшую активность проявили соединения (11, SI-26) и (12, SI-59), содержащие триметоксизамещенные ароматические фрагменты67. В целом, можно сказать, что метокси заместители в ароматическом фрагменте улучшают фармакологический профиль синтезированных соединений, в то время как галоген и нитро заместители существенно снижают активность.
Взаимодействие природного спирта изопулегола (13) с бромзамещенными тиофенкарбоксальдегидами, катализируемое глиной К10, приводит к образованию соединений с октагидро-2Н-хроменовым остовом (схема 4), среди которых только соединение (14) проявило значительную активность против вируса гриппа (SI 25)68.
Авторы следующих работ представленных в данном обзоре, соединили в дизайне своих целевых веществ как монотерпеновые фрагменты, так и природные кумариновые структурные блоки. Следует отметить, что кумарины, несомненно, можно назвать «привилегированными структурами», в связи с широким спектром противовирусной активности, характерным для природных и синтетических соединений, содержащих кумариновый фрагмент69,70. Эфиры (15 18), содержащие монотерпеновый и кумариновый фрагмент, были синтезированы взаимодействием галогентерпеноидов с соответствующими гидроксикумаринами71.
Наибольшую активность проявили соединения, содержащие фрагмент (+)-миртенола (16b SI 13), (-)-миртенола (17c SI 28, 18c SI 13) и (-)-нопола (15d SI 20, 17d SI 41). Авторами проведено подробное изучение связи структура-активность. Схема 5.
Синтез димерных производных камфоры
Как уже отмечалось при обзоре литературы, важным направлением функционализации природных соединений является получение симметричных молекул, имеющих в своём остове два природных фрагмента, связанные между собой линкерными разной длины и типа. Так, например, авторами работы250 получены димерные и тримерные производные артемизина, обладающие выраженными противоопухолевыми свойствами. Комплексы, включающие различные стероидные остовы, успешно исследовались в качестве аналогов ювенильных гормонов251. Стратегия димеризации природных молекул успешно реализуется в поиске ингибиторов ацетилхолинэстеразы. В качестве исходных природных объектов используются алкалоиды тарцин252 и галантамин, полученные на их основе бис-производные обладают высоким потенциалом в качестве препаратов для лечения болезни Альцгеймера. В данной работе были разработаны методы синтеза симметричных азотсодержащих производных на основе (+)-камфоры. В представленной работе термин «димерные соединения» используется для описания синтезированных агентов, имеющих два природных фрагмента и, строго говоря, не являющихся формально «димерными» продуктами. Для синтеза указанных соединений нами было использовано два синтетических подхода. Первый основан на прямом взаимодействии природного монотерпеноида с диаминами различного строения, второй включает в себя первоначальный синтез производных камфоры (иминоаминов или иминоспиртов) и дальнейшее взаимодействие последних с линкерами различного строения и природы.
Ключевой стадией в синтезе целевых соединений в первом использованном нами подходе является взаимодействие (+)-камфоры с диаминами различного строения. Так, нами было показано, что взаимодействие камфоры с 1,3-диаминопропаном, 1,3-диамин-2-гидрокси пропаном 1,6-диаминогексаном, 1,7-диаминогептаном, 1,8-диаминоктаном и 1,12 диаминододеканом в условиях азеотропной отгонки воды и в присутствии каталитических количеств BF3Et2O приводит к образованию соответствующих димерных оснований Шиффа (155-160) в качестве основных продуктов (схема 15). Степень конверсии контролировалась отбором проб и анализом с помощью ГЖХ, ХМС. Превращения идут достаточно медленно, при кипении в течение 16-30 часов. Установлено, что с удлинением алифатической цепочки линкера увеличивается время необходимое для получения целевых соединений. C целью изучения влияния жесткости и электронной структуры линкера на биологическую активность конечных продуктов, в качестве азотсодержащей компоненты нами были использованы ароматические диамины – 4,4 -метилендианилин и 4,4 -оксидианилин. Проведение реакций с ароматическими диаминами в условиях синтеза соединений (155-160) не привело к получению ожидаемых оснований Шиффа. Из литературных данных известно, что взаимодействие камфоры с ароматическими аминами в присутствии эквимолярного количества Si(OEt)4, используемого в качестве дегидратирующего агента, приводит к образованию соответствующих иминов238. Так, проведением реакции камфоры с 4,4 -метилендианилином и 4,4 -оксидианилином в данных условиях, нами были получены соответствующие симметричные основания бис-имины (161) и (162). Ввиду низкой реакционной способности ароматических аминов также были выделены аминоимины (163) и (164) (схема 14). Схема 14.
С целью выявления влияния наличия иминогруппы в описанных нами соединениях на проявление противовирусной активности, нами были получены соответствующие бис-аминные производные. Так, селективным восстановлением в разработанных нами условиях (NaBH4/NiCl2 при пониженной температуре) были получены экзо-,экзо-диамины, имеющие алифатические (165-167) и ароматические (168), (169) линкеры между каркасными структурными блоками. Алкилированием диметилсульфатом были получены бис-третичные амины (170) и (171) (схема 15). Следует отметить, что восстановление ароматических дииминов (161), (162) идет с низкой конверсией, во всех экспериментах наблюдаются продукты частичного восстановления. С целью увеличения выхода целевых диаминов нами был проведен поиск условий восстановления на примере имина (161). Было показано, что применение альтернативных восстановителей, таких, как LiAlH4/ТГФ, полиметилгидросилоксан (PMHS)/ZnCl2, также не приводит к полному восстановлению исходного диимина. Проведены эксперименты по восстановлению соединения (161) водородом в проточном реакторе H-cube (ThalesNano), варьируя тип катализатора (Ni-Re, 10% Pd/C), температуру и давление. Однако полной конверсии исходного продукта также достичь не удалось. Максимальная конверсия (16%) достигалась при использовании никеля Ренея в качестве катализатора. Высокая конверсия реакции восстановления ароматического диимина (161) (70%) наблюдалась при использовании в качестве восстановительной системы комплекса пролина с дибораном, сгенерированным in situ с помощью NaBH4/I2253. Однако восстановление проходило не стереоселективно, по данным спектров ЯМР образовывалась смесь стереоизомеров. В результате, подобранная ранее методика (NaBH4/NiCl2), является наиболее эффективной и стереоселективной для восстановления ароматических дииминов на основе (+)-камфоры.
Известно, что симметричные соединения, имеющие в своем остове два заряженных атома азота, разделенные линкерами разной длины, обладают разнообразной биологической активностью254. Наиболее широкое распространение такие вещества получили в качестве миорелаксантов255 и антималярийных агентов256. Для синтеза димерных производных (172-178) нами были проведены реакции иминоамина (137) с дигалогенидами различного строения (схема 16).
Противовирусная активность иминопроизводных (+)-камфоры
Значительное внимание при выполнении данной работы было уделено синтезу и изучению активности против вирусов гриппа производных (+)-камфоры. Как уже было упомянуто выше, проводить изучение связи структуры синтезированных соединений с проявляемой ими активностью важно в рамках структурно подобных классов. В связи с этим, данный анализ проводится по группам описанных в данной работе соединений.
Активность соединений (119-129) была изучена нами в отношении двух штаммов вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09 (Cal) и A/Puerto Rico/8/34 (PR). Среди алифатических иминов на основе камфоры подавляющее количество соединений проявляет вирусингибирующую активность в концентрациях от 1.4 до 30 мкмоль, в отличие от исходной камфоры. В тоже время, цитотоксичность изученных нами соединений меняется значительно. Показано, что увеличение длины алифатической цепочки в общем случае, приводит к увеличению токсичности соединения. Шесть из 11 синтезированных веществ проявляют противовирусную активность выше, чем препараты сравнения, при этом два из них, имины камфоры с пропильным (119) и бутильным (120) алифатическим фрагментом, проявляют особенно высокую вирусингибирующую активность при низкой цитотоксичности (рис. 79). Можно считать, что данные соединения заслуживают особого внимания и являются соединениями-лидерами в данном классе веществ. Из пары соединений, содержащих циклический насыщенный фрагмент, вещество с циклопропильным заместителем не проявило активности вовсе, а соединение (129) с циклогексильным фрагментом имеет выраженную активность особенно в отношении штамма A/Puerto Rico/8/34. Рисунок 79.
Соединения, синтез которых описан на схемах 12 и 19 - агенты, имеющие в своем остове борнановый остов, иминогруппу и дополнительный кислородсодержащий фрагмент -спиртовую (130-132), простую эфирную (133), (183) или сложноэфирную (184), (185) группу протестированы нами в отношении штамма вируса гриппа A/California/07/09 (HlNl)pdm09. Среди данных соединений особое внимание заслуживают иминоспирты (130-132). Наибольшую активность при минимальной токсичности проявил продукт взаимодействия (+)-камфоры и аминоэтанола - соединение (130) (рис. 80). Индекс селективности данного соединения более 500 и превышает таковой у препаратов сравнения каркасного типа в сто и более раз. Высокую активность также проявили агенты, в которых спиртовая группа отделена от борнанового остова более длинной, чем у соединения (130) алифатической цепочкой. Так, индекс селективности соединений (131) и (132) составляет 357 и 113 соответственно. Вещества, содержащие эфирные терминальные фрагменты (183) и (133) также могут рассматриваться как перспективные противовирусные агенты.
Важным моментом, на наш взгляд, является тот факт, что соединения, в которых нами была проведена химическая модификация иминогруппы, становятся либо менее активными в отношении данных вирусов, либо просто нестабильными при хранении, что значительно затрудняет исследование биологической активности. Так, в связи с высокой лабильностью, протестировать активность спиро-оксазаридинов (187) и (188) не предоставляется возможным. Активность аминоспирта (140) значительно ниже таковой чем у соединения (130), аминоспирты (141-142) проявляют достаточно высокую активность, однако токсичность указанных соединений превосходит таковую у невосстановленных иминов (131-132) (рис. 81).
Среди синтезированных нами иминов камфоры, содержащих первичную (134) и вторичную аминогруппу (135-138) (схема 12), наибольшую вирусингибирующую активность и низкую токсичность проявили агенты (136) и (137) (рис. 82). Иминоамин (134) является высокоэффективным ингибитором указанного штамма вируса гриппа, однако его токсичность также достаточно высока, что соответственно значительно снижает терапевтический индекс этого соединения. Увеличение длины алифатических заместителей у третичного атома азота повышает токсичность агентов (137) и (138). Рисунок 82.
Далее нами была изучена связь структуры иминопроизводных камфоры, содержащих насыщенный N-гетероцикл, с проявляемой активностью против вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34. Было показано, что наибольшую вирусингибирующую активность проявили соединения (189) и (139), содержащие пирролидиновый и морфолиновый фрагмент (рис. 83). Значительную активность, превышающую препарат сравнения, проявили также соединения (190), (191), (193) и (194). Сравнение биологической активности соединений (190) и(191) показывает, что 4-метил замещенные пиперидиновые производные оказались более токсичными в наших экспериментах. Также можно видеть, что N-этил пиперазиновый фрагмент как увеличивает токсичность, так и снижает активность по сравнению с аналогичным соединением (194). Соединение (192), имеющее спиртовую группу в 4 положении пиперидинового кольца, является нетоксичным и не проявляет вирусингибирующих свойств.
Далее рассмотрим активность в отношении вирусов гриппа соединений, содержащих иминный фрагмент, борнановый остов и ароматическое/гетероароматическое кольцо. Синтезированные нами соединения из этого класса формально можно разделить на три группы: агенты, полученные взаимодействием камфоры с первичными аминами, имеющими ароматическое кольцо (схема 13); соединения, в которых гетероароматический фрагмент разделен от природного остова атомом серы через алифатический линкер (схема 21) и вещества, содержащие 1,2,3-триазольный цикл, полученные с использованием методов «клик химии» (схемы 22, 23).
Описанное ранее в литературе соединение – продукт взаимодействия камфоры и анилина (143) не проявляет противовирусной активности, также как и его дифторзамещенные аналоги (144) и (145). Пара- и орто-гидрокси-замещенные аналоги (146) и (147) проявляют выраженную активность, однако являются достаточно токсичными агентами (рис. 84). Введение в молекулу бензтиазольного фрагмента также понижает противовирусную активность соединения (148). Продукт взаимодействия (+)-камфоры и 2-пиколиламина агент (150), в отличие от соединения (149), не содержащего ароматический азот, проявляет высокую активность наряду с низкой токсичностью. Наиболее высокий показатель противовирусной активности обнаружен нами у соединения (151) являющегося продуктом взаимодействия исходного монотерпена и 4-метоксибензиламина. Также, крайне высокая активность наряду с низкой токсичностью была нами обнаружена у соединения (154), содержащего две метокси-группы в ароматическом кольце. Важно, что структурно подобные соединения (149) и (153), не имеющие метоксизаместителей в ароматическим кольце проявляют лишь незначительную противовирусную активность. Агент (152), имеющий дифенилметильный фрагмент является и токсичным и не активным. Рисунок 84.
Среди синтезированных нами соединений, содержащих гетероароматический фрагмент, соединенный через атом серы с природным камфорным остовом (схема 21), в серии сульфидов несущих бензооксазольный (197), бензотиазольный (198) и бензоимидазольный фрагмент (199) наблюдалось понижение токсичности значений CС50 от 99 до 404 мкмоль. В целом, соединения проявляют активность против вируса гриппа с терапевтическим индексом 20 (рис. 85). Среди пятичленных гетероциклических производных только соединение (200) с 4,5-дигидротиазол-2-тиоловым кольцом обладает умеренно высоким значением SI в связи с низкой токсичностью и выраженной противовирусной активностью. Высокую активность проявили агенты, содержащие пиридиновый (203) и пиримидиновый ароматический гетероцикл (204). Следует отметить, что замещение фрагмента пиридин-2-тиола на пиримидин-2-тиольный радикал в соединении (204) значительно уменьшает токсичность, в то время как противовирусная активность сохраняется на высоком уровне. Рисунок 85.
Изучение влияния камфецина на морфофункциональные характеристики почки крыс
Лекарственные соединения, попадая в организм, могут подвергаться метаболизму (как правило, в печени), а затем выводятся из организма. Почки осуществляют как метаболизм, так и экскрецию чужеродных для организма соединений, к которым относятся и противовирусные препараты. Почки млекопитающих выполняют широкий спектр функций, включающих ультрафильтрацию крови, сохранение объема жидкости, концентрации электролитов, поддержание кислотно-основного баланса, регулирование кровяного давления. Поддержание водно-солевого гомеостаза осуществляется посредством экскреции воды и неорганических солей в количествах, необходимых для поддержания их баланса в организме и концентрации во внеклеточной жидкости. Кроме гомеостатической функции, почками осуществляется экскреция конечных продуктов обмена: мочевины, образованной из белка; креатинина, конечных продуктов распада гемоглобина и др.. Важной функцией почки является выделение с мочой посторонних для организма веществ, таких как лекарственные препараты и различные вредные агенты446. Целью представленного раздела является изучение влияния камфецина на морфофункциональные характеристики почек животных.
Модель эксперимента
Эксперименты проводили на половозрелых крысах линии WAG (Wistar Albino Glaxo). Для работы использовались крысы из вивария ИЦиГ СО РАН. Работы выполняли с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.
Введение препаратов осуществляли внутрижелудочно, 1 раз в сутки. В качестве растворителя для препаратов использовали 1 каплю раствора твин-80, общий раствор доводили до объема 1 мл физиологическим раствором.
В ходе эксперимента животные (n=17) были разделены на три группы:
контрольные (n=5): введение физиологического раствора в течение 7 суток;
опытные животные (n=12):
WAG (п=6): введение камфецина в дозировке 100мг/кг массы тела в течение 7 суток.
WAG (п=6): введение ремантадина в дозировке 100мг/кг массы тела в течение 7 суток.
Нами было показно, что введение камфецина (KF) и препарата сравнения ремантадина (RT) приводит к достоверному уменьшению уровня диуреза (р 0,05 и р 0,01, рис. 158А), что может быть связано с активацией вазопрессина, который стимулирует увеличение проницаемости эпителия собирательных трубок для осмотически свободной воды и тем самым снижает диурез447.
Поскольку образование мочи начинается с клубочковой фильтрации, т.е. переноса жидкости от гломеруллярных капилляров в боуменову капсулу448, представляло интерес исследовать скорость клубочковой фильтрации. В ходе эксперимента не выявлено достоверных отличий влияния камфецина и ремантадина на скорость клубочковой фильтрации по сравнению с контрольной группой (рис. 158Б), что может указывать на отсутствие негативного влияния соединений на процесс ультрафильтрации в почке. Рисунок 158.
Для оценки концентрационной функции почек была предпринята серия экспериментов, показывающих, что введение камфецина и ремантадина не оказали достоверного влияния на степень осмотического концентрирования мочи (табл. 15). Действие камфецина и ремантадина не оказывает достоверного влияния на осмоляльность плазмы крови (табл. 15), что указывает на отсутствие эффекта исследованных соединений на водно–солевой баланс плазмы крови и согласуется с данными литературы об уровне осмоляльности плазмы крови для экспериментальных животных449. Таблица 15.
Изучение содержания мочевины в различных функциональных зонах почки выявило определенные закономерности (табл. 16). Нарастание содержания мочевины наблюдается от коры по направлению к внутреннему мозговому веществу. В условиях введения противовирусных соединений отмечается накопление мочевины в корковом веществе почки по сравнению с контрольной группой (p 0,05), что, возможно, связано с интенсификацией экскреторной функции почек, так как мочевина является конечным продуктом белкового обмена. При этом не обнаружено достоверного влияния исследуемых соединений на содержание мочевины в наружном мозговом веществе и внутреннем мозговом веществе почки.
Поскольку мозговое вещество содержит элементы концентрирующего механизма, а мочевина в интерстициальном пространстве мозгового вещества важна для создания осмотического градиента для реабсорбции воды450, то полученные результаты содержания мочевины согласуются с отсутствием изменения осмоляльности экскретируемой мочи.
Изучение распределения катионов натрия по разным функциональным зонам почки
Катионы натрия являются осмотически активными ионами и вносят значительный вклад в работу противоточно–поворотной множительной системы, влияя тем самым на процесс осмотического концентрирования451.
Не выявлено достоверных отличий в условиях введения камфецина и ремантадина на содержание натрия в коре почки (табл. 17). Изучение содержания натрия в наружном мозговом веществе почки выявило достоверное снижение количества натрия в группе введения ремантадина (р 0,05) по сравнению с контролем и группой введения камфецина, что согласуется с данными об на увеличении экскреции натрия с мочой. Введение камфецина и ремантадина не оказывает достоверного влияния на содержание натрия во внутреннем мозговом веществе почки по сравнению с контрольной группой. Таблица 17
Таким образом, выявленные особенности могут указывать на способность камфецина активировать каналы ENaC в дистальных отделах нефрона и собирательной трубке452. Накопление катионов натрия является следствием активации реабсорбции и согласуется с полученными данными о снижении диуреза.
Изучение распределения катионов калия по разным функциональным зонам почки.
Влияния введения камфецина и ремантадина на содержание калия в корковом веществе почки не выявлено (табл. 18). Введение камфецина и ремантадина достоверно не повлияло на уровень содержания калия в наружном мозговом веществе. Накопление калия во внутреннем мозговом веществе почки достоверно увеличилось в условиях введения камфецина (р 0,05) и ремантадина (р 0,05) по сравнению с контрольной группой животных, что может указывать на снижение уровня секреции калия собирательными трубками. Таблица 18.
При изучении содержания и распределения осмотически активных веществ в различных зонах почки экспериментальных животных возникает необходимость проанализировать содержание воды в почечной ткани. Данный показатель широко варьирует в зависимости от физиологического статуса организма и может быть полезен в понимании процессов осмотического концентрирования. В таблице 19 представлены результаты содержания воды в зонах почечной ткани, вычисленные как разность массы образца ткани, только что извлеченной из почки, и массы этого же образца, доведенного до постоянного веса выдерживанием в термостате в течение 24 часов при температуре 95±5 С.
В условиях введения ремантадина (p 0,001) увеличился показатель обводненности в корковом веществе почки и в наружном мозговом веществе (p 0,01, табл. 19). При введении камфецина достоверно увеличился показатель в наружном мозговом веществе почки и наблюдается тенденция к увеличению в коре и во внутреннем мозговом веществе. Исследование однофакторного дисперсионного анализа выявило наличие достоверного влияния введения камфецина и ремантадина на уровень обводненности коры почки и наружного мозгового вещества по сравнению с контрольной группой. Не выявлено достоверное влияние введения противовирусных соединений на обводненность внутреннего мозгового вещества по сравнению с контрольной группой. Таблица 19.